Name: obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds by a modified method for gene expression profiling
Uploaded: 2020-05-21T13:00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling at JoVE.com

Dit werk is ondersteund in het kader van het CGIAR thematisch gebied Global Rice Agri-Food System CRP, RICE, Stress-Tolerant Rice for Africa and South Asia (STRASA) Phase III, en IZN (Interdisciplinary Centre for Crop Plant Research, Halle (Saale), Duitsland. Wij danken Mandy Püffeld voor haar uitstekende technische bijstand en Dr. Isabel Maria Mora-Ramirez voor het delen van informatie en ervaring met de tarwechip. Wij danken Dr. Rhonda Meyer (RG Heterosis, IPK Gatersleben, Duitsland) voor commentaar en het kritisch lezen van het manuscript.

<ol>
	<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+intact-tissue+sequencing+of+single-cell+transcriptional+states.">Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li><li>P&#252;ffeld, M., Seiler, C., Kuhlmann, M., Sreenivasulu, N., Butardo, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Developing+Rice+Grain+Transcriptome+Using+the+Agilent+Microarray+Platform.">Analysis of Developing Rice Grain Transcriptome Using the Agilent Microarray Platform.</a> Methods in Molecular Biology. 1892, 277-300 (2019).</li><li>Martin, L., Fei, Z., Giovannoni, J., Rose, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalyzing+plant+science+research+with+RNA-seq.">Catalyzing plant science research with RNA-seq.</a> Frontiers in Plant Science. 4 (66), (2013).</li><li>Hrdlickova, R., Toloue, M., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+methods+for+transcriptome+analysis.">RNA-Seq methods for transcriptome analysis.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).</li><li>Radchuk, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+profiling+of+starch+biosynthesis+and+degradation+in+the+developing+barley+grain.">Spatiotemporal profiling of starch biosynthesis and degradation in the developing barley grain.</a> Plant Physiology. 150 (1), 190-204 (2009).</li><li>Sreenivasulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+of+seeds:+deciphering+the+molecular+mechanisms+of+seed+storage,+dormancy+and+onset+of+germination.">Systems biology of seeds: deciphering the molecular mechanisms of seed storage, dormancy and onset of germination.</a> Plant Cell Reports. 36 (5), 633-635 (2017).</li><li>Sreenivasulu, N., Wobus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed-development+programs:+a+systems+biology-based+comparison+between+dicots+and+monocots.">Seed-development programs: a systems biology-based comparison between dicots and monocots.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 189-217 (2013).</li><li>Butardo, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+Genetics+Identifies+a+Novel+Regulatory+Domain+of+Amylose+Synthesis.">Systems Genetics Identifies a Novel Regulatory Domain of Amylose Synthesis.</a> Plant Physiology. 173 (1), 887-906 (2017).</li><li>de Guzman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+glycemic+potential+of+rice+by+unraveling+compositional+variations+in+mature+grain+and+starch+mobilization+patterns+during+seed+germination.">Investigating glycemic potential of rice by unraveling compositional variations in mature grain and starch mobilization patterns during seed germination.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5854 (2017).</li><li>Sreenivasulu, N., Sunkar, R., Wobus, U., Strickert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+platforms+and+bioinformatics+tools+for+the+analysis+of+plant+transcriptome+in+response+to+abiotic+stress.">Array platforms and bioinformatics tools for the analysis of plant transcriptome in response to abiotic stress.</a> Methods in Molecular Biology. 639, 71-93 (2010).</li><li>Anacleto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+a+genome-wide+association+study+with+a+large-scale+transcriptome+analysis+to+predict+genetic+regions+influencing+the+glycaemic+index+and+texture+in+rice.">Integrating a genome-wide association study with a large-scale transcriptome analysis to predict genetic regions influencing the glycaemic index and texture in rice.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2018).</li><li>Pietsch, C., Sreenivasulu, N., Wobus, U., Roder, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+mapping+of+putative+regulator+genes+of+barley+grain+development+characterized+by+expression+profiling.">Linkage mapping of putative regulator genes of barley grain development characterized by expression profiling.</a> BMC Plant Biology. 9, 4 (2009).</li><li>Druka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+gene+expression+from+seed+to+seed+through+barley+development.">An atlas of gene expression from seed to seed through barley development.</a> Functional &amp; Integrative Genomics. 6 (3), 202-211 (2006).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+Expression+Atlas+In+Reproductive+Development.">Rice Expression Atlas In Reproductive Development.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (12), 2060-2081 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+gene+expression+atlas+covering+the+entire+life+cycle+of+rice.">A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice.</a> The Plant Journal. 61 (5), 752-766 (2010).</li><li>Yamakawa, H., Hakata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+rice+grain+filling-related+metabolism+under+high+temperature:+Joint+analysis+of+metabolome+and+transcriptome+demonstrated+inhibition+of+starch+accumulation+and+induction+of+amino+acid+accumulation.">Atlas of rice grain filling-related metabolism under high temperature: Joint analysis of metabolome and transcriptome demonstrated inhibition of starch accumulation and induction of amino acid accumulation.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (5), 795-809 (2010).</li><li>Shakoor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sorghum+bicolor+expression+atlas+reveals+dynamic+genotype-specific+expression+profiles+for+vegetative+tissues+of+grain,+sweet+and+bioenergy+sorghums.">A Sorghum bicolor expression atlas reveals dynamic genotype-specific expression profiles for vegetative tissues of grain, sweet and bioenergy sorghums.</a> BMC Plant Biology. 14, 35 (2014).</li><li>Yu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+reveals+key+differentially+expressed+genes+involved+in+wheat+grain+development.">Transcriptome analysis reveals key differentially expressed genes involved in wheat grain development.</a> Crop Journal. 4 (2), 92-106 (2016).</li><li>Kochevenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+QTL+hot+spots+for+malting+quality+in+two+elite+breeding+lines+with+distinct+tolerance+to+abiotic+stress.">Identification of QTL hot spots for malting quality in two elite breeding lines with distinct tolerance to abiotic stress.</a> BMC Plant Biology. 18 (1), 106 (2018).</li></ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

De beschreven methode levert zeer reproduceerbare resultaten voor hoogwaardige EN hoogwaardige RNA-extracten (figuur 1). Op basis van onze ervaring raden we drie biologische repliceert aan voor één genotype, stadium of voorwaarde voor analyse. Om statistisch zinvolle verschillen te kunnen detecteren, moet de algemene overvloed aan mRNA worden overwogen. Houd er echter rekening mee dat een beginbedrag van 200 mg weefselmonsters vereist is in drievoud voor de RNA-extractiestap. Voor experimenten met een beperkte hoeveelheid monsters, zoals genetisch gemodificeerde plantaardige materialen, is deze methode dus mogelijk niet geschikt.
Tijdens microarray hybridisatie zijn de volgende stappen het meest kritisch: (1) het laden van de monsters naar de pakkingdia (stap 4.7) en (2) het wassen van de arrays na hybridisatie (stappen 4.13 en 4.14). Monster laden moet zeer zorgvuldig worden gedaan om te voorkomen dat bellen vorming en vloeistof morsen. Voorzichtigheid is geboden bij het aanbrengen van de microarray slide op de pakking schuif met de geladen monsters: de DNA-kant (met gevlekte sondes) moet naar beneden worden gericht om hybridisatie mogelijk te maken. Voor het wassen van de microarrays is de tweede wasstap bijzonder kritisch: hier moet het verwijderen van de dia's uit wasbuffer 2 heel langzaam worden uitgevoerd (10 s) om bufferartefacten op de dia's te voorkomen, wat kan interfereren met het verzamelen en analyseren van gegevens.
Om resultaten te ontvangen van het hybridisatie-experiment dat in aanmerking komt voor downstream bioinformatica-analyse, moet men een aantal belangrijke criteria volgen. Het QC-rapport, dat wordt gegenereerd na de uitvoering van het protocol hierboven, geeft een goed idee van wat moet worden verbeterd en welke gegevens zich in een bruikbare staat bevinden (figuur 3). De eerste ontvangen informatie is het gevisualiseerde raster (figuur 2). Hier kan men direct zien of alle gebieden voor de fluorescentie read-out goed zijn uitgelijnd. Als er een visueel detecteerbare verschuiving is, zal dit van invloed zijn op alle andere waarden (achtergrond, signaalintensiteit, enz.) en kan het uitlezen van deze chip niet worden gebruikt. Op het overzicht (Ruimtelijke Verdeling van alle Uitschieters) kan men gemakkelijk elke verontreiniging (bijvoorbeeld stof of haar) herkennen, die de uitkomst beïnvloedde. Vuil kan worden verwijderd door zachtjes blazen en opnieuw scannen van de chip. Het histogram van signaalplot zoals hierboven vermeld moet resulteren in een brede Gauss-vormige curve, met slechts kleine uitschieters (Figuur 2). Afhankelijk van het geanalyseerde weefsel (Figuur 1), kan deze curve er anders uitzien en kan verschijnen om twee pieken te hebben, of een overheersende piek met een schouder. Dit heeft geen invloed op de kwaliteit van de gegevens. Alleen een sterk verschoven piek, of hoge signalen aan de randen wijzen op problemen, zoals "groene monsters" (te hoge fluorescentie-intensiteit), die niet kunnen worden verwijderd door wassen en moet worden gemeld aan de chipfabrikant. Ook moet de "Ruimtelijke verdeling grafiek voor mediane signalen" variëren rond een gemeenschappelijke waarde. Dit moet in het bereik tussen 40 en 100, afhankelijk van de algemene intensiteit uitlezing van de geanalyseerde chip. Een andere belangrijke kwaliteitscontrole is de evaluatie van de piek in gegevens: De log-grafiek voor de piek in signalen moet resulteren in een lineaire en regelmatige lijn. Ten slotte geeft de tabel van "evaluatiestatistieken" een goed en betrouwbaar beeld van de ontvangen resultaten. Hier biedt de fabrikant een reeks waarden die kunnen worden geclassificeerd als Uitstekend, Goed en Evalueren (Figuur 3). Volgens onze ervaring kunnen sommige waarden niet altijd voor alle chips worden toegepast. Voor aangepaste chips voor rijst was de "nonControl-waarde" vaak buiten bereik, maar heeft dit geen aanzienlijke invloed op de verdere gegevensverwerking. Bovendien kan het bereik voor "NegControl" worden uitgebreid, op basis van weefsel, organisme en algemene output van de Chip tot <80. Het bereik voor evaluatie voor waarde E1 med CV kan worden uitgebreid tot <9, in plaats van <8 volgens onze ervaring. Hierna is een goede evaluatie van alle chip uitleesgegevens mogelijk. In het algemeen moet men altijd in gedachten houden dat onafhankelijke biologische repliceert altijd het meest betrouwbare resultaat geven.
Het voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden ligt in het feit dat het een kosteneffectieve, hoge doorvoermethode voor transcriptieprofilering vertegenwoordigt. Bovendien is de downstream data-analysepijplijn eenvoudiger en meer ingeburgerd. Ondanks voordelen zijn er bepaalde beperkingen van deze techniek, zoals het aantal genen dat kan worden geanalyseerd. De microarray kan alleen vergemakkelijken de analyse van genen eerder gespot sondes op de array. Daarom is deze techniek alleen van toepassing op plantensoorten met gesequenced genoom en volledig geannoteerde genen. We stellen ons voor dat de op microarray gebaseerde transcripties zeer nuttig en relevant zullen blijven, niet alleen voor genexpressieprofilering, maar ook voor andere downstream bio-informaticapijplijnen zoals analyses van genregulerende netwerken en transcriptome-brede associatiestudie.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/60602/obtaining-high-quality-transcriptome-data-from-cereal-seeds-modified">Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling</a>. Two&#160;author&#160;names were&#160;updated.
The&#160;names were&#160;corrected from:
Christianne&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreeenivasulu
to:
Christiane&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreenivasulu

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/60602/obtaining-high-quality-transcriptome-data-from-cereal-seeds-modified">Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling</a>. Two&#160;author&#160;names were&#160;updated.

Erratum: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Het transcriptoom vertegenwoordigt de volledige set ribonucleic zuur (RNA) transcripties uitgedrukt door het genoom van een organisme op een bepaald moment en in het bijzonder milieu- en groeiomstandigheden. Elke cel heeft zijn individuele transcriptoom, die zijn huidige fysiologische en metabolische toestand weerspiegelt. Een verzameling cellen afkomstig van een soortgelijk weefsel of orgaan wordt gebruikt in een typische transcriptome studie, maar single-cell en ruimtelijk opgelost transcriptomics worden steeds populairder1. Transcriptomische analyses beginnen met de extractie van het totale RNA uit een geselecteerd weefsel op een bepaald tijdstip, en in gedefinieerde groeiomstandigheden. Daartoe bevelen wij het gebruik aan van een nieuw ontwikkelde methode voor de extractie van totaal RNA uit monsters met een hoog zetmeel- of suikergehalte, zoals granen2. De vergelijking van transcriptomen tussen verschillende monsters resulteert in de identificatie van RNA moleculen met verschillende overvloed. Deze RNA moleculen worden beschouwd als differentieel uitgedrukte genen (DEG's). De overvloed aan transcripties afgeleid van specifieke markergenen kan vervolgens worden gebruikt om de ontwikkelingsstatus te schatten of de reactie van een organisme op omgevingsschommelingen te bepalen. Genen zonder detecteerbare veranderingen in hun transcript overvloed over de ontwikkelingstijd punten in studie worden vaak gebruikt als referentie of huishouding genen.
Het RNA wordt meestal gedetecteerd en gekwantificeerd door verschillende methoden, zoals Noordelijke blotting en kwantitatieve omgekeerde transcriptase polymerase kettingreactie (qRT-PCR), maar de huidige high-throughput transcriptomics methoden zijn sterk afhankelijk van nucleïnezuur hybridisatie met behulp van microarray technologie evenals RNA sequencing (RNA-Seq). RNA-Seq is erg populair op dit moment, omdat het biedt verschillende voordelen voor hoge doorvoer transcriptomic toepassingen zoals elders beoordeeld3,4. Hoewel een oudere technologie, genexpressie profilering met behulp van microarray chips wordt nog steeds op grote schaal gebruikt omdat het een meer gevestigde technologie, die minder van een achtergrond in de bio-informatica vereist. Vergeleken met RNA-Seq zijn de datasets gegenereerd uit microarray experimenten kleiner en gemakkelijker te analyseren. Bovendien is het kosteneffectiever, vooral als het gaat om grote steekproefnummers. In ons laboratorium gebruiken we routinematig transcriptieanalyses met behulp van de microarray-technologie om de rol te bepalen van centrale regelgevende hubs die de moleculaire netwerken en trajecten regelen die betrokken zijn bij de groei, ontwikkeling en stofwisseling van graankorrels5,6,7,8,9. We gebruiken het ook routinematig voor het uitvoeren van genoombrede genexpressieprofileringsstudies om een mechanistisch inzicht te krijgen in de reactie van granen op abiotische spanningen10, evenals bij het uitvoeren van transcriptome-brede associatie (TWAS) en linkagemappingstudies om genen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de kwaliteit van granen en voeding11,12. Andere groepen hebben ook gebruik gemaakt van de microarray technologie in het verstrekken van ontwikkeling-specifieke genexpressie atlas in gerst13, rijst14,15,16, sorghum17, en tarwe18.
Het doel van deze publicatie is om een korte tekstuele samenvatting en een gedetailleerde visuele beschrijving van de methode die we momenteel gebruiken in ons laboratorium voor de transcriptie profilering van granen met behulp van een Agilent microarray platform. Houd er rekening mee dat andere microarray-platforms beschikbaar zijn, maar niet in deze methode worden behandeld. We beginnen het protocol met een gedetailleerde beschrijving van RNA-extractie uit het ontwikkelen of ontkiemen van granen. Op basis van onze ervaring, het verkrijgen van een hoge kwaliteit en hoge kwantiteit transcriptome vatbaar voor downstream transcriptomic analyses is vaak de bottleneck bij het gebruik van graanzaad weefsels. We hebben verschillende commercieel beschikbare RNA-extractiekits geprobeerd, maar geen enkele heeft bevredigende resultaten opgeleverd. Daarom ontwikkelden we een chemisch extractieprotocol om een ruw RNA-extract te verkrijgen dat vervolgens wordt onderworpen aan kolomzuivering met behulp van een commercieel beschikbare kit. Met behulp van deze methode, we routinematig en reproduceerd verkrijgen van hoge kwaliteit RNA2 (Figuur 1), die kan worden gebruikt voor verschillende downstream-toepassingen om een transcriptome profiel te genereren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td>Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>To determine quality and quantity of RNA extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crushed ice maker</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>To keep samples on ice during sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar flask</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>Used as liquid nitrogen container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Hybridization Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5242</td>
			<td>Kit components: 
			2X Hi-RPM Hybridization Buffer 
			25X Fragmentation Buffer 
			10X Gene Expression Blocking Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Wash buffer Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5325</td>
			<td>Kit components: 
			Gene Expression Wash Buffer 1 
			Gene Expression Wash Buffer 2 
			Triton X-102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2545A</td>
			<td>Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization gasket slide kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534-60014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQAir air cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9866.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free paper, Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>KC34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Input Quick Amp Labeling Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-2305</td>
			<td>Kit components: 
			T7 Primer 
			5x First Strand Buffer 
			0.1M DTT 
			10 mM dNTP Mix 
			AffinityScript RNAse Block Mix 
			5x Transcription Buffer 
			NTP Mix 
			T7 RNA Polymerase Blend 
			Nuclease-free water 
			Cyanine 3-CTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spatula, small</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes, nuclease-free</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>2.0 mL and 1.5 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td>It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110-230V</td>
			<td>Any small incubator will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and pestle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td>Peqlab / Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>351900302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-Color RNA Spike-In Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5188-5282</td>
			<td>Kit components: 
			One color RNA Spike-Mix 
			Dilution Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ozone barrier slide cover kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2505-60550</td>
			<td>Optional but highly recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube, 0.2 mL, RNase-free</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>Z376426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A156.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, nuclease free, filter tips</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor set</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Extraction Buffer</td>
			<td>10 mM Tri-HCl pH 8.0 
			150 mM LiCl 
			50 mM EDTA 
			1.5% EDTA 
			15 ul/mL &#946;-mercaptoethanol</td>
			<td></td>
			<td>We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add &#946;-mercaptoethanol fresh daily</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Kit components: 
			RNeasy mini spin column (pink) 
			1.5 ml collection tubes 
			2 ml collection tubes 
			Buffer RLT 
			Buffer RW 
			Buffer RPE 
			Nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74904</td>
			<td>Kit components: 
			RNeasy mini spin column (pink) 
			QIAshredder spin column (purple) 
			1.5 ml collection tubes 
			2 ml collection tubes 
			Buffer RLT 
			Buffer RLC 
			Buffer RW1 
			Buffer RPE 
			Nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide holders for DNA microarray scanner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2505-60525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide staining dish with removable rack</td>
			<td>DWK Life Sciences 900200</td>
			<td>Fisher Scientific 08-812</td>
			<td>We recommend DWK Life Sciences Wheaton&#8482; Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultralow temperature freezer</td>
			<td>Various brand</td>
			<td></td>
			<td>Capable of storing sample at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds by a modified method for gene expression profiling

De karakterisering van genexpressie is afhankelijk van RNA kwaliteit. Bij het ontkiemen, ontwikkelen en rijpen van granen wordt de extractie van hoogwaardig RNA vaak belemmerd door een hoog zetmeel- en suikergehalte. Deze verbindingen kunnen zowel de opbrengst als de kwaliteit van het geëxtraheerde totale RNA verminderen. De verslechtering van de kwantiteit en de kwaliteit van het totale RNA kan vervolgens een aanzienlijke invloed hebben op de downstream-transcriptomische analyses, die mogelijk niet nauwkeurig de ruimtelijke en/of temporele variatie in het genexpressieprofiel van de geteste monsters weerspiegelen. In dit protocol beschrijven we een geoptimaliseerde methode voor de extractie van totaal RNA met voldoende kwantiteit en kwaliteit om te worden gebruikt voor de hele transcriptoomanalyse van granen. De beschreven methode is geschikt voor verschillende downstream toepassingen die worden gebruikt voor transcriptieprofilering van ontwikkelende, ontkiemende en rijpe granen. De methode van transcriptome profilering met behulp van een microarray platform wordt getoond. Deze methode is speciaal ontworpen voor genexpressie profilering van granen met beschreven genoomsequenties. De gedetailleerde procedure van microarray handling tot de uiteindelijke kwaliteitscontrole wordt beschreven. Dit omvat cDNA-synthese, cRNA-etikettering, microarray-hybridisatie, diascanning, functieextractie en validatie van gegevenskwaliteit. De gegevens gegenereerd door deze methode kan worden gebruikt om het transcriptoom van granen te karakteriseren tijdens de kieming, in verschillende stadia van de ontwikkeling van granen, of op verschillende biotische of abiotische stress voorwaarden. De hier gepresenteerde resultaten illustreren hoogwaardige transcriptiegegevens die vatbaar zijn voor downstream bio-informaticaanalyses, zoals de bepaling van differentieel uitgedrukte genen (DEG's), karakterisering van genregulerende netwerken en het uitvoeren van transcriptome-brede associatiestudie (TWAS).

Deze methode is geoptimaliseerd voor de winning van graanzaadmonsters die aanzienlijke hoeveelheden besmetzetmeel of -suikers bevatten. Het is ontworpen om totaal RNA te extraheren uit 24 zaadmonsters per dag. Het moet continu worden uitgevoerd in een dag, maar optionele stop-en pauzepunten worden geïdentificeerd in het hele protocol. Als alternatief kan de lezer gebruik maken van hun voorkeur RNA extractie kits of handmatige chemische extractie methode. Echter, op basis van onze eerdere ervaring, commercieel beschikbare plant RNA extractie kits zijn niet geschikt voor zaden als gevolg van aanzienlijke hoeveelheden zetmeel, eiwitten, suiker en / of lipide besmetting. In de beschreven methode wordt een chemische extractie van ruw RNA gevolgd door kolomzuivering met behulp van een commerciële RNA-extractiekit. Dit biedt meestal RNA met een hogere kwaliteit en opbrengst. Figuur 1 toont het resultaat van een BioAnalyzer-run om de kwaliteit van RNA-extractie te testen met behulp van de hier beschreven methode. De resultaten worden gepresenteerd voor gerstblad (monsters 1 en 2 met monsters van een laag zetmeelgehalte) en gerstzaden (monsters 3 en 4 die monsters met een hoog zetmeelgehalte weergeven). De RNA-integriteit (RIN) waarde voor alle monsters is 10.
Figuur 1 toont een representatieve gel van het gezuiverde RNA-extract, waarbij de kwaliteit werd getest met behulp van een Bioanalyzer. Monsters 1 en 2 zijn typische resultaten voor monsters met een laag zetmeelgehalte, zoals gerstbladeren, waarbij extra rRNA-banden van chloroplasten zichtbaar zijn. De monsters 3 en 4 zijn representatieve resultaten voor monsters met een hoog zetmeelgehalte, zoals gerstzaden, met 18S en 28S rRNA. Houd er rekening mee dat er geen geautomatiseerde RIN-waarde kan worden berekend voor groene plantenweefsels, zoals bladmonsters, als gevolg van chloroplastrRNA. Echter, de integriteit en hoge kwaliteit kan visueel worden vastgesteld door de afwezigheid van degradatieproducten, die meestal verschijnt als een laag moleculair uitstrijkje. De RIN-waarde voor monsters van zetmeelzaden met hoog zetmeel, zoals gerstzaden, is doorgaans 10 volgens het protocol dat in dit document wordt beschreven.
Daarnaast presenteren we hier ook een representatieve gegevens van een tijdcursus experiment van twee elite gerst inteelt lijnen (Sofiara en Victoriana) gebruikt voor de analyse van moutkwaliteit19. Tijdens het moutproces wordt zetmeel omgezet in suiker. Daarom vertegenwoordigen de monsters weefsels met verschillende verhoudingen zetmeel en suikergehalte. Aangezien het industriële moutproces vergelijkbaar is met het kiemproces, werden de transcripties van twee gerstlijnen, die verschillen in hun moutkwaliteit, geanalyseerd. RNAs werden geëxtraheerd uit ontkiemende zaden op 2, 24, 48, 72, 120, 144 en 196 uur na imbibition in biologische drievoud. De RNA voorbereiding en hybridisatie van de aangepaste gerst microarray chip werden uitgevoerd zoals hierboven beschreven. Figuur 2 geeft het genormaliseerde raster aan dat is afgelezen uit de microarray-hybridisatie die wordt gegeven in het rapport kwaliteitscontrole (QC)(figuur 3) en het histogramplot voor gedetecteerde signalen. Het raster geeft het voorbeeld van afgeleide signalen uit elke hoek van de chip, inclusief achtergrond- en spike-in uitleespunten die worden gebruikt voor kalibratie. Het histogram geeft de afwijking aan van detecteerbare stippen met respectievelijke signaalintensiteiten. Een succesvolle hybridisatie geeft een brede Gaussische curve met slechts kleine uitschieters zoals weergegeven in de figuur. Mislukte hybridisaties kunnen resulteren in een sterke verschuiving naar de ene kant ("groene monsters").
Ten slotte wordt een representatief resultaat van de aanvaardbare waarden weergegeven in kolom 4 van figuur 3. Om de betrouwbaarheid van de uitgevoerde experimenten aan te geven, worden de resultaten verder geëvalueerd met behulp van de GeneSpring-software. De verzamelde gegevens worden gepresenteerd als hoofdcomponentanalyse (PCA). De PCA integreert de waarden van geselecteerde stippen (genen) als vector. Het aantal geëvalueerde stippen dat wordt gebruikt kan variëren van enkele honderden tot de gehele chip en is afhankelijk van de gebruikte software. Elke chip (monster) resulteert in één waarde (vector) die het resultaat is van de geïntegreerde signaalintensiteiten voor de geanalyseerde stippen. Daarom geeft de relatieve positie in de grafiek (PCA) de gelijkenis van de monsters met elkaar aan. Hoe dichter de monsters zijn, hoe meer op elkaar lijken. Technische replica's moeten dichter bij elkaar liggen dan biologische, en biologische replicaties van een monster moeten dichter bij elkaar clusteren dan monsters uit verschillende tijdspunten, weefsels of omstandigheden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig1.jpg"> Figuur 1: Electroforese file run samenvatting verkregen na het controleren van de kwaliteit van RNA met Bioanalyzer. Monsters 1 en 2 zijn gerstbladweefsel zoals aangegeven door extra ribosomale banden van chloroplasten. Monsters 3 en 4 zijn gerstzaadweefsel met 18S en 28S rRNA-banden getoond. Een RIN-factor wordt niet altijd berekend voor groene weefsels zoals blad, maar volgens de gel is de kwaliteit van RNA zeer goed. De RIN-waarde voor de monsters 3 en 4 is 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig2.jpg"> Figuur 2: QC Rapport van succesvolle gerst microarray hybridisatie. A + geeft gedetecteerde signalen op het net aan vanuit alle hoeken van de chip. Het histogram toont het aantal signalen gecategoriseerd op basis van signaalintensiteit (fluorescentie) als logaritme na achtergrondaftrekking. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig3.jpg"> Figuur 3: Samenvatting van de kwaliteitscontrole (QC) na hybridisatie en scanning. De waarden voor de gehybridiseerde dia worden weergegeven in kolom 2 (waarde) en het bereik van acceptabele waarden wordt weergegeven in kolom 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Waskamervergadering</td>
			<td>Inhoud en label</td>
			<td>Purpose</td>
		</tr>
<tr>
<td>Schotel 1</td>
			<td>Leeg, laat op labbank tot de volgende dag</td>
			<td>Vul met Wash Buffer 1 de volgende dag, gebruikt om de microarray dia's demonteren</td>
		</tr>
<tr>
<td>Schotel 2</td>
			<td>Voeg een microarray schuifrek en een kleine magnetische roerstaaf toe; label met "Wash Buffer 1", laat op labbank tot de volgende dag</td>
			<td>Wordt gebruikt om de microarray-dia's de volgende dag te wassen met Wash Buffer 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Schotel 3</td>
			<td>Voeg een kleine magnetische roerstaaf toe, label met "Wash Buffer 2" en plaats in een 37 °C mini incubator.</td>
			<td>Wordt gebruikt om de microarray glijbanen te wassen met Wash Buffer 2 de volgende dag in de 37 °C mini incubator</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Bereiding van de waskamersamenstellingen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Stappen</td>
			<td>Schotel</td>
			<td>Buffer wassen</td>
			<td>Temperatuur</td>
			<td>Tijd</td>
		</tr>
<tr>
<td>Demontage</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">Ambient</td>
			<td rowspan="2">Zo snel mogelijk</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Stap 4.13)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eerste wasbeurt</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">Ambient</td>
			<td rowspan="2">1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Stap 4.14)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tweede wasbeurt</td>
			<td rowspan="2">3</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">37 °C</td>
			<td rowspan="2">1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Stap 4.15)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Incubatietemperatuur en tijd voor waskamersamenstellingen.

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling at JoVE.com

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Een methode voor transcriptome profilering van granen wordt gepresenteerd. De op microarray gebaseerde genexpressieprofilering begint met de isolatie van hoogwaardig totaal RNA uit granen en gaat verder met de generatie van cDNA. Na cRNA-etikettering en microarray hybridisatie worden aanbevelingen gedaan voor signaaldetectie en kwaliteitscontrole.

Het verkrijgen van hoogwaardige transcriptoomgegevens van graanzaden door middel van een gewijzigde methode voor genexpressieprofilering

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Deze microarray hybridisatiemethode is handig voor het vergelijken van een groot aantal monsters van een organisme met een bekend genoom. Vergeleken met een hoge doorvoer sequencing aanpak, de hoeveelheid gegevens gegenereerd door deze methode is veel gemakkelijker te hanteren en verder, het kan worden geanalyseerd in een meer kosteneffectieve manier. Het aantonen van de procedure zal Dr.Christiane Seiler een post-doctorale wetenschapper die werkzaam is in de onderzoeksgroep bij Rosis op de IPK in Gatersleben.Voordat u microarray-hybridisatie uitvoert met behulp van de genexpressiehybrideisatiekit, bereidt u 10X-blokkeringsmiddel volgens de specificaties van de fabrikant en aliquot het resulterende blokkeringsmiddel in 200 microlitervolumes. Bewaar vervolgens de blokkeringsagent bij min 20 graden Celsius tot gebruik. Op de dag van de microarray hybridisatie ontdooit u een 200 microliter van het 10X-blokkeringsmiddel op ijs en verwarmt u de hybridisatieoven tot 65 graden Celsius en een warmteblok tot 60 graden Celsius.Bereid de fragmentatiemix voor elk monster zoals beschreven door de fabrikant en meng de monsters voorzichtig op een vortex. Na het vortexen, kort spin de monsters in een microcentrifuge voordat het uitbroeden voor precies 30 minuten in de 60 graden Celsius warmteblok. Aan het einde van de incubatie, onmiddellijk afkoelen elke buis op ijs voor een minuut voor het stoppen van de fragmentatie met 25 microliters van 2X gen expressie hybridisatie buffer, hoge omwentelingen per minuut per buis.Meng met zachte pipetting, waarbij grote zorg om geen bubbels te introduceren, en centrifugeren de buizen in omgevingstemperatuur. Aan het einde van de spin onmiddellijk plaats alle buizen op ijs en laad elk monster in de microarray glijbaan zo snel mogelijk. Vervolgens langzaam afzien van 44 microliters van elke hybridisatie mix in het midden van elke pakking goed, zorg ervoor dat de invoering van bellen te voorkomen, en voeg 44 microliter hybridisatie buffer in een ongebruikte putten.Plaats onmiddellijk de microarray schuif in de juiste richting op de top van de pakking dia, waarbij ervoor wordt gezorgd dat er geen vloeistof morsen, en sluit de hybridisatie assemblage. Draai de montage om het ontbreken van stationaire luchtbellen te bevestigen en plaats de hybridisatiekamerassemblage in de ver hybridisatieoven rotator. Stel de rotatiesnelheid in op 10 omwentelingen per minuut en start de hybridisatie op 65 graden Celsius gedurende precies 17 uur.Terwijl de monsters zijn hybridiseren, bereiden drie wasschaal assemblages in de juiste wasbuffers zoals beschreven in de tabellen. Na precies 17 uur van hybridisatie, demonteren een hybridisatie kamer op een lab bank bekleed met pluisvrij papier en breng een microarray sandwich naar een schotel met wasbuffer een met de microarray barcode naar boven in een schuine positie zonder het onderdompelen van de hele dia in de buffer. Met behulp van tangen, scheiden van de twee glazen dia's en laat de pakking glijden zachtjes in de bodem van de schotel, terwijl het houden van een stevige greep op de microarray glijbaan.Til de microarray-schuif langzaam zijwaarts op voor onmiddellijke overdracht in het microarray-rek in schotel twee met een minimale blootstelling aan de lucht. Wanneer alle acht glijbanen gelijkmatig langs het rek zijn geplaatst, bevestigt u de rekhouder en breng u de gehele schotel twee opstelling aan de magneetroerder. Roer de setup precies één minuut zachtjes.Terwijl de monsters worden geroerd, breng schotel drie van de 37 graden Celsius incubator op een tweede magnetische roerder. Voeg vervolgens voorzichtig 37 graden Celsius wasbuffer twee tot schotel drie zonder het vormen van bellen. Breng aan het einde van de roerende incubatie het schuifrek voorzichtig en langzaam over op schotel drie en verwijder de rekhouder.Na het roeren voor precies een minuut, langzaam en voorzichtig verwijder de schuifrek uit de schotel en gebruik pluisvrij papier om zorgvuldig te drogen beide zijden van elke dia, het plaatsen van elke dia in een diadoos als het wordt gedroogd. Nadat de dia's 15 minuten hebben laten drogen, brengt u elke microarray-dia in een diahouder met de streepjescode naar boven en laadt u de geassembleerde schuifhouders in een scancarrousel en volgorde volgens het streepjescodenummer. Scan vervolgens onmiddellijk de dia's.In dit cijfer wordt een representatief resultaat van een run getoond om de kwaliteit van RNA-extractie te testen. In typische analyses van monsters met een laag zetmeelgehalte, zoals gerstbladeren, zijn extra ribosomale RNA-banden van chloroplasten zichtbaar. Monsters met een hoog zetmeelgehalte, zoals gerstzaden, vertonen 18 en 28S ribosomale RNA.Houd er rekening mee dat er geen geautomatiseerde RNA-integriteitsnummerwaarde kan worden berekend voor groene plantenweefsels, zoals bladmonsters, als gevolg van chloroplast ribosomale RNA. In deze representatieve analyse werden een RNA-voorbereiding en hybridisatie naar een op maat gemaakte gerstmicroarray-chip uitgevoerd zoals aangetoond. Het raster toont een voorbeeld van afgeleide signalen uit elke hoek van de chip, inclusief achtergrond en piek in uitleespunten die worden gebruikt voor kalibratie.Het histogram geeft de afwijking aan van detecteerbare stippen met respectievelijke signaalintensiteiten. Zoals waargenomen, een succesvolle hybridisatie geeft een brede Gaussian-vormige curve met slechts kleine uitschieters. Hier wordt het kwaliteitscontrolerapport voor gedetecteerde signalen weergegeven.De waarden voor de gehybridiseerde dia worden gegeven in kolom twee en het bereik van aanvaardbare waarden wordt weergegeven in kolom vier. Deze methode kan worden gebruikt voor het aanpakken van elk experimenteel opgezet voor elk organisme waar substantiële informatie over het genoom beschikbaar is. Met behulp van deze techniek in ons lab konden we transcriptomische veranderingen in rijst en gerst die optreden na groeistress inductie vergelijken en analyseren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Een efficiënte methode voor het isoleren van zeer gezuiverde RNA uit zaden voor gebruik in Quantitative Analysis Transcriptome

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Een filtratie-gebaseerde methode om hoogwaardige kernen uit kruisgebonden skeletspier voor chromatine immunoprecipitatie te bereiden

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Cafeïne-extractie, enzymatische activiteit en genexpressie van cafeïne Synthase uit plantaardige cel schorsingen

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

Biosynthese van een Flavonol van een Flavanone door het opzetten van een One-pot Bienzymatische Cascade

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering en identificatie geïllustreerd door angiotensine II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA-sequentie herkenning door DNA primase met behulp van high-throughput Primase profilering

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Hoge-resolutie Complexome profilering door Cryoslicing BN-MS analyse

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

Bereiding van kwalitatief hoogwaardig gefermenteerd visproduct

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...