Name: obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds by a modified method for gene expression profiling
Uploaded: 2020-05-21T13:00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل في إطار المجال المواضيعي للمجموعة الاستشارية للبحوث الزراعية في مجال الأغذية الزراعية من أجل الأغذية CRP، والأرز، والأرز المتسامح مع الإجهاد لأفريقيا وجنوب آسيا، والمرحلة الثالثة من البرنامج، والمركز المتعدد التخصصات لبحوث نباتات المحاصيل، هالي (سال)، ألمانيا. نشكر ماندي بوفيلد على مساعدتها التقنية الممتازة والدكتورة إيزابيل ماريا مورا راميريز على تبادل المعلومات والخبرات مع رقاقة القمح. نشكر الدكتورة روندا ماير (RG Heterosis, IPK Gatersleben, ألمانيا) على تعليقاتها وقراءتها النقدية للمخطوطة.

<ol>
	<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+intact-tissue+sequencing+of+single-cell+transcriptional+states.">Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li><li>P&#252;ffeld, M., Seiler, C., Kuhlmann, M., Sreenivasulu, N., Butardo, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Developing+Rice+Grain+Transcriptome+Using+the+Agilent+Microarray+Platform.">Analysis of Developing Rice Grain Transcriptome Using the Agilent Microarray Platform.</a> Methods in Molecular Biology. 1892, 277-300 (2019).</li><li>Martin, L., Fei, Z., Giovannoni, J., Rose, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalyzing+plant+science+research+with+RNA-seq.">Catalyzing plant science research with RNA-seq.</a> Frontiers in Plant Science. 4 (66), (2013).</li><li>Hrdlickova, R., Toloue, M., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+methods+for+transcriptome+analysis.">RNA-Seq methods for transcriptome analysis.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).</li><li>Radchuk, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+profiling+of+starch+biosynthesis+and+degradation+in+the+developing+barley+grain.">Spatiotemporal profiling of starch biosynthesis and degradation in the developing barley grain.</a> Plant Physiology. 150 (1), 190-204 (2009).</li><li>Sreenivasulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+of+seeds:+deciphering+the+molecular+mechanisms+of+seed+storage,+dormancy+and+onset+of+germination.">Systems biology of seeds: deciphering the molecular mechanisms of seed storage, dormancy and onset of germination.</a> Plant Cell Reports. 36 (5), 633-635 (2017).</li><li>Sreenivasulu, N., Wobus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed-development+programs:+a+systems+biology-based+comparison+between+dicots+and+monocots.">Seed-development programs: a systems biology-based comparison between dicots and monocots.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 189-217 (2013).</li><li>Butardo, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+Genetics+Identifies+a+Novel+Regulatory+Domain+of+Amylose+Synthesis.">Systems Genetics Identifies a Novel Regulatory Domain of Amylose Synthesis.</a> Plant Physiology. 173 (1), 887-906 (2017).</li><li>de Guzman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+glycemic+potential+of+rice+by+unraveling+compositional+variations+in+mature+grain+and+starch+mobilization+patterns+during+seed+germination.">Investigating glycemic potential of rice by unraveling compositional variations in mature grain and starch mobilization patterns during seed germination.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5854 (2017).</li><li>Sreenivasulu, N., Sunkar, R., Wobus, U., Strickert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+platforms+and+bioinformatics+tools+for+the+analysis+of+plant+transcriptome+in+response+to+abiotic+stress.">Array platforms and bioinformatics tools for the analysis of plant transcriptome in response to abiotic stress.</a> Methods in Molecular Biology. 639, 71-93 (2010).</li><li>Anacleto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+a+genome-wide+association+study+with+a+large-scale+transcriptome+analysis+to+predict+genetic+regions+influencing+the+glycaemic+index+and+texture+in+rice.">Integrating a genome-wide association study with a large-scale transcriptome analysis to predict genetic regions influencing the glycaemic index and texture in rice.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2018).</li><li>Pietsch, C., Sreenivasulu, N., Wobus, U., Roder, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+mapping+of+putative+regulator+genes+of+barley+grain+development+characterized+by+expression+profiling.">Linkage mapping of putative regulator genes of barley grain development characterized by expression profiling.</a> BMC Plant Biology. 9, 4 (2009).</li><li>Druka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+gene+expression+from+seed+to+seed+through+barley+development.">An atlas of gene expression from seed to seed through barley development.</a> Functional &amp; Integrative Genomics. 6 (3), 202-211 (2006).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+Expression+Atlas+In+Reproductive+Development.">Rice Expression Atlas In Reproductive Development.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (12), 2060-2081 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+gene+expression+atlas+covering+the+entire+life+cycle+of+rice.">A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice.</a> The Plant Journal. 61 (5), 752-766 (2010).</li><li>Yamakawa, H., Hakata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+rice+grain+filling-related+metabolism+under+high+temperature:+Joint+analysis+of+metabolome+and+transcriptome+demonstrated+inhibition+of+starch+accumulation+and+induction+of+amino+acid+accumulation.">Atlas of rice grain filling-related metabolism under high temperature: Joint analysis of metabolome and transcriptome demonstrated inhibition of starch accumulation and induction of amino acid accumulation.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (5), 795-809 (2010).</li><li>Shakoor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sorghum+bicolor+expression+atlas+reveals+dynamic+genotype-specific+expression+profiles+for+vegetative+tissues+of+grain,+sweet+and+bioenergy+sorghums.">A Sorghum bicolor expression atlas reveals dynamic genotype-specific expression profiles for vegetative tissues of grain, sweet and bioenergy sorghums.</a> BMC Plant Biology. 14, 35 (2014).</li><li>Yu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+reveals+key+differentially+expressed+genes+involved+in+wheat+grain+development.">Transcriptome analysis reveals key differentially expressed genes involved in wheat grain development.</a> Crop Journal. 4 (2), 92-106 (2016).</li><li>Kochevenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+QTL+hot+spots+for+malting+quality+in+two+elite+breeding+lines+with+distinct+tolerance+to+abiotic+stress.">Identification of QTL hot spots for malting quality in two elite breeding lines with distinct tolerance to abiotic stress.</a> BMC Plant Biology. 18 (1), 106 (2018).</li></ol>

وليس لدى أصحاب البلاغ مصالح مالية متنافسة.

توفر الطريقة الموصوفة نتائج قابلة للتكرار للغاية لمستخلصات الحمض النووي الريبي عالية الغلة وعالية الجودة(الشكل 1). بناء على خبرتنا، نوصي بثلاث نسخ بيولوجية لنمط جينوواحد أو مرحلة أو شرط للتحليل. لتكون قادرة على الكشف عن الاختلافات ذات مغزى إحصائيا، يجب النظر في وفرة عامة من مرنا. ومع ذلك، يرجى ملاحظة أن كمية تبدأ من 200 عينات من أنسجة ملغ مطلوبة في ثلاثية العينات لخطوة استخراج الحمض النووي الريبي. وبالتالي، بالنسبة للتجارب التي تحتوي على كمية محدودة من العينات مثل المواد النباتية المعدلة وراثيا، قد لا تكون هذه الطريقة مناسبة.
أثناء التهجين الجزئي، الخطوات التالية هي الأكثر أهمية: (1) تحميل العينات إلى شريحة طوقا (الخطوة 4.7) و (2) غسل الصفائف بعد التهجين (الخطوتان 4.13 و 4.14). تحميل عينة يحتاج إلى القيام به بعناية فائقة لتجنب تشكيل فقاعة وتسرب السائل. الحذر ضروري عند وضع شريحة microarray على شريحة طوقا التي تحتوي على العينات المحملة: يجب أن يواجه جانب الحمض النووي (مع المسابير المرقطة) لأسفل للسماح بالتهجين. لغسل الفوضى الدقيقة ، فإن خطوة الغسيل الثانية أمر بالغ الأهمية : هنا ، يجب إجراء إزالة الشرائح من الغسيل المؤقت 2 ببطء شديد (10 ثوان) لتجنب القطع الأثرية العازلة على الشرائح ، والتي يمكن أن تتداخل مع الحصول على البيانات والتحليلات.
وبغية الحصول على نتائج من تجربة التهجين المؤهلة لتحليل المعلوماتية البيولوجية في المصب، ينبغي اتباع بعض المعايير الهامة. تقرير مراقبة الجودة، الذي يتم إنشاؤه بعد أداء البروتوكول أعلاه، يعطي فكرة جيدة عما ينبغي تحسينه، والبيانات التي هي في حالة قابلة للاستخدام(الشكل 3). المعلومات الأولى الواردة هي الشبكة المتخيلة(الشكل 2). هنا ، يمكن للمرء أن يرى مباشرة ما إذا كانت جميع المناطق لقراءة الفلورسين ستتماشى بشكل صحيح. إذا كان هناك تحول يمكن الكشف عنه بصرياً، سيؤثر هذا على جميع القيم الأخرى (الخلفية، شدة الإشارة، إلخ) ولا يمكن استخدام قراءة هذه الشريحة. على نظرة عامة (التوزيع المكاني لجميع القيم المتطرفة)، يمكن للمرء بسهولة بقعة أي تلوث (مثل الغبار أو الشعر)، والتي أثرت على النتيجة. يمكن إزالة الأوساخ عن طريق تهب بهدوء وrescanning رقاقة. يجب أن يؤدي الرسم البياني لمؤامرة الإشارة كما ذكر أعلاه إلى منحنى واسع على شكل غاوس ، مع القيم المتطرفة الصغيرة فقط(الشكل 2). اعتمادا على الأنسجة التي تم تحليلها(الشكل 1)، يمكن أن يبدو هذا المنحنى مختلفًا ويمكن أن يبدو أن له قمتين ، أو قمة سائدة واحدة مع الكتف. وهذا لن يؤثر على نوعية البيانات. فقط ذروة تحول قوية، أو إشارات عالية على حواف تشير إلى مشاكل، مثل "الوحوش الخضراء" (كثافة الفلورسان عالية جدا)، والتي لا يمكن إزالتها عن طريق الغسيل وينبغي الإبلاغ عنها إلى الشركة المصنعة رقاقة. كما ينبغي أن يختلف "الرسم البياني للتوزيع المكاني للإشارات الوسيطة" حول قيمة مشتركة. وينبغي أن يكون هذا في نطاق بين 40 و 100، اعتمادا على قراءة كثافة عامة من رقاقة تحليلها. مراقبة نوعية هامة أخرى هي تقييم الارتفاع في البيانات: يجب أن يؤدي الرسم البياني للإشارة إلى خط خطي ومنتظم. وأخيرا، فإن جدول "مقاييس التقييم" يعطي رؤية جيدة وموثوقة للنتائج الواردة. هنا الشركة المصنعة يوفر مجموعة من القيم التي يمكن تصنيفها على أنها ممتازة، جيدة وتقييم(الشكل 3). وفقا لتجربتنا، لا يمكن دائما تطبيق بعض القيم لجميع رقائق. بالنسبة لرقائق الأرز المخصصة، كانت "قيمة عدم التحكم" في كثير من الأحيان خارج النطاق ولكنها لا تؤثر بشكل كبير على معالجة البيانات الإضافية. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتم توسيع نطاق "NegControl" ، استنادًا إلى الأنسجة والكائنات الحية والإخراج العام للرقاقة إلى <80. قد يتم توسيع نطاق التقييم لقيمة E1 Med CV إلى < 9 ، بدلاً من < 8 وفقًا لتجربتنا. بعد ذلك ، من الممكن إجراء تقييم مناسب لجميع البيانات التي تُقرأ. بشكل عام ، يجب على المرء أن يضع في اعتبارك دائمًا أن النسخ البيولوجي المستقل يعطي دائمًا النتيجة الأكثر موثوقية.
وتكمن ميزة هذه التقنية مقارنة بأساليب أخرى في حقيقة أنها تمثل طريقة فعالة من حيث التكلفة وعالية الإنتاجية للتنميط النسخي. وعلاوة على ذلك، فإن خط أنابيب تحليل البيانات في المصب أسهل وأكثر تحديدًا. على الرغم من المزايا ، هناك بعض القيود على هذه التقنية ، مثل عدد الجينات التي يمكن تحليلها. يمكن للميكرورفير فقط تسهيل تحليل الجينات التي رصدت سابقا تحقيقات على الصفيف. ولذلك، فإن هذه التقنية لا تنطبق إلا على الأنواع النباتية ذات الجينوم المتسلسل والجينات المشروحة بالكامل. ونحن نتصور أن النسخ القائمة على الصفيفات الصغيرة ستظل مفيدة جدا وذات صلة ليس فقط لتنميط التعبير الجيني ولكن أيضا لخطوط أنابيب المعلوماتية الحيوية الأخرى في المصب مثل تحليلات الشبكة التنظيمية الجينية ودراسة الارتباط على نطاق النسخ.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/60602/obtaining-high-quality-transcriptome-data-from-cereal-seeds-modified">Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling</a>. Two&#160;author&#160;names were&#160;updated.
The&#160;names were&#160;corrected from:
Christianne&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreeenivasulu
to:
Christiane&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreenivasulu

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/60602/obtaining-high-quality-transcriptome-data-from-cereal-seeds-modified">Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling</a>. Two&#160;author&#160;names were&#160;updated.

Erratum: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

يمثل النسخ مجموعة كاملة من النصوص الحمض النووي الريبي (RNA) التي أعرب عنها جينوم كائن حي في وقت معين وخاصة الظروف البيئية والنمو. كل خلية لها transcriptome الفردية، والتي تعكس حالتها الفسيولوجية والأيضية الحالية. يتم استخدام مجموعة من الخلايا المشتقة من نسيج أو عضو مماثل في دراسة النسخ النموذجية ، ولكن الخلايا المفردة والخلايا المصممة مكانًا هي الحصول على شعبية1. تبدأ التحليلات الكجنية باستخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من نسيج محدد في نقطة زمنية محددة ، وفي ظروف نمو محددة. لهذا الغرض، ونحن نوصي باستخدام طريقة وضعت حديثا لاستخراج الحمض النووي الريبي الكلي من عينات عالية في محتوى النشا أو السكر، مثل بذور الحبوب2. المقارنة بين النسخ بين عينات مختلفة النتائج في تحديد جزيئات الحمض النووي الريبي مع وفرة مختلفة. وتعتبر هذه الجزيئات الحمض النووي الريبي الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي (DEGs). ويمكن بعد ذلك استخدام وفرة النصوص المستمدة من جينات علامات محددة لتقدير الحالة الإنمائية أو تحديد استجابة الكائن الحي للتقلبات البيئية. الجينات مع عدم وجود تغييرات يمكن الكشف عنها في وفرة النص عبر النقاط الزمنية التنموية قيد الدراسة وغالبا ما تستخدم كمرجع أو جينات التدبير المنزلي.
يتم الكشف عن الحمض النووي الريبي عادة وكميا من قبل أساليب مختلفة، مثل النشاف الشمالي وكمية عكس البلياز تفاعل البوليميراز (qRT-PCR)، ولكن الأساليب الحالية النسخ عالية الإنتاجية تعتمد بشكل كبير على التهجين الحمض النووي باستخدام تكنولوجيا microarray فضلا عن تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-Seq). RNA-Seq تحظى بشعبية كبيرة في الوقت الحاضر لأنه يوفر العديد من المزايا لتطبيقات النسخ عالية الإنتاجية كما استعرضت في مكان آخر3,4. على الرغم من أن التكنولوجيا القديمة ، والتنميط التعبير الجيني باستخدام رقائق microarray لا تزال تستخدم على نطاق واسع لأنها تكنولوجيا أكثر راسخة ، والتي تتطلب أقل من خلفية في المعلوماتية الحيوية. بالمقارنة مع RNA-Seq ، فإن مجموعات البيانات الناتجة عن تجارب microarray أصغر وأسهل في التحليل. وبالإضافة إلى ذلك، فمن أكثر فعالية من حيث التكلفة، وخاصة إذا كان التعامل مع أعداد كبيرة من العينة. في مختبرنا، نستخدم بشكل روتيني التحليلات النسخة باستخدام تكنولوجيا microarray لتحديد دور المحاور التنظيمية المركزية التي تحكم الشبكات الجزيئية والمسارات المشاركة في نمو وتطوير واستقلاب الحبوب5،6،7،8،9. كما نستخدمها بشكل روتيني لإجراء دراسات توصيف التعبير الجيني على نطاق الجينوم للحصول على فهم ميكانيكي لاستجابة حبوب الحبوب للضغوط اللاأحيائية10، وكذلك في إجراء الارتباط على نطاق النسخ (TWAS) ودراسات رسم خرائط الروابط لتحديد الجينات المسؤولة عن جودة الحبوب الحبوب والتغذية11،12. كما استخدمت مجموعات أخرى تكنولوجيا الصفيف الصغير في توفير أطلس التعبير الجيني الخاص بالتنمية في الشعير13والأرز14و15,,و16والذرة الرفيعة17والقمح18.
الغرض من هذا المنشور هو تقديم ملخص نصي موجز ووصف مرئي مفصل للطريقة التي نستخدمها حاليًا في مختبرنا للتنميط النسخي لحبوب الحبوب باستخدام منصة Agilent microarray. يرجى ملاحظة أن منصات microarray الأخرى متوفرة، ولكن لن يتم تغطيتها في هذه الطريقة. نبدأ البروتوكول من خلال تقديم وصف مفصل لاستخراج الحمض النووي الريبي من تطوير أو إنبات بذور الحبوب. استنادا إلى تجربتنا، والحصول على نسخة عالية الجودة وكمية عالية قابلة لتحليلات النسخ المصب غالبا ما يكون عنق الزجاجة عند استخدام أنسجة بذور الحبوب. لقد جربنا العديد من مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي المتاحة تجاريًا ، ولكن لم يقدم أي منها نتائج مرضية. ومن ثم، قمنا بتطوير بروتوكول استخراج كيميائي للحصول على مستخلص الحمض النووي الريبي الخام الذي يخضع بعد ذلك لتنقية الأعمدة باستخدام مجموعة متاحة تجاريا. باستخدام هذه الطريقة، ونحن بشكل روتيني واستنساخ الحصول على جودة عالية الحمض النووي الريبي2 (الشكل 1)،والتي يمكن استخدامها لتطبيقات المصب مختلفة لتوليد ملف تعريف transcriptome.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td>Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>To determine quality and quantity of RNA extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crushed ice maker</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>To keep samples on ice during sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar flask</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>Used as liquid nitrogen container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Hybridization Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5242</td>
			<td>Kit components: 
			2X Hi-RPM Hybridization Buffer 
			25X Fragmentation Buffer 
			10X Gene Expression Blocking Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Wash buffer Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5325</td>
			<td>Kit components: 
			Gene Expression Wash Buffer 1 
			Gene Expression Wash Buffer 2 
			Triton X-102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2545A</td>
			<td>Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization gasket slide kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534-60014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQAir air cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9866.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free paper, Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>KC34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Input Quick Amp Labeling Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-2305</td>
			<td>Kit components: 
			T7 Primer 
			5x First Strand Buffer 
			0.1M DTT 
			10 mM dNTP Mix 
			AffinityScript RNAse Block Mix 
			5x Transcription Buffer 
			NTP Mix 
			T7 RNA Polymerase Blend 
			Nuclease-free water 
			Cyanine 3-CTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spatula, small</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes, nuclease-free</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>2.0 mL and 1.5 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td>It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110-230V</td>
			<td>Any small incubator will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and pestle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td>Peqlab / Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>351900302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-Color RNA Spike-In Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5188-5282</td>
			<td>Kit components: 
			One color RNA Spike-Mix 
			Dilution Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ozone barrier slide cover kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2505-60550</td>
			<td>Optional but highly recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube, 0.2 mL, RNase-free</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>Z376426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A156.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, nuclease free, filter tips</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor set</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Extraction Buffer</td>
			<td>10 mM Tri-HCl pH 8.0 
			150 mM LiCl 
			50 mM EDTA 
			1.5% EDTA 
			15 ul/mL &#946;-mercaptoethanol</td>
			<td></td>
			<td>We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add &#946;-mercaptoethanol fresh daily</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Kit components: 
			RNeasy mini spin column (pink) 
			1.5 ml collection tubes 
			2 ml collection tubes 
			Buffer RLT 
			Buffer RW 
			Buffer RPE 
			Nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74904</td>
			<td>Kit components: 
			RNeasy mini spin column (pink) 
			QIAshredder spin column (purple) 
			1.5 ml collection tubes 
			2 ml collection tubes 
			Buffer RLT 
			Buffer RLC 
			Buffer RW1 
			Buffer RPE 
			Nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide holders for DNA microarray scanner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2505-60525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide staining dish with removable rack</td>
			<td>DWK Life Sciences 900200</td>
			<td>Fisher Scientific 08-812</td>
			<td>We recommend DWK Life Sciences Wheaton&#8482; Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultralow temperature freezer</td>
			<td>Various brand</td>
			<td></td>
			<td>Capable of storing sample at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds by a modified method for gene expression profiling

يعتمد توصيف التعبير الجيني على جودة الحمض النووي الريبي. في الإنبات، وبذور الحبوب النامية والناضجة، وغالبا ما يعوق استخراج الحمض النووي الريبي عالية الجودة من قبل ارتفاع محتوى النشا والسكر. يمكن لهذه المركبات تقليل كل من العائد وجودة الحمض النووي الريبي الكلي المستخرج. ويمكن أن يكون للتدهور في كمية ونوعية مجموع الحمض النووي الريبي أثر كبير في وقت لاحق على التحليلات الالنسخية في المصب، التي قد لا تعكس بدقة التباين المكاني و/أو الزمني في ملف التعبير الجيني للعينات التي يجري اختبارها. في هذا البروتوكول، ونحن نصف طريقة الأمثل لاستخراج الحمض النووي الريبي الكلي مع كمية كافية ونوعية لاستخدامها في تحليل النسخ الكامل من الحبوب. الطريقة الموصوفة مناسبة للعديد من تطبيقات المصب المستخدمة في التنميط النسخي للبذور الحبوب النامية والإنبات والناضجة. يتم عرض طريقة التنميط transcriptome باستخدام منصة microarray. تم تصميم هذه الطريقة خصيصا لتنميط التعبير الجيني للحبوب مع تسلسل الجينوم الموصوفة. يتم وصف الإجراء التفصيلي من معالجة microarray إلى مراقبة الجودة النهائية. وهذا يشمل تركيب cDNA ، cRNA الوسم ، التهجين microarray ، مسح الشرائح ، استخراج الميزات ، والتحقق من جودة البيانات. يمكن استخدام البيانات الناتجة عن هذه الطريقة لتوصيف النسخ من الحبوب أثناء الإنبات ، في مراحل مختلفة من تطور الحبوب ، أو في ظروف الإجهاد الحيوي أو اللاأحيائي المختلفة. النتائج المعروضة هنا مثال على بيانات النسخ عالية الجودة القابلة لتحليلات المعلوماتية الحيوية في المصب ، مثل تحديد الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي (DEGs) ، وتوصيف الشبكات التنظيمية للجينات ، وإجراء دراسة الارتباط على نطاق النسخ (TWAS).

تم تحسين هذه الطريقة لاستخراج عينات بذور الحبوب التي تحتوي على كميات كبيرة من النشا الملوث أو السكريات. وهي مصممة لاستخراج الحمض النووي الريبي الكلي من 24 عينات البذور يوميا. وينبغي أن تجرى باستمرار في يوم واحد، ولكن يتم تحديد نقاط التوقف والإيقاف الاختياري الاختياري ة في جميع أنحاء البروتوكول. بدلا ً من ذلك ، يمكن للقارئ استخدام مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي المفضلة لديهم أو طريقة الاستخراج الكيميائي اليدوي. ومع ذلك ، استنادا إلى خبرتنا السابقة ، المتاحة تجاريا مصنع مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي ليست مناسبة للبذور بسبب كميات كبيرة من النشا والبروتينات والسكر و / أو التلوث بالدهون. في الطريقة الموصوفة ، يتبع الاستخراج الكيميائي للرنا الخام تنقية الأعمدة باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي التجارية. وهذا يوفر عادة الجيش الملكي النيبالي مع أعلى جودة والعائد. يوضح الشكل 1 نتيجة تشغيل BioAnalyzer لاختبار جودة استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام الطريقة الموضحة هنا. يتم تقديم النتائج لأوراق الشعير (عينات 1 و 2 تمثل عينات منخفضة محتوى النشا) وبذور الشعير (عينتين 3 و 4 تمثل عينات عالية من محتوى النشا). قيمة تكامل الحمض النووي الريبي (RIN) لكافة العينات هي 10.
ويبين الشكل 1 هلام تمثيلي من استخراج الحمض النووي الريبي النقي، حيث تم اختبار الجودة باستخدام محلل حيوي. العينات 1 و 2 هي النتائج النموذجية لعينات محتوى النشا منخفضة مثل أوراق الشعير، حيث أشرطة rRNA إضافية من الكلوروبلاست واضحة. العينات 3 و 4 هي نتائج تمثيلية لعينات محتوى النشا عالية مثل بذور الشعير، وتبين 18S و 28S rRNA. يرجى ملاحظة أنه لا يمكن حساب قيمة RIN الآلية لأنسجة النبات الأخضر مثل عينات الأوراق، وذلك بسبب كرنا الكلوروبلاست. ومع ذلك ، يمكن التأكد من النزاهة والجودة العالية بصريًا من خلال عدم وجود أي منتجات تدهور ، والتي تظهر عادة على أنها مسحة جزيئية منخفضة. قيمة RIN لعينات البذور عالية النشا مثل بذور الشعير عادة 10 باستخدام البروتوكول الموصوف في هذه الورقة.
وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نقدم هنا أيضا بيانات تمثيلية لتجربة دورة زمنية من اثنين من الخطوط الأصيلة الشعير النخبة (صوفيا وفيكتوريانا) تستخدم لتحليل نوعية الشعير19. خلال عملية الشعاع، يتم تحويل النشا إلى سكر. لذلك ، تمثل العينات الأنسجة ذات النسب المختلفة من النشا ومحتويات السكر. وبما أن عملية التشعير الصناعي تشبه عملية الإنبات، فقد تم تحليل نسخ خطين من خطوط الشعير، تختلف في جودتها في التشعير. تم استخراج الحمض النووي الريبي من بذور الإنبات في 2 و 24 و 48 و 72 و 120 و 144 و 196 ساعة بعد التشبيب في ثلاثيات الأحيان البيولوجية. تم تنفيذ إعداد الحمض النووي الريبي وتهجين لرقاقة ميكرور الشعير المخصصة على النحو المبين أعلاه. يشير الشكل 2 إلى الشبكة العادية التي تمت قراءتها من التهجين الميكروي الوارد في تقرير مراقبة الجودة(الشكل 3)ومخطط الرسم البياني للإشارات المكتشفة. الشبكة تعطي مثالا على الإشارات المشتقة من كل ركن من أركان الشريحة، بما في ذلك الخلفية وسبايك في قراءة النقاط المستخدمة للمعايرة. يشير الرسم البياني إلى انحراف النقاط القابلة للكشف مع كثافة الإشارة ذات الصلة. التهجين الناجح يعطي منحنى واسع على شكل غاوسي مع القيم المتطرفة الصغيرة فقط كما هو مبين في الشكل. يمكن أن يؤدي التهجين الفاشل إلى تحول قوي نحو جانب واحد ("الوحوش الخضراء").
وأخيراً، تظهر نتيجة تمثيلية للقيم المقبولة في العمود 4 من الشكل 3. للإشارة إلى موثوقية التجارب التي أجريت، يتم تقييم النتائج باستخدام برنامج GeneSpring. وتقدم البيانات المجمعة كتحليل رئيسي للمكونات. يدمج PCA قيم النقاط المختارة (الجينات) كمتجه. يمكن أن يختلف عدد النقاط التي تم تقييمها التي يتم استخدامها من عدة مئات إلى الشريحة بأكملها ويعتمد على البرامج المستخدمة. كل رقاقة (عينة) النتائج في قيمة واحدة (ناقلات) التي نتجت عن كثافة إشارة متكاملة للنقاط تحليلها. لذلك، يشير الموضع النسبي في الرسم البياني (PCA) إلى تشابه العينات مع بعضها البعض. كلما كانت العينات أقرب، كلما كانت متشابهة أكثر. وينبغي أن تكون النسخ المتماثلة التقنية أقرب معاً من العناصر البيولوجية، وينبغي أن تتجمع النسخ البيولوجية للعينة معاً أقرب من عينات من نقاط زمنية أو أنسجة أو شروط مختلفة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig1.jpg"> الشكل 1: ملف Electrophoresis تشغيل ملخص تم الحصول عليها بعد التحقق من جودة الحمض النووي الريبي مع محلل الحيوي. العينات 1 و 2 هي أنسجة أوراق الشعير كما هو مبين من قبل عصابات ريببوسال إضافية من الكلوروبلاست. العينات 3 و 4 هي أنسجة بذور الشعير مع 18S و 28S rRNA العصابات هو مبين. لا يتم حساب عامل RIN دائمًا للأنسجة الخضراء مثل الأوراق ولكن وفقًا للهلام ، فإن جودة الحمض النووي الريبي جيدة جدًا. قيمة RIN للعينات 3 و 4 هي 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig1large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig2.jpg"> الشكل 2: تقرير مراقبة الجودة من التهجين الناجح للصفير الجزئي. A + يشير إلى إشارات تم الكشف عنها على الشبكة من جميع زوايا الشريحة. يُظهر الرسم البياني عدد الإشارات المصنفة وفقًا لشدة الإشارة (الفلورس) على أنها لوغاريتم بعد طرح الخلفية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig2large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig3.jpg"> الشكل 3: ملخص مراقبة الجودة (QC) بعد التهجين والمسح الضوئي. يتم إعطاء قيم الشريحة الهجينة في العمود 2 (القيمة) ويتم عرض نطاق القيم المقبولة في العمود 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig3large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>جمعية غرفة الغسيل</td>
			<td>المحتوى والتسمية</td>
			<td>الغرض</td>
		</tr>
<tr>
<td>طبق 1</td>
			<td>فارغة، وترك على مقاعد البدلاء المختبر حتى اليوم التالي</td>
			<td>ملء مع غسل المخزن المؤقت 1 في اليوم التالي، وتستخدم لتفكيك الشرائح microarray</td>
		</tr>
<tr>
<td>طبق 2</td>
			<td>إضافة رف شريحة ميكروفير واحد وشريط ضجة مغناطيسية صغيرة؛ التسمية مع "غسل المخزن المؤقت 1"، وترك على مقاعد البدلاء المختبر حتى اليوم التالي</td>
			<td>تستخدم لغسل الشرائح microarray مع غسل المخزن المؤقت 1 في اليوم التالي</td>
		</tr>
<tr>
<td>طبق 3</td>
			<td>إضافة واحد شريط ضجة مغناطيسية صغيرة، التسمية مع "غسل المخزن المؤقت 2" ووضعها في حاضنة صغيرة 37 درجة مئوية.</td>
			<td>تستخدم لغسل الشرائح microarray مع غسل المخزن المؤقت 2 في اليوم التالي داخل حاضنة صغيرة 37 درجة مئوية</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: إعداد تجمعات غرفة الغسيل.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>الخطوات</td>
			<td>طبق</td>
			<td>غسل المخزن المؤقت</td>
			<td>درجه الحراره</td>
			<td>الوقت</td>
		</tr>
<tr>
<td>التفكيك</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">المحيطه</td>
			<td rowspan="2">في أسرع وقت ممكن</td>
		</tr>
<tr>
<td>(الخطوة 4.13)</td>
		</tr>
<tr>
<td>غسل أول</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">المحيطه</td>
			<td rowspan="2">دقيقة واحدة</td>
		</tr>
<tr>
<td>(الخطوة 4.14)</td>
		</tr>
<tr>
<td>الغسيل الثاني</td>
			<td rowspan="2">3</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">37 درجة مئوية</td>
			<td rowspan="2">دقيقة واحدة</td>
		</tr>
<tr>
<td>(الخطوة 4.15)</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2: درجة حرارة الحضانة والوقت لمجالس غرفة الغسيل.

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling at JoVE.com

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

يتم تقديم طريقة لتنميط النسخ من الحبوب. يبدأ التنميط الجيني للتعبير عن الفوضى الدقيقة مع عزل الحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة من حبوب الحبوب ويستمر مع توليد cDNA. بعد وضع العلامات cRNA وmicroarray التهجين، يتم تقديم توصيات للكشف عن الإشارات ومراقبة الجودة.

الحصول على بيانات النسخ عالية الجودة من بذور الحبوب من خلال طريقة معدلة لتنميط التعبير الجيني

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

طريقة التهجين الجزئية هذه مفيدة لمقارنة عدد كبير من العينات من كائن حي مع جينوم معروف. مقارنة مع نهج تسلسل الإنتاجية عالية ، وكمية البيانات التي تولدها هذه الطريقة هو أسهل بكثير للتعامل معها ، ويمكن تحليلها بطريقة أكثر فعالية من حيث التكلفة. وسوف يكون إثبات الإجراء الدكتور كريستيان سيلر عالم ما بعد الدكتوراه العامل في مجموعة البحوث في Rosis في IPK في Gatersleben.قبل تنفيذ التهجين microarray باستخدام مجموعة التهجين التعبير الجيني، وإعداد وكيل حظر 10X وفقا لمواصفات الشركة المصنعة و aliquot وكيل الحجب الناتجة في 200 وحدات التخزين ميكرولتر. ثم، تخزين عامل حظر في ناقص 20 درجة مئوية حتى الاستخدام. في يوم التهجين microarray، ذوبان واحد 200 ميكرولتر aliquot من عامل منع 10X على الجليد وprewarm فرن التهجين إلى 65 درجة مئوية وكتلة الحرارة إلى 60 درجة مئوية.إعداد مزيج التفتيت لكل عينة كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة وخلط العينات بلطف على دوامة. بعد دوامة، تدور لفترة وجيزة أسفل العينات في الطرد المجهري قبل احتضان لمدة 30 دقيقة بالضبط في كتلة الحرارة 60 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، على الفور تبريد كل أنبوب على الجليد لمدة دقيقة واحدة قبل وقف التجزئة مع 25 ميكرولترات من 2X الجينات التعبير العازلة التهجين، الثورات عالية في الدقيقة لكل أنبوب.تخلط مع الأنابيب لطيف، مع الحرص الشديد على عدم إدخال أي فقاعات، وأجهزة الطرد المركزي الأنابيب في درجة حرارة الغرفة المحيطة. في نهاية دورة مكان على الفور كل من أنابيب على الجليد وتحميل كل عينة في الشريحة microarray في أسرع وقت ممكن. بعد ذلك ، الاستغناء ببطء 44 ميكرولترات من كل مزيج التهجين في وسط كل بئر طوقا ، مع الحرص على تجنب إدخال الفقاعات ، وإضافة 44 ميكرولترات من العازلة التهجين في أي آبار غير مستخدمة.ضع الشريحة على الفور في الاتجاه الصحيح في أعلى شريحة طوقا، مع الحرص على عدم تسرب أي سائل، وإغلاق الجمعية التهجين بإحكام. تدوير الجمعية لتأكيد عدم وجود فقاعات الهواء الثابتة ووضع الجمعية غرفة التهجين في الدوار فرن التهجين. تعيين سرعة دوران إلى 10 الثورات في الدقيقة الواحدة، ثم بدء التهجين في 65 درجة مئوية لمدة 17 ساعة بالضبط.في حين أن العينات هي التهجين، وإعداد ثلاثة جمعيات غسل طبق في مخازن الغسيل المناسبة كما هو مبين في الجداول. بعد 17 ساعة بالضبط من التهجين ، تفكيك غرفة تهجين واحدة على مقعد مختبر مبطن بورق مجاني من الوبر ونقل شطيرة صغيرة واحدة إلى طبق يحتوي على عازلة غسيل واحدة مع الباركود الصغير الذي يواجه في وضع مائل دون غمر الشريحة بأكملها في الحاجز. باستخدام ملقط، وفصل الشرائح الزجاجية اثنين والسماح للشريحة طوقا قطرة بلطف في الجزء السفلي من الطبق مع الحفاظ على قبضة ثابتة على الشريحة microarray.رفع ببطء الشريحة microarray جانبية لنقل فوري في الرف microarray في الطبق الثاني مع الحد الأدنى من التعرض للهواء. عندما تم وضع جميع الشرائح الثمانية بالتساوي على طول الرف، إرفاق حامل حامل ونقل كامل طبق الإعداد اثنين إلى المحرك المغناطيسي. يُحرّك الإعداد بلطف لمدة دقيقة واحدة بالضبط.في حين يتم تحريك العينات، نقل الطبق الثالث من حاضنة 37 درجة مئوية على مُحرك مغناطيسي ثانٍ. ثم إضافة بلطف 37 درجة مئوية غسل العازلة اثنين لطبق ثلاثة دون تشكيل فقاعات. في نهاية الحضانة التحريك، بلطف وببطء نقل رف الشريحة إلى طبق ثلاثة وإزالة حامل الحامل.بعد التحريك لمدة دقيقة واحدة بالضبط، ببطء وبلطف إزالة رف الشريحة من الطبق واستخدام ورقة مجانية الوبر لتجفيف بعناية كلا الجانبين من كل شريحة، ووضع كل شريحة في مربع الشريحة كما هو المجفف. بعد السماح للشرائح لتجف لمدة 15 دقيقة، نقل كل شريحة microarray إلى حامل شريحة مع الباركود التي تواجه لأعلى وتحميل أصحاب الشريحة المجمعة في مسح الزّاقة والتسلسل وفقاً لرقم الباركود. ثم، على الفور مسح الشرائح.في هذا الرقم، تظهر نتيجة تمثيلية من تشغيل لاختبار نوعية استخراج الحمض النووي الريبي. في التحليلات النموذجية للعينات منخفضة محتوى النشا، مثل أوراق الشعير، أربطة رنا ريبوزومية إضافية من الكلوروبلاستات واضحة. ارتفاع عينات محتوى النشا، مثل بذور الشعير، معرض 18 و 28S رنا الريبوسومي.لاحظ أنه لا يمكن حساب قيمة رقم تكامل RNA الآلي للأنسجة النباتية الخضراء، مثل عينات الأوراق، بسبب الحمض النووي الريبي الريبي الريبوزوكال بالكلوروبلاست. في هذا التحليل التمثيلي، تم إجراء إعداد الحمض النووي الريبي والتهجين إلى رقاقة الشعير الصغير المخصصة كما هو موضح. تعرض الشبكة مثالاً للإشارات المشتقة من كل ركن من الرقاقة، بما في ذلك الخلفية والتموج في نقاط القراءة المستخدمة للمعايرة.يشير الرسم البياني إلى انحراف النقاط القابلة للكشف مع كثافة الإشارة الخاصة بها. كما لوحظ، يعطي التهجين الناجح منحنى واسع على شكل غاوسي مع القيم المتطرفة الثانوية فقط. يظهر هنا تقرير مراقبة الجودة للإشارات المكتشفة.يتم إعطاء قيم الشريحة المهجّنة في العمود الثاني ويتم عرض نطاق القيم المقبولة في العمود الرابع. ويمكن استخدام هذه الطريقة لمعالجة أي إعداد تجريبي لأي كائن حي تتوفر فيه معلومات جوهرية عن الجينوم. استخدام هذه التقنية في مختبرنا مكنتنا من مقارنة وتحليل التغيرات النسخية في الأرز والشعير التي تحدث بعد تحريض الإجهاد النمو.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

وسيلة فعالة لعزل الحمض النووي الريبي العالية النقاء من بذور للاستخدام في التحليل الكمي Transcriptome على

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

A طريقة الترشيح القائم على إعداد نوى عالية الجودة من عبر ربط العضلات والهيكل العظمي للكروماتين مناعي

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

التنميط البروتين العميق بوسم إيسوباريك وواسعة النطاق اللوني السائل والطيف الكتلي وساعدت برامج القياس الكمي

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

استخراج الكافيين والنشاط الأنزيمي والتعبير الجيني ل Synthase الكافيين من تعليق خلية النبات

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

التركيب الحيوي للفلافونول من فلافانون عن طريق إنشاء تتالي بينزيماتي واحد وعاء

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

الحمض النووي الاعتراف تسلسل بواسطة الحمض النووي البدائي باستخدام عاليه الانتاجيه البدائية التنميط

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

التنميط العالي الاستبانة بواسطة Cryoslicing BN-MS التحليل

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

إعداد منتجات الأسماك المخمرة عالية الجودة

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...