Name: obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds by a modified method for gene expression profiling
Uploaded: 2020-05-21T13:00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling at JoVE.com

Dette arbejde er blevet støttet under CGIAR-temaområdet Global Rice Agri-Food System CRP, RICE, Stress-Tolerant Rice for Africa and South Asia (STRASA) Phase III og IZN (Interdisciplinary Centre for Crop Plant Research, Halle (Saale), Tyskland. Vi takker Mandy Püffeld for hendes fremragende tekniske bistand og Dr. Isabel Maria Mora-Ramirez for at dele information og erfaring med hvedechippen. Vi takker Dr. Rhonda Meyer (RG Heterosis, IPK Gatersleben, Tyskland) for kommentarer og kritisk læsning af manuskriptet.

<ol>
	<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+intact-tissue+sequencing+of+single-cell+transcriptional+states.">Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li><li>P&#252;ffeld, M., Seiler, C., Kuhlmann, M., Sreenivasulu, N., Butardo, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Developing+Rice+Grain+Transcriptome+Using+the+Agilent+Microarray+Platform.">Analysis of Developing Rice Grain Transcriptome Using the Agilent Microarray Platform.</a> Methods in Molecular Biology. 1892, 277-300 (2019).</li><li>Martin, L., Fei, Z., Giovannoni, J., Rose, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalyzing+plant+science+research+with+RNA-seq.">Catalyzing plant science research with RNA-seq.</a> Frontiers in Plant Science. 4 (66), (2013).</li><li>Hrdlickova, R., Toloue, M., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+methods+for+transcriptome+analysis.">RNA-Seq methods for transcriptome analysis.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).</li><li>Radchuk, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+profiling+of+starch+biosynthesis+and+degradation+in+the+developing+barley+grain.">Spatiotemporal profiling of starch biosynthesis and degradation in the developing barley grain.</a> Plant Physiology. 150 (1), 190-204 (2009).</li><li>Sreenivasulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+of+seeds:+deciphering+the+molecular+mechanisms+of+seed+storage,+dormancy+and+onset+of+germination.">Systems biology of seeds: deciphering the molecular mechanisms of seed storage, dormancy and onset of germination.</a> Plant Cell Reports. 36 (5), 633-635 (2017).</li><li>Sreenivasulu, N., Wobus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed-development+programs:+a+systems+biology-based+comparison+between+dicots+and+monocots.">Seed-development programs: a systems biology-based comparison between dicots and monocots.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 189-217 (2013).</li><li>Butardo, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+Genetics+Identifies+a+Novel+Regulatory+Domain+of+Amylose+Synthesis.">Systems Genetics Identifies a Novel Regulatory Domain of Amylose Synthesis.</a> Plant Physiology. 173 (1), 887-906 (2017).</li><li>de Guzman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+glycemic+potential+of+rice+by+unraveling+compositional+variations+in+mature+grain+and+starch+mobilization+patterns+during+seed+germination.">Investigating glycemic potential of rice by unraveling compositional variations in mature grain and starch mobilization patterns during seed germination.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5854 (2017).</li><li>Sreenivasulu, N., Sunkar, R., Wobus, U., Strickert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+platforms+and+bioinformatics+tools+for+the+analysis+of+plant+transcriptome+in+response+to+abiotic+stress.">Array platforms and bioinformatics tools for the analysis of plant transcriptome in response to abiotic stress.</a> Methods in Molecular Biology. 639, 71-93 (2010).</li><li>Anacleto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+a+genome-wide+association+study+with+a+large-scale+transcriptome+analysis+to+predict+genetic+regions+influencing+the+glycaemic+index+and+texture+in+rice.">Integrating a genome-wide association study with a large-scale transcriptome analysis to predict genetic regions influencing the glycaemic index and texture in rice.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2018).</li><li>Pietsch, C., Sreenivasulu, N., Wobus, U., Roder, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+mapping+of+putative+regulator+genes+of+barley+grain+development+characterized+by+expression+profiling.">Linkage mapping of putative regulator genes of barley grain development characterized by expression profiling.</a> BMC Plant Biology. 9, 4 (2009).</li><li>Druka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+gene+expression+from+seed+to+seed+through+barley+development.">An atlas of gene expression from seed to seed through barley development.</a> Functional &amp; Integrative Genomics. 6 (3), 202-211 (2006).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+Expression+Atlas+In+Reproductive+Development.">Rice Expression Atlas In Reproductive Development.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (12), 2060-2081 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+gene+expression+atlas+covering+the+entire+life+cycle+of+rice.">A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice.</a> The Plant Journal. 61 (5), 752-766 (2010).</li><li>Yamakawa, H., Hakata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+rice+grain+filling-related+metabolism+under+high+temperature:+Joint+analysis+of+metabolome+and+transcriptome+demonstrated+inhibition+of+starch+accumulation+and+induction+of+amino+acid+accumulation.">Atlas of rice grain filling-related metabolism under high temperature: Joint analysis of metabolome and transcriptome demonstrated inhibition of starch accumulation and induction of amino acid accumulation.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (5), 795-809 (2010).</li><li>Shakoor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sorghum+bicolor+expression+atlas+reveals+dynamic+genotype-specific+expression+profiles+for+vegetative+tissues+of+grain,+sweet+and+bioenergy+sorghums.">A Sorghum bicolor expression atlas reveals dynamic genotype-specific expression profiles for vegetative tissues of grain, sweet and bioenergy sorghums.</a> BMC Plant Biology. 14, 35 (2014).</li><li>Yu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+reveals+key+differentially+expressed+genes+involved+in+wheat+grain+development.">Transcriptome analysis reveals key differentially expressed genes involved in wheat grain development.</a> Crop Journal. 4 (2), 92-106 (2016).</li><li>Kochevenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+QTL+hot+spots+for+malting+quality+in+two+elite+breeding+lines+with+distinct+tolerance+to+abiotic+stress.">Identification of QTL hot spots for malting quality in two elite breeding lines with distinct tolerance to abiotic stress.</a> BMC Plant Biology. 18 (1), 106 (2018).</li></ol>

Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Den beskrevne metode giver meget reproducerbare resultater for højtydende OG højkvalitets RNA-ekstrakter (figur 1). Baseret på vores erfaring anbefaler vi tre biologiske replikater for en genotype, fase eller tilstand til analyse. For at kunne påvise statistisk meningsfulde forskelle skal den generelle forekomst af mRNA overvejes. Bemærk dog, at der kræves en startmængde på 200 mg vævsprøver i tre eksemplarer til RNA-ekstraktionstrinnet. For forsøg, der har en begrænset mængde prøver såsom genetisk modificerede plantematerialer, er denne metode derfor muligvis ikke hensigtsmæssig.
Under mikroarrayhybridisering er følgende trin mest kritiske: (1) indlæsning af prøverne til pakningsdiaset (trin 4.7) og (2) vask af arrays efter hybridisering (trin 4.13 og 4.14). Prøve belastning skal gøres meget omhyggeligt for at undgå boble dannelse og flydende spilde. Forsigtighed er nødvendig, når du sætter microarray dias på pakningdiaset indeholder de lastede prøver: DNA-side (med plettede sonder) skal vende nedad for at tillade hybridisering. Til vask af mikroarrays er det andet vasketrin særligt kritisk: Her skal fjernelseaf diasene fra vaskebuffer 2 udføres meget langsomt (10 s) for at undgå bufferartefakter på diasene, hvilket kan forstyrre dataindsamlingen og analyserne.
For at modtage resultater fra hybridisering eksperiment, der er berettiget til down-stream bioinformatik analyse, bør man følge et par vigtige kriterier. QC-rapporten, som genereres efter ovenstående protokols ydeevne, giver en god idé om, hvad der skal forbedres, og hvilke data der er i brugbar stand (figur 3). De første modtagne oplysninger er det visualiserede gitter (Figur 2). Her kan man direkte se, om alle områder for fluorescens udlæsning er korrekt justeret. Hvis der er et visuelt påviseligt skift, vil dette påvirke alle andre værdier (baggrund, signalintensitet osv.), og læsningen af denne chip kan ikke bruges. På oversigten (Rumlig fordeling af alle Outliers), kan man nemt få øje på enhver forurening (f.eks støv eller hår), som påvirkede resultatet. Snavs kan fjernes ved at blæse og scanne chippen igen. Histogrammet af signalplot som nævnt ovenfor bør resultere i en bred Gauss-formet kurve, med kun mindre outliers (Figur 2). Afhængigt af det analyserede væv (Figur 1) kan denne kurve se anderledes ud og kan se ud til at have to toppe eller en fremherskende top med en skulder. Dette vil ikke påvirke kvaliteten af data. Kun en stærk forflyttet top, eller høje signaler på kanterne indikerer problemer, såsom "grønne monstre" (for høj fluorescens intensiteter), som ikke kan fjernes ved vask og bør indberettes til chipproducenten. Desuden bør "Spatial Distribution graph for Median Signals" variere omkring en fælles værdi. Dette bør være i intervallet mellem 40 og 100, afhængigt af den generelle intensitet udlæsning af chippen analyseret. En anden vigtig kvalitetskontrol er evalueringen af den kraftige stigning i data: Loggrafen for spidserne i signalerne bør resultere i en lineær og regelmæssig linje. Endelig giver tabellen over "evalueringsmålinger" et godt og pålideligt overblik over de modtagne resultater. Her giver producenten en række værdier, som kan klassificeres som Excellent, Good og Evaluate (Figur 3). Ifølge vores erfaring kan nogle af værdierne ikke altid anvendes for alle chips. For risbrugerdefinerede chips var "nonControl-værdien" ofte uden for området, men påvirker ikke den videre databehandling væsentligt. Desuden kan intervallet for "NegControl" udvides, baseret på væv, organisme og generel produktion af chippen til <80. Intervallet for evaluering for værdi E1 med CV kan udvides til <9, i stedet for <8 ifølge vores erfaring. Efter dette, en ordentlig evaluering af alle chip læse data er muligt. Generelt bør man altid huske på, at uafhængige biologiske replikater altid giver det mest pålidelige resultat.
Fordelen ved denne teknik i forhold til andre metoder ligger i det faktum, at det repræsenterer en omkostningseffektiv, høj-throughput metode til transskriptionel profilering. Desuden er downstream-dataanalysepipelinen lettere og mere etableret. På trods af fordele, der er visse begrænsninger af denne teknik, såsom antallet af gener, der kan analyseres. Mikroarrayet kan kun lette analysen af gener, der tidligere har spottet sonder på arrayet. Derfor gælder denne teknik kun for plantearter med sekvenserede genomer og fuldt kommenterede gener. Vi forestiller os, at mikroarray-baserede transkriptorer fortsat vil være meget nyttige og relevante, ikke kun for genekspressionsprofilering, men også for andre downstream bioinformatikrørledninger såsom genregulerende netværksanalyser og transskriptionsomfattende foreningsundersøgelse.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/60602/obtaining-high-quality-transcriptome-data-from-cereal-seeds-modified">Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling</a>. Two&#160;author&#160;names were&#160;updated.
The&#160;names were&#160;corrected from:
Christianne&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreeenivasulu
to:
Christiane&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreenivasulu

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/60602/obtaining-high-quality-transcriptome-data-from-cereal-seeds-modified">Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling</a>. Two&#160;author&#160;names were&#160;updated.

Erratum: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Transskriptionen repræsenterer det komplette sæt ribonucleic syre (RNA) udskrifter udtrykt ved genomet af en organisme på et givet tidspunkt, og især miljø-og vækstbetingelser. Hver celle har sin individuelle transkription, som afspejler dens nuværende fysiologiske og metaboliske tilstand. En samling af celler, der stammer fra et lignende væv eller organ, anvendes i et typisk transskriptionsstudie, men enkeltcellede og rumligt løste transskriptionomik bliver populært1. Transkripomiske analyser starter med ekstraktion af det samlede RNA fra et udvalgt væv på et bestemt tidspunkt og i definerede vækstbetingelser. Til dette formål anbefaler vi, at der anvendes en nyudviklet metode til udvinding af totalRNA fra prøver med højt stivelses- eller sukkerindhold, såsom kornfrø2. Sammenligningen af transkriptioner mellem forskellige prøver resulterer i identifikation af RNA-molekyler med forskellig tæthed. Disse RNA-molekyler betragtes som differentierede udtrykte gener (DEGs). Den overflod af udskrifter, der er afledt af specifikke markørgener, kan derefter bruges til at vurdere udviklingsstatus eller bestemme en organismes reaktion på miljømæssige udsving. Gener uden påviselige ændringer i deres udskrift overflod på tværs af udviklingsmæssige tidspunkter under undersøgelse bruges ofte som reference eller husholdning gener.
RNA er typisk opdaget og kvantificeret ved forskellige metoder, såsom nordlige blotting og kvantitative omvendt transkripase polymerase kædereaktion (qRT-PCR), men nuværende høj-throughput transkriptionomics metoder er stærkt afhængige af nukleinsyre hybridisering ved hjælp af microarray teknologi samt RNA sekventering (RNA-Seq). RNA-Seq er meget populær iøjeblikket,fordi det giver flere fordele for høj gennemløb transskriptionomiske applikationer som gennemgået andetsteds3,4. Selv om en ældre teknologi, genekspression profilering ved hjælp af microarray chips er stadig meget udbredt, fordi det er en mere etableret teknologi, som kræver mindre af en baggrund i bioinformatik. Sammenlignet med RNA-Seq er de datasæt, der genereres fra mikroarrayeksperimenter, mindre og lettere at analysere. Desuden er det mere omkostningseffektivt, især hvis der beskæftiger sig med store stikprøvenumre. I vores laboratorium bruger vi rutinemæssigt transkriptoriske analyser ved hjælp af microarray-teknologien til at bestemme den rolle, som centrale reguleringsknudepunkter, der styrer de molekylære netværk og veje, der er involveret i vækst, udvikling og metabolisme af korn5,,6,,7,8,9. Vi bruger det også rutinemæssigt til at gennemføre genekspressionsprofileringsundersøgelser for at opnå en mekanistisk forståelse af kornets respons på abiotiske belastninger10,samt i udførelsen af transskriptionsdækkende association (TWAS) og linkage mapping undersøgelser for at identificere gener, der er ansvarlige for kornkvalitet og ernæring11,12. Andre grupper har også anvendt mikroarrayteknologien til at levere udviklingsspecifikt genekspressionsatlas i byg13, ris14,15,16, sorghum17og hvede18.
Formålet med denne publikation er at give et kort tekstresumé og en detaljeret visuel beskrivelse af den metode, vi i øjeblikket anvender i vores laboratorium til transskription af korn ved hjælp af en Agilent microarray platform. Bemærk venligst, at andre microarray platforme er tilgængelige, men vil ikke være dækket i denne metode. Vi begynder protokollen ved at præsentere en detaljeret beskrivelse af RNA-ekstraktion fra udvikling eller spiring af kornfrø. Baseret på vores erfaring, at opnå en høj kvalitet og høj mængde transskription modtagelige for downstream transskriptionomiske analyser er ofte flaskehals, når du bruger korn frø væv. Vi har prøvet flere kommercielt tilgængelige RNA ekstraktionssæt, men ingen har givet tilfredsstillende resultater. Derfor udviklede vi en kemisk ekstraktionsprotokol for at opnå et råT RNA-ekstrakt, som derefter udsættes for kolonnerensning ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit. Ved hjælp af denne metode opnår vi rutinemæssigt og reproducerbart RNA2 af høj kvalitet (Figur 1), som kan bruges til forskellige downstream-applikationer til at generere en transskriptionsprofil.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td>Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>To determine quality and quantity of RNA extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crushed ice maker</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>To keep samples on ice during sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar flask</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>Used as liquid nitrogen container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Hybridization Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5242</td>
			<td>Kit components: 
			2X Hi-RPM Hybridization Buffer 
			25X Fragmentation Buffer 
			10X Gene Expression Blocking Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Wash buffer Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5325</td>
			<td>Kit components: 
			Gene Expression Wash Buffer 1 
			Gene Expression Wash Buffer 2 
			Triton X-102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2545A</td>
			<td>Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization gasket slide kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534-60014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQAir air cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9866.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free paper, Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>KC34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Input Quick Amp Labeling Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-2305</td>
			<td>Kit components: 
			T7 Primer 
			5x First Strand Buffer 
			0.1M DTT 
			10 mM dNTP Mix 
			AffinityScript RNAse Block Mix 
			5x Transcription Buffer 
			NTP Mix 
			T7 RNA Polymerase Blend 
			Nuclease-free water 
			Cyanine 3-CTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spatula, small</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes, nuclease-free</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>2.0 mL and 1.5 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td>It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110-230V</td>
			<td>Any small incubator will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and pestle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td>Peqlab / Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>351900302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-Color RNA Spike-In Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5188-5282</td>
			<td>Kit components: 
			One color RNA Spike-Mix 
			Dilution Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ozone barrier slide cover kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2505-60550</td>
			<td>Optional but highly recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube, 0.2 mL, RNase-free</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>Z376426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A156.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, nuclease free, filter tips</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor set</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Extraction Buffer</td>
			<td>10 mM Tri-HCl pH 8.0 
			150 mM LiCl 
			50 mM EDTA 
			1.5% EDTA 
			15 ul/mL &#946;-mercaptoethanol</td>
			<td></td>
			<td>We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add &#946;-mercaptoethanol fresh daily</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Kit components: 
			RNeasy mini spin column (pink) 
			1.5 ml collection tubes 
			2 ml collection tubes 
			Buffer RLT 
			Buffer RW 
			Buffer RPE 
			Nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74904</td>
			<td>Kit components: 
			RNeasy mini spin column (pink) 
			QIAshredder spin column (purple) 
			1.5 ml collection tubes 
			2 ml collection tubes 
			Buffer RLT 
			Buffer RLC 
			Buffer RW1 
			Buffer RPE 
			Nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide holders for DNA microarray scanner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2505-60525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide staining dish with removable rack</td>
			<td>DWK Life Sciences 900200</td>
			<td>Fisher Scientific 08-812</td>
			<td>We recommend DWK Life Sciences Wheaton&#8482; Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultralow temperature freezer</td>
			<td>Various brand</td>
			<td></td>
			<td>Capable of storing sample at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds by a modified method for gene expression profiling

Karakteriseringen af genekspressionen afhænger af RNA-kvalitet. Ved spiring, udvikling og modne kornfrø hæmmes udvindingen af RNA af høj kvalitet ofte af højt stivelses- og sukkerindhold. Disse forbindelser kan reducere både udbyttet og kvaliteten af den ekstraherede samlede RNA. Forringelsen af kvantiteten og kvaliteten af det samlede RNA kan efterfølgende have en betydelig indvirkning på downstream-transskriptionen om udskriftsanalyser, som muligvis ikke nøjagtigt afspejler den rumlige og/eller tidsmæssige variation i genekspressionsprofilen for de prøver, der testes. I denne protokol beskriver vi en optimeret metode til ekstraktion af totalRNA med tilstrækkelig mængde og kvalitet, der skal anvendes til hele transkriptionsanalyse af korn. Den beskrevne metode er velegnet til flere downstream-applikationer, der anvendes til transskription om udvikling, spireevne og modne kornfrø. Metoden til transskription profilering ved hjælp af en microarray platform er vist. Denne metode er specielt designet til genekspressionsprofilering af korn med beskrevne genomsekvenser. Den detaljerede procedure fra microarray håndtering til endelig kvalitetskontrol er beskrevet. Dette omfatter cDNA-syntese, cRNA-mærkning, mikroarray hybridisering, diasscanning, funktionsudtrækning og validering af datakvalitet. De data, der genereres ved denne metode, kan anvendes til at karakterisere transskriptionen af korn under spiring, i forskellige stadier af kornudvikling eller ved forskellige biotiske eller abiotiske stressforhold. De resultater, der præsenteres her, eksemplificerer transkriptionsdata af høj kvalitet, der kan udføres i forbindelse med nedstrømsbioinformatikanalyser, såsom bestemmelse af differentialudtrykte gener (DEGs), karakterisering af genreguleringsnetværk og gennemførelse af transkriptionsomfattende foreningsundersøgelser (TWAS).

Denne metode er optimeret til udvinding af prøver af frø af korn, der indeholder betydelige mængder forurenende stivelse eller sukker. Det er designet til at udtrække total RNA fra 24 frøprøver om dagen. Det bør udføres kontinuerligt på én dag, men valgfrie stop- og pausepunkter identificeres i hele protokollen. Alternativt kan læseren bruge deres foretrukne RNA ekstraktionssæt eller manuel kemisk ekstraktionsmetode. Men baseret på vores tidligere erfaringer, kommercielt tilgængelige plante RNA ekstraktionssæt er ikke egnet til frø på grund af betydelige mængder af stivelse, proteiner, sukker og / eller lipid forurening. I den beskrevne metode efterfølges en kemisk ekstraktion af rå RNA af kolonnerensning ved hjælp af et kommercielt RNA-ekstraktionssæt. Dette giver typisk RNA højere kvalitet og udbytte. Figur 1 viser resultatet af en BioAnalyzer-kørsel for at teste kvaliteten af RNA-ekstraktion ved hjælp af den metode, der er beskrevet her. Resultaterne præsenteres for bygblade (prøver 1 og 2, der repræsenterer prøver med lavt stivelsesindhold) og bygfrø (prøver 3 og 4, der repræsenterer prøver med højt stivelsesindhold). RNA-integritetsværdien (RIN) for alle prøver er 10.
Figur 1 viser en repræsentativ gel af det rensede RNA-ekstrakt, hvor kvaliteten blev testet ved hjælp af en Bioanalyzer. Prøver 1 og 2 er typiske resultater for prøver med lavt stivelsesindhold såsom bygblade, hvor yderligere rRNA-bånd fra kloroplaster er tydelige. Prøver 3 og 4 er repræsentative resultater for prøver med højt stivelsesindhold såsom bygfrø, der viser 18S og 28S rRNA. Bemærk, at der ikke kan beregnes nogen automatisk RIN-værdi for grønt plantevæv såsom bladprøver på grund af chloroplast rRNA. Integriteten og den høje kvalitet kan dog konstateres visuelt ved fraværet af nedbrydningsprodukter, der typisk fremstår som lav molekylær udtværing. RIN-værdien for prøver af frø med høj stivelse, såsom bygfrø, anvendes typisk 10 ved hjælp af den protokol, der er beskrevet i dette papir.
Derudover præsenterer vi også her et repræsentativt data for et tidskursus eksperiment af to elite byg indavlede linjer (Sofiara og Victoriana), der anvendes til analyse af maltning kvalitet19. Under maltningsprocessen omdannes stivelsetil sukker. Derfor repræsenterer prøverne væv med varierende andel af stivelse og sukkerindhold. Da den industrielle maltningsproces svarer til spiringsprocessen, blev transskriptionerne af to byglinjer, der er forskellige i deres maltningskvalitet, analyseret. RNAs blev udvundet fra spiring frø på 2, 24, 48, 72, 120, 144 og 196 h efter imbibition i biologiske treeksemplarer. RNA-præparatet og hybridiseringen af den tilpassede bygmicroarray chip blev udført som beskrevet ovenfor. Figur 2 angiver det normaliserede gitter, der er læst ud fra mikroarrayhybridiseringen i rapporten om kvalitetskontrol (QC) (figur 3) og histogrammet for deektrete signaler. Gitteret giver et eksempel på afledte signaler fra hvert hjørne af chippen, herunder baggrund og spike-in læse prikker, der anvendes til kalibrering. Histogrammet angiver afvigelsen af påviselige prikker med respektive signalintensiteter. En vellykket hybridisering giver en bred Gaussisk-formet kurve med kun mindre outliers som vist i figuren. Mislykkede hybridiseringer kan resultere i et stærkt skift i retning af den ene side ("grønne monstre").
Endelig er et repræsentativt resultat af de acceptable værdier vist i kolonne 4 i figur 3. For at angive pålideligheden af de udførte eksperimenter evalueres resultaterne yderligere ved hjælp af GeneSpring-softwaren. De indsamlede data præsenteres som hovedkomponentanalyse (PCA). PCA integrerer værdierne af udvalgte prikker (gener) som vektor. Antallet af evaluerede prikker, der bruges, kan variere fra flere hundrede til hele chippen og er afhængig af den anvendte software. Hver chip (prøve) resulterer i én værdi (vektor), der er resultatet af de integrerede signalintensiteter for de analyserede prikker. Derfor angiver den relative placering i grafen (PCA) ligheden mellem prøverne og hinanden. Jo tættere prøverne er, jo mere ens er de. Tekniske replikater bør være tættere sammen end biologiske, og biologiske replikater af en prøve bør samles tættere på hinanden end prøver fra forskellige tidspunkter, væv eller tilstande.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig1.jpg"> Figur 1: Elektroforesefilkørselsoversigt opnået efter kontrol af kvaliteten af RNA med Bioanalyzer. Prøver 1 og 2 er bygbladsvæv som angivet med yderligere ribosombånd fra kloroplaster. Prøver 3 og 4 er bygfrøvæv med 18S og 28S rRNA-bånd vist. En RIN faktor er ikke altid beregnet for grønne væv såsom blad, men ifølge gel, kvaliteten af RNA er meget god. RIN-værdien for prøve 3 og 4 er 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig2.jpg"> Figur 2: QC Rapport fra vellykket byg microarray hybridisering. A + angiver registrerede signaler på nettet fra alle hjørner af chippen. Histogrammet viser antallet af signaler kategoriseret efter signalintensitet (fluorescens) som logaritme efter baggrundssubtraktion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig3.jpg"> Figur 3: Oversigt over kvalitetskontrol (QC) efter hybridisering og scanning. Værdierne for det hybridiserede dias er angivet i kolonne 2 (værdi), og området med acceptable værdier vises i kolonne 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Vask kammer forsamling</td>
			<td>Indhold og etiket</td>
			<td>Formål</td>
		</tr>
<tr>
<td>Skål 1</td>
			<td>Tøm, lad på laboratoriebænken indtil næste dag</td>
			<td>Fyld med Vaskebuffer 1 næste dag, der bruges til at adskille mikroarraydias</td>
		</tr>
<tr>
<td>Skål 2</td>
			<td>Tilføj en microarray slide rack og en lille magnetisk røre bar; etiketten med "Wash Buffer 1", skal du lade være på laboratoriebænken til næste dag</td>
			<td>Bruges til at vaske microarray slides med Wash Buffer 1 den næste dag</td>
		</tr>
<tr>
<td>Skål 3</td>
			<td>Tilføj en lille magnetisk røre bar, etiket med "Wash Buffer 2" og sted i en 37 °C mini inkubator.</td>
			<td>Bruges til at vaske microarray slides med Wash Buffer 2 den næste dag inde i 37 °C mini inkubator</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Forberedelse af vaskekammerets enheder.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Trin</td>
			<td>Parabol</td>
			<td>Vask buffer</td>
			<td>Temperatur</td>
			<td>Tid</td>
		</tr>
<tr>
<td>Demontering</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">Omgivende</td>
			<td rowspan="2">Så hurtigt som muligt</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Trin 4.13)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Første vask</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">Omgivende</td>
			<td rowspan="2">1 min.</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Trin 4.14)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anden vask</td>
			<td rowspan="2">3</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">37 °C</td>
			<td rowspan="2">1 min.</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Trin 4.15)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Inkubationstemperatur og tid til vaskekammerenheder.

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling at JoVE.com

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Der præsenteres en metode til transskription af korn. Den mikroarray-baserede genekspressionsprofilering starter med isolering af totalRNA af høj kvalitet fra korn og fortsætter med genereringen af cDNA. Efter cRNA-mærkning og mikroarrayhybridisering gives der anbefalinger til signaldetektion og kvalitetskontrol.

Opnåelse af udskriftsdata af høj kvalitet fra kornfrø ved en modificeret metode til genekspressionsprofilering

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Denne microarray hybridiseringsmetode er nyttig til at sammenligne et stort antal prøver fra en organisme med et kendt genom. Sammenlignet med en høj overførselshastighedssegang er mængden af data, der genereres af denne metode, meget lettere at håndtere, og yderligere kan den analyseres på en mere omkostningseffektiv måde. Demonstration af proceduren vil være Dr.Christiane Seiler en post-ph.d.-videnskabsmand, der arbejder i forskergruppen på Rosis på IPK i Gatersleben.Før du udfører microarray hybridisering ved hjælp af genekspression hybridisering kit, forberede 10X blokering agent i henhold til producentens specifikationer og aliquot den resulterende blokering agent i 200 microliter mængder. Gem derefter blokeringsmidlet minus 20 grader Celsius indtil brug. På dagen for microarray hybridisering, tø en 200 mikroliter aliquot af 10X blokering agent på is og prewarm hybridisering ovnen til 65 grader Celsius og en varmeblok til 60 grader Celsius.Fragmenteringsblandingen for hver prøve klargøres som beskrevet af fabrikanten, og prøverne blandes forsigtigt på en vortex. Efter vortexing, kort spin ned prøverne i en mikrocentrifuge før inkubering i præcis 30 minutter i 60 grader Celsius varmeblok. Ved inkubationens afslutning afkøles hvert rør straks på is i et minut, før fragmenteringen stoppes med 25 mikroliter 2X genekspressionshybrisiseringsbuffer, høje omdrejninger pr. minut pr. rør.Bland med blid pipettering, idet stor omhu for ikke at indføre nogen bobler, og centrifuge rørene i omgivelsesrumtemperatur. I slutningen af spin straks placere alle rørene på is og indlæse hver prøve i microarray dias så hurtigt som muligt. Dernæst langsomt dispensere 44 mikroliter af hver hybridisering mix i midten af hver pakning godt, idet man skal passe på at undgå at indføre bobler, og tilføje 44 mikroliter hybridisering buffer i eventuelle ubrugte brønde.Placer straks mikroarray-rutsjebanen i den korrekte retning oven på pakningssliden, og pas på ikke at spilde væske, og luk hybridiseringssamlingen tæt. Drej samlingen for at bekræfte manglen på stationære luftbobler og placer hybridiseringskammerets samling i hybridiseringsovnen. Indstil rotationshastigheden til 10 omdrejninger i minuttet, og start hybridiseringen ved 65 grader Celsius i præcis 17 timer.Mens prøverne hybridiseres, forberedes tre vaskeskåle i de relevante vaskepuffere som beskrevet i tabellerne. Efter præcis 17 timers hybridisering, adskille en hybridisering kammer på en lab bænk foret med fnugfrit papir og overføre en microarray sandwich til en skål, der indeholder vask buffer en med microarray stregkode vender opad i en skrå position uden nedsænkning hele dias i bufferen. Brug vicessper, adskille de to glas dias og lad pakningen glide falde forsigtigt ind i bunden af skålen og samtidig holde et fast greb om microarray dias.Løft langsomt microarray-rutsjebanen sidelæns for øjeblikkelig overførsel til mikroarray-stativet i skål to med minimal udsættelse for luften. Når alle otte objektglas er placeret jævnt langs stativet, fastgøres rackholderen, og hele skålen overføres til magnetomrøreren. Rør forsigtigt opsætningen i præcis et minut.Mens prøverne omrøres, overføres fad tre fra 37 grader Celsius-inkubatoren til en anden magnetisk omrører. Derefter forsigtigt tilføje 37 grader Celsius vask buffer to til fad tre uden at danne bobler. Ved afslutningen af inkubationen overføres glidestativet forsigtigt og langsomt til skål tre, og rackholderen fjernes.Efter omrøring i præcis et minut, langsomt og forsigtigt fjerne slide rack fra skålen og bruge fnug gratis papir til omhyggeligt tørre begge sider af hvert dias, placere hvert dias i en slide boks, da det er tørret. Når objektglassene tørrer i 15 minutter, overføres hver mikroarray-rutsjebane til en objektglasholder med stregkoden opad, og de samlede objektglasholdere indlæses i en scanningskarrusel og sekvens i henhold til stregkodenummeret. Scan derefter straks diasene.I dette tal vises et repræsentativt resultat fra et løb til test af kvaliteten af RNA-ekstraktionen. I typiske analyser af prøver med lavt stivelsesindhold, såsom bygblade, er der tydelige yderligere ribosomale RNA-bånd fra kloroplaster. Prøver med højt stivelsesindhold, såsom bygfrø, udviser 18 og 28S ribosomal RNA.Bemærk, at der ikke kan beregnes nogen automatiseret RNA-integritetsnummerværdi for grønt plantevæv, såsom bladprøver, på grund af chloroplast ribosomal RNA. I denne repræsentative analyse blev en RNA-præparat og hybridisering til en tilpasset byg microarray chip udført som påvist. Gitteret viser et eksempel på afledte signaler fra hvert hjørne af chippen, herunder baggrund og spids i udlæsningsdyb, der bruges til kalibrering.Histogrammet angiver afvigelsen af detekterbare prikker med respektive signalintensiteter. Som observeret, en vellykket hybridisering giver en bred Gaussisk-formet kurve med kun mindre outliers. Vist her er kvalitetskontrolrapporten for registrerede signaler.Værdierne for det hybridiserede dias er angivet i kolonne to, og området med acceptable værdier vises i kolonne fire. Denne metode kan anvendes til at håndtere alle forsøg, der er oprettet for enhver organisme, hvor der foreligger væsentlige oplysninger om genomet. Ved hjælp af denne teknik i vores laboratorium gjorde det muligt for os at sammenligne og analysere transskriptive ændringer i ris og byg, der opstår efter vækst stress induktion.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metode til isolering af stærkt Renset RNA fra Frø til brug i Kvantitative Transkriptomet Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

En filtreringsbaseret metode til fremstilling af højkvalitetsnuclei fra tværbundet skeletsmuskel til chromatinimmunpræcipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Dyb proteomet profilering af Isobar mærkning, omfattende væskekromatografi, massespektrometri og Software-assisteret kvantificering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Koffein udvinding, enzymatisk aktivitet og genekspression af koffein syntase fra plante celle suspensioner

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

Biosyntese af en flavonol fra en Flavanone ved at etablere en en-pot Bienzymatisk kaskade

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering og identifikation illustreret af angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA-sekvens genkendelse af DNA Primase ved hjælp af Primase profilering med høj gennemløb

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Complexome-profilering med høj opløsning ved Cryoslicing BN-MS-analyse

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

Tilberedning af fermenteret fiskeprodukt af høj kvalitet

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...