Name: obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds by a modified method for gene expression profiling
Uploaded: 2020-05-21T13:00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling at JoVE.com

העבודה הזאת נתמכת תחת CGIAR האזור נושאים Agri אורז מערכת מזון CRP, אורז, המתח עמידים בפני אפריקה ודרום אסיה (STRASA) שלב III, ו-IZN (המרכז הבינתחומי לחקר הצמח יבול, האלה (Saale), גרמניה. אנו מודים למנדי לגבי הסיוע הטכני המעולה שלה וד ר איזבל מריה מורה-רמירז על שיתוף מידע וניסיון עם שבב החיטה. אנו מודים לד ר רונדה מאייר (RG הטרוזיס, IPK Gatersleben, גרמניה) להערות ולקריאת כתב היד באורח קשה.

<ol>
	<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+intact-tissue+sequencing+of+single-cell+transcriptional+states.">Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li><li>P&#252;ffeld, M., Seiler, C., Kuhlmann, M., Sreenivasulu, N., Butardo, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Developing+Rice+Grain+Transcriptome+Using+the+Agilent+Microarray+Platform.">Analysis of Developing Rice Grain Transcriptome Using the Agilent Microarray Platform.</a> Methods in Molecular Biology. 1892, 277-300 (2019).</li><li>Martin, L., Fei, Z., Giovannoni, J., Rose, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalyzing+plant+science+research+with+RNA-seq.">Catalyzing plant science research with RNA-seq.</a> Frontiers in Plant Science. 4 (66), (2013).</li><li>Hrdlickova, R., Toloue, M., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+methods+for+transcriptome+analysis.">RNA-Seq methods for transcriptome analysis.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).</li><li>Radchuk, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+profiling+of+starch+biosynthesis+and+degradation+in+the+developing+barley+grain.">Spatiotemporal profiling of starch biosynthesis and degradation in the developing barley grain.</a> Plant Physiology. 150 (1), 190-204 (2009).</li><li>Sreenivasulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+of+seeds:+deciphering+the+molecular+mechanisms+of+seed+storage,+dormancy+and+onset+of+germination.">Systems biology of seeds: deciphering the molecular mechanisms of seed storage, dormancy and onset of germination.</a> Plant Cell Reports. 36 (5), 633-635 (2017).</li><li>Sreenivasulu, N., Wobus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed-development+programs:+a+systems+biology-based+comparison+between+dicots+and+monocots.">Seed-development programs: a systems biology-based comparison between dicots and monocots.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 189-217 (2013).</li><li>Butardo, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+Genetics+Identifies+a+Novel+Regulatory+Domain+of+Amylose+Synthesis.">Systems Genetics Identifies a Novel Regulatory Domain of Amylose Synthesis.</a> Plant Physiology. 173 (1), 887-906 (2017).</li><li>de Guzman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+glycemic+potential+of+rice+by+unraveling+compositional+variations+in+mature+grain+and+starch+mobilization+patterns+during+seed+germination.">Investigating glycemic potential of rice by unraveling compositional variations in mature grain and starch mobilization patterns during seed germination.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5854 (2017).</li><li>Sreenivasulu, N., Sunkar, R., Wobus, U., Strickert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+platforms+and+bioinformatics+tools+for+the+analysis+of+plant+transcriptome+in+response+to+abiotic+stress.">Array platforms and bioinformatics tools for the analysis of plant transcriptome in response to abiotic stress.</a> Methods in Molecular Biology. 639, 71-93 (2010).</li><li>Anacleto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+a+genome-wide+association+study+with+a+large-scale+transcriptome+analysis+to+predict+genetic+regions+influencing+the+glycaemic+index+and+texture+in+rice.">Integrating a genome-wide association study with a large-scale transcriptome analysis to predict genetic regions influencing the glycaemic index and texture in rice.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2018).</li><li>Pietsch, C., Sreenivasulu, N., Wobus, U., Roder, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+mapping+of+putative+regulator+genes+of+barley+grain+development+characterized+by+expression+profiling.">Linkage mapping of putative regulator genes of barley grain development characterized by expression profiling.</a> BMC Plant Biology. 9, 4 (2009).</li><li>Druka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+gene+expression+from+seed+to+seed+through+barley+development.">An atlas of gene expression from seed to seed through barley development.</a> Functional &amp; Integrative Genomics. 6 (3), 202-211 (2006).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+Expression+Atlas+In+Reproductive+Development.">Rice Expression Atlas In Reproductive Development.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (12), 2060-2081 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+gene+expression+atlas+covering+the+entire+life+cycle+of+rice.">A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice.</a> The Plant Journal. 61 (5), 752-766 (2010).</li><li>Yamakawa, H., Hakata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+rice+grain+filling-related+metabolism+under+high+temperature:+Joint+analysis+of+metabolome+and+transcriptome+demonstrated+inhibition+of+starch+accumulation+and+induction+of+amino+acid+accumulation.">Atlas of rice grain filling-related metabolism under high temperature: Joint analysis of metabolome and transcriptome demonstrated inhibition of starch accumulation and induction of amino acid accumulation.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (5), 795-809 (2010).</li><li>Shakoor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sorghum+bicolor+expression+atlas+reveals+dynamic+genotype-specific+expression+profiles+for+vegetative+tissues+of+grain,+sweet+and+bioenergy+sorghums.">A Sorghum bicolor expression atlas reveals dynamic genotype-specific expression profiles for vegetative tissues of grain, sweet and bioenergy sorghums.</a> BMC Plant Biology. 14, 35 (2014).</li><li>Yu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+reveals+key+differentially+expressed+genes+involved+in+wheat+grain+development.">Transcriptome analysis reveals key differentially expressed genes involved in wheat grain development.</a> Crop Journal. 4 (2), 92-106 (2016).</li><li>Kochevenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+QTL+hot+spots+for+malting+quality+in+two+elite+breeding+lines+with+distinct+tolerance+to+abiotic+stress.">Identification of QTL hot spots for malting quality in two elite breeding lines with distinct tolerance to abiotic stress.</a> BMC Plant Biology. 18 (1), 106 (2018).</li></ol>

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

השיטה המתוארת מספקת תוצאות מובנות מאוד עבור תמציות מניב ובאיכות גבוהה של RNA (איור 1). בהתבסס על הניסיון שלנו, אנו ממליצים על שלושה משכפל ביולוגי עבור גנוטיפ אחד, שלב או תנאי לניתוח. כדי להיות מסוגל לזהות הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית, השפע הכללי של mRNA חייב להיחשב. שים לב, עם זאת, כמות ההתחלתית של 200 מ"ג דגימות רקמות נדרש בטריליטים עבור צעד החילוץ RNA. מכאן, עבור ניסויים כי יש כמות מוגבלת של דגימות כגון חומרי צמח מהונדסים גנטית, שיטה זו לא יכול להיות מתאים.
במהלך היברידיזציה של microarray, השלבים הבאים הם הקריטיים ביותר: (1) טעינת הדגימות לשקופית האטם (שלב 4.7) ו-(2) שטיפת המערכים לאחר הכלאה (שלבים 4.13 ו-4.14). העמסה לדוגמה צריכה להיעשות בזהירות רבה כדי למנוע היווצרות בועות ושפיכת נוזלים. זהירות היא הכרחית בעת הצבת שקופית המיקרו-מערך בשקופית האטם המכילה את הדגימות שנטענו: ה-DNA-side (עם הבדיקות השנצפו) צריך להיות מפונה כלפי מטה כדי לאפשר היברידיזציה. עבור שטיפת מיקרו מערכים, צעד השטיפה השני הוא קריטי במיוחד: כאן, הסרת השקופיות ממאגר לשטוף 2 צריך להתבצע באיטיות רבה (10 s) כדי למנוע פריטים במאגר על השקופיות, אשר יכול להפריע לרכישת נתונים וניתוחים.
כדי לקבל תוצאות מן הניסוי היברידיזציה הזכאים לניתוח מטה-זרם בביואינפורמטיקה, יש לעקוב אחר מספר קריטריונים חשובים. דוח ה-QC, המופק לאחר ביצוע הפרוטוקול לעיל, מספק מושג טוב מה יש לשפר ואילו נתונים נמצאים במצב שמיש (איור 3). המידע הראשון שהתקבל הוא רשת דמיינו (איור 2). כאן, ניתן לראות ישירות אם כל האזורים של הקריאה הפלואורסצנטית מיושרים כראוי. אם יש משמרת חזותית הניתנת לזיהוי, פעולה זו תשפיע על כל שאר הערכים (רקע, עוצמת אות, וכו ') ואין אפשרות להשתמש בקריאה מתוך שבב זה. על הסקירה (התפלגות מרחבית של כל מיירס), ניתן בקלות לזהות כל זיהום (למשל, אבק או שיער), אשר השפיעו על התוצאה. עפר ניתן להסיר על ידי נושבת בעדינות וסריקה מחדש של השבב. ההיסטוגרמה של מגרש האותות כאמור לעיל אמורה להביא לעקומה רחבה בצורת גאוס, עם מגרש מינורי בלבד (איור 2). בהתאם לרקמה שנותחה (איור 1), עיקול זה יכול להיראות שונה והוא יכול להיות מופיע שתי פסגות, או שיא השולט אחד עם הכתף. פעולה זו לא תשפיע על איכות הנתונים. רק שיא חזק זז, או אותות גבוהים על הקצוות מצביעים על בעיות, כגון "מפלצות ירוקות" (גבוה מדי כוונות זריחה), אשר לא ניתן להסירו על ידי כביסה ויש לדווח ליצרן השבב. כמו כן, "גרף הפצה מרחבית עבור אותות חציון" צריך להשתנות סביב ערך משותף. זה צריך להיות בטווח בין 40 ו 100, בהתאם לעוצמת הבדיקה הכללית של השבב ניתח. בקרת איכות חשובה נוספת היא הערכה של היתד בנתונים: גרף הרישום של הדקר באותות צריך להביא לקו רגיל וליניארי. לבסוף, הטבלה של "מדדי הערכה" מעניקה תצוגה טובה ואמינה של התוצאות שהתקבלו. כאן היצרן מספק מגוון של ערכים אשר ניתן לסווג כמעולה, טוב ולהעריך (איור 3). על פי הניסיון שלנו, לא תמיד ניתן להחיל חלק מהערכים עבור כל האסימונים. עבור שבבים מותאמים אישית של אורז, "ערך שאינו בקרת" היה לעתים קרובות מחוץ לטווח אך אינו משפיע באופן משמעותי על עיבוד נתונים נוסף. בנוסף, הטווח עבור "שליטה" ניתן להאריך, בהתבסס על רקמות, אורגניזם ופלט כללי של השבב כדי < 80. היקף ההערכה עבור הערך E1 med CV יכול להיות מורחב ל< 9, במקום < 8 על פי הניסיון שלנו. לאחר מכן, הערכה נכונה של כל השבב לקרוא את הנתונים הוא אפשרי. באופן כללי, צריך תמיד לזכור ששכפל ביולוגי עצמאי תמיד נותן את התוצאה האמינה ביותר.
היתרון של טכניקה זו בהשוואה לשיטות אחרות טמון בעובדה שהוא מייצג שיטה חסכונית בתפוקה גבוהה ליצירת פרופיל מתאים. כמו-כן, הצינור לניתוח נתונים במורד הזרם קל ומבוסס יותר. למרות היתרונות, ישנן מגבלות מסוימות של טכניקה זו, כגון מספר הגנים שניתן לנתח. המיקרו מערך יכול רק להקל על ניתוח של גנים שנצפו בעבר בדיקות על המערך. לכן, טכניקה זו ישימה רק על מינים צמח עם גנום רציף וגנים מסומן במלואו. אנו לדמיין כי מיקרוarray מבוססי transcript מבוסס ימשיך להיות מאוד שימושי ורלוונטי לא רק לפרופיל ביטוי גנים אלא גם עבור אחרים הזרם ביואינפורמטיקה צינורות כגון ניתוח גנטי של הרשת ומחקר שיוך ברחבי העולם.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/60602/obtaining-high-quality-transcriptome-data-from-cereal-seeds-modified">Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling</a>. Two&#160;author&#160;names were&#160;updated.
The&#160;names were&#160;corrected from:
Christianne&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreeenivasulu
to:
Christiane&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreenivasulu

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/60602/obtaining-high-quality-transcriptome-data-from-cereal-seeds-modified">Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling</a>. Two&#160;author&#160;names were&#160;updated.

Erratum: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Transcript מייצג את הערכה המלאה של חומצה ריבונוקלאית (RNA) התעתיקים המבוטא על ידי הגנום של אורגניזם בזמן נתון ובתנאים סביבתיים וצמיחה מסוימים. כל תא יש החוצה הפרט שלו, אשר משקף הפיזיולוגית הנוכחית המצב המטבולית. אוסף של תאים שנגזר רקמה דומה או איבר משמש במחקר הטרנססקריפט טיפוסי, אבל תא בודד ו-spatially נפתר הטרנססקריפט מקבל הפופולרי1. הניתוחים הטרנסקריפטאריים מתחילים בהפקת ה-RNA הכולל מרקמה שנבחרה בנקודת זמן מסוימת, ובתנאי גדילה מוגדרים. למטרה זו, אנו ממליצים על שימוש בשיטה שפותחה לאחרונה להפקת RNA הכולל מדגימות גבוהות של עמילן או תוכן סוכר, כגון זרעי דגנים2. השוואת הטראנטוסקריפט בין דגימות שונות מביא לזיהוי מולקולות RNA עם שפע שונה. מולקולות RNA אלה נחשבות לגנים בעלי התבטאות מהותית (DEGs). השפע של התעתיקים נגזר גנים סמן ספציפיים לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להעריך את הסטטוס ההתפתחותי או לקבוע את התגובה של אורגניזם לתנודות סביבתיות. גנים עם שינויים שאין לגילוי ב תעתיק שלהם על פני נקודות הזמן ההתפתחותיות תחת המחקר משמשות לעתים קרובות כהתייחסות או שירות הגנים.
RNA מזוהה בדרך כלל וככמת על-ידי שיטות שונות, כגון בלוק הצפון והיפוך כמותי התגובה שרשרת פולימראז (רביעיית-PCR), אבל שיטות התפוקה הגבוהה הנוכחי הטרנססקריפט מסתמכים בכבדות על הכלאה חומצות גרעין באמצעות טכנולוגיית microarray, כמו גם ברצף RNA (RNA-Seq). רנ א-Seq הוא מאוד פופולרי בהווה משום שהוא מספק מספר יתרונות עבור התפוקה הגבוהה העברת יישומים הטרנססקריפט כפי שנבדקו במקומות אחרים3,4. למרות שטכנולוגיה ישנה יותר, ביטוי גנטי הפרופיל באמצעות שבבי microarray עדיין נמצא בשימוש נרחב משום שהיא טכנולוגיה מבוססת יותר, הדורשת פחות רקע בביואינפורמטיקה. בהשוואה ל-RNA-Seq, ערכות הנתונים שנוצרו מניסויי microarray קטנות וקל יותר לנתח. בנוסף, היא חסכונית יותר, במיוחד אם מתמודדים עם מספרים גדולים לדוגמה. במעבדה שלנו, אנו משתמשים באופן שוטף בניתוחי טראנסקריפט באמצעות טכנולוגיית microarray כדי לקבוע את התפקיד של מרכזי רגולציה מרכזיים השולטים על הרשתות המולקולריות ומסלולים המעורבים בצמיחה, פיתוח ומטבוליזם של דגנים5,6,7,8,9. כמו כן, אנו משתמשים בו באופן שגרתי כדי לנהל את הגנום-wide ביטוי ליצירת פרופיל מחקרים כדי להשיג הבנה מכניסטית של התגובה של דגנים דגנים לחצים אביוטיים10, כמו גם בהתנהלות של האגודה הטרנססקריפט-רחב (מעשה) ואת מיפוי ההצמדה לזהות גנים האחראים איכות דגנים ותזונה11,12 קבוצות אחרות השתמשו גם בטכנולוגיית microarray במתן ביטוי גן ספציפי לפיתוח אטלס בשעורה13,אורז 14,15,16, דורה17, חיטה18.
מטרת פרסום זה היא לספק תקציר מילולי קצר ותיאור חזותי מפורט של השיטה שאנו מעסיקים כרגע במעבדה שלנו ליצירת פרופיל הטרנססקריפט של גרגרי הדגנים באמצעות פלטפורמת מיקרוarray של Agilent. שים לב כי פלטפורמות מיקרוarray אחרות זמינות, אך לא יהיו מכוסות בשיטה זו. אנו מתחילים את הפרוטוקול על ידי הצגת תיאור מפורט של הפקת RNA מפיתוח או מונטינג זרעי דגנים. בהתבסס על הניסיון שלנו, קבלת באיכות גבוהה וכמות גבוהה להמרה מוכן לניתוחים הטרנססקריפט במורד הדרך היא לעתים קרובות צוואר הבקבוק בעת שימוש ברקמות זרעי דגנים. ניסינו כמה ערכות החילוץ RNA מסחרית זמין, אבל אף אחד לא סיפק תוצאות משביעות רצון. מכאן, פיתחנו פרוטוקול החילוץ הכימי כדי לקבל תמצית RNA גולמי כי הוא נתון לטיהור טור באמצעות ערכה מסחרית זמין. באמצעות שיטה זו, אנו באופן שגרתי ובאופן שוטף לקבל באיכות גבוהה RNA2 (איור 1), אשר יכול לשמש יישומים שונים במורד הזרם כדי ליצור פרופיל transcript.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td>Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>To determine quality and quantity of RNA extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crushed ice maker</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>To keep samples on ice during sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar flask</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>Used as liquid nitrogen container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Hybridization Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5242</td>
			<td>Kit components: 
			2X Hi-RPM Hybridization Buffer 
			25X Fragmentation Buffer 
			10X Gene Expression Blocking Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Wash buffer Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5325</td>
			<td>Kit components: 
			Gene Expression Wash Buffer 1 
			Gene Expression Wash Buffer 2 
			Triton X-102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2545A</td>
			<td>Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization gasket slide kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534-60014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQAir air cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9866.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free paper, Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>KC34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Input Quick Amp Labeling Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-2305</td>
			<td>Kit components: 
			T7 Primer 
			5x First Strand Buffer 
			0.1M DTT 
			10 mM dNTP Mix 
			AffinityScript RNAse Block Mix 
			5x Transcription Buffer 
			NTP Mix 
			T7 RNA Polymerase Blend 
			Nuclease-free water 
			Cyanine 3-CTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spatula, small</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes, nuclease-free</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>2.0 mL and 1.5 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td>It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110-230V</td>
			<td>Any small incubator will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and pestle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td>Peqlab / Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>351900302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-Color RNA Spike-In Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5188-5282</td>
			<td>Kit components: 
			One color RNA Spike-Mix 
			Dilution Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ozone barrier slide cover kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2505-60550</td>
			<td>Optional but highly recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube, 0.2 mL, RNase-free</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>Z376426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A156.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, nuclease free, filter tips</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor set</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Extraction Buffer</td>
			<td>10 mM Tri-HCl pH 8.0 
			150 mM LiCl 
			50 mM EDTA 
			1.5% EDTA 
			15 ul/mL &#946;-mercaptoethanol</td>
			<td></td>
			<td>We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add &#946;-mercaptoethanol fresh daily</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Kit components: 
			RNeasy mini spin column (pink) 
			1.5 ml collection tubes 
			2 ml collection tubes 
			Buffer RLT 
			Buffer RW 
			Buffer RPE 
			Nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74904</td>
			<td>Kit components: 
			RNeasy mini spin column (pink) 
			QIAshredder spin column (purple) 
			1.5 ml collection tubes 
			2 ml collection tubes 
			Buffer RLT 
			Buffer RLC 
			Buffer RW1 
			Buffer RPE 
			Nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide holders for DNA microarray scanner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2505-60525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide staining dish with removable rack</td>
			<td>DWK Life Sciences 900200</td>
			<td>Fisher Scientific 08-812</td>
			<td>We recommend DWK Life Sciences Wheaton&#8482; Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultralow temperature freezer</td>
			<td>Various brand</td>
			<td></td>
			<td>Capable of storing sample at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds by a modified method for gene expression profiling

אפיון הביטוי הגנטי תלוי באיכות ה-RNA. ב מונטינג, פיתוח ובוגרת זרעי דגנים, הפקת רנ א באיכות גבוהה מפריע לעתים קרובות עמילן גבוה ותוכן סוכר. תרכובות אלה יכולים להפחית הן את התשואה ואת איכות ה-RNA הכולל שחולצו. הידרדרות בכמות ובאיכות של RNA סה כ יכול לאחר מכן יש השפעה משמעותית על ניתוחים המטה במורד הזרם, אשר עשוי לא לשקף במדויק את וריאציה מרחבית ו/או הזמני בפרופיל ביטוי גנים של דגימות נבדק. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה ממוטבת להפקת ה-RNA הכולל עם כמות ואיכות מספיקים שישמשו לניתוח הטרנססקריפט המלא של גרגרי הדגנים. השיטה המתוארת מתאימה למספר יישומי במטה המשמשים ליצירת פרופיל טרנססקריפט לפיתוח, הנבחנות וזרעי דגנים בוגרים. השיטה ליצירת פרופיל באמצעות פלטפורמת microarray מוצגת. שיטה זו מיועדת במיוחד עבור פרופיל ביטוי גנים של דגנים עם רצפי הגנום תיאר. ההליך המפורט מטיפול במיקרו-מערך לבקרת איכות סופי מתואר. זה כולל סינתזה cDNA, התוויות cRNA, היברידיזציה microarray, סריקת שקופיות, הפקת תכונה, ואימות איכות הנתונים. ניתן להשתמש בנתונים שנוצרו על-ידי שיטה זו כדי לאפיין את ההמרה של דגני הבוקר במהלך הנביטה, בשלבים שונים של התפתחות הדגן, או במצבי סטרס ביוטיים שונים. התוצאות המוצגות כאן מדגימה מידע באיכות גבוהה להמרה של נתונים לניתוח ביואינפורמטיקה, כגון קביעת הגנים המתבטאים (DEGs), שייכות לרשתות הרגולטוריות של הגנים, וניצוח על מחקר ההתאגדות ברחבי העולם.

שיטה זו ממוטבת להפקת דגימות זרעי דגנים המכילות כמויות משמעותיות של עמילן או סוכרים מזהם. הוא נועד לחלץ RNA סך של 24 דגימות זרעים ליום. זה צריך להתבצע ברציפות ביום אחד, אבל נקודות עצירה אופציונלי והפסקה מזוהים במהלך הפרוטוקול. לחילופין, הקורא יכול להשתמש שלהם ערכות החילוץ המועדף RNA או שיטת החילוץ כימית ידנית. עם זאת, בהתבסס על הניסיון הקודם שלנו, הצמח זמין מסחרית ערכות החילוץ RNA לא מתאים לזרעים בשל כמויות משמעותיות של עמילן, חלבונים, סוכר ו/או זיהום השומנים. בשיטה המתוארת, הוצאה כימית של רנ א גולמי היא אחריה טיהור טור באמצעות ערכת החילוץ RNA מסחרי. זה בדרך כלל מספק RNA עם איכות גבוהה יותר ותשואה. איור 1 מציג את התוצאה של הפעלת bioanalyzer כדי לבדוק את האיכות של הפקת RNA באמצעות השיטה המתוארת כאן. התוצאות מוצגות לעלה שעורה (דוגמאות 1 ו-2 המייצגות דגימות תוכן של עמילן נמוך) וזרעי שעורה (דגימות 3 ו-4 המייצגים דגימות תוכן של עמילן גבוה). ערך שלמות ה-RNA (RIN) עבור כל הדגימות הוא 10.
איור 1 מראה ג'ל מייצג של תמצית RNA מטוהרים, שם האיכות נבדקה באמצעות bioanalyzer. דגימות 1 ו-2 הן תוצאות אופייניות לדגימות תוכן של עמילן נמוך כגון עלי שעורה, כאשר להקות rRNA נוספות מהכללוסיקות מופיעות בבירור. דגימות 3 ו-4 הן תוצאות מייצגות לדגימות גבוהה עמילן התוכן כגון זרעי שעורה, מציג 18S ו-28S rRNA. אנא שימו לב כי לא ניתן לחשב את ערך RIN האוטומטי עבור רקמות צמחים ירוקות כגון דגימות עלה, בשל rRNA האחרון. עם זאת, היושרה והאיכות הגבוהה יכולים להיות מתוברר באופן חזותי על-ידי העדר מוצרי השפלה, המופיעים בדרך כלל ככתם מולקולרי נמוך. ערך RIN לדגימות הזרעים של העמילן הגבוה כגון זרעי שעורה הוא בדרך כלל 10 באמצעות הפרוטוקול המתואר במאמר זה.
בנוסף, אנו מציגים כאן גם נתונים מייצגים של ניסוי מסלול הזמן של שתי שעורה העילית של השעורה (sofiara ו ויקטוריה) משמש לניתוח של איכות מרטיבים19. במהלך תהליך ההמלט, העמילן מומר לסוכר. לכן, הדגימות מייצגות רקמות במידות שונות של עמילן ותכולת הסוכר. כאשר תהליך המלט התעשייתי דומה לתהליך הנביטה, נותחו משני קווי שעורה, שונים באיכותם המלבתם. RNAs נלקחו זרעים מונגטינג ב 2, 24, 48, 72, 120, 144 ו 196 h לאחר שתיית במהלך טריפליטים ביולוגיים. הכנת ה-RNA והכלאה של שבב מיקרוarray השעורה המותאם אישית בוצעו כמתואר לעיל. איור 2 מציין את הרשת המנורמלת שנקראה מתוך הכלאה של המיקרו-מערך הניתנים בדוח בקרת האיכות (איור 3) ומתווה ההיסטוגרמה עבור אותות שזוהו. הרשת מעניקה דוגמה של אותות נגזרים מכל פינה של השבב, כולל רקע וספייק-in לקרוא נקודות המשמשות כיול. ההיסטוגרמה מציינת את הסטייה של נקודות הזיהוי עם עוצמות האות המתאימות. הכלאה מוצלחת נותן עקומת גאוסיאנית רחבה עם החוצה מינור בלבד כפי שמוצג באיור. ימינליות שנכשלו יכול לגרום לתזוזה חזקה לקראת צד אחד ("מפלצות ירוקות").
לבסוף, תוצאה מייצגת של הערכים המקובלים מוצגת בטור 4 מתוך איור 3. כדי לציין את המהימנות של הניסויים שבוצעו, התוצאות מוערכות עוד יותר באמצעות תוכנת גנספרינג. הנתונים שנאספו מוצגים כניתוח רכיבים ראשיים (PCA). PCA משלבת את הערכים של נקודות נבחרות (גנים) כמו וקטור. מספר הנקודות המוערכות בהן נעשה שימוש יכול להשתנות ממספר מאות לשבב כולו והוא תלוי בתוכנה שבשימוש. כל שבב (מדגם) יוצר ערך אחד (וקטור) שנבע מעוצמות האות המשולבות של הנקודות שנותחו. לכן, המיקום היחסי בגרף (PCA) מציין את הדמיון בין הדגימות זה לזה. , ככל שדגימות מתקרבות. כך הן דומות יותר משכפל טכני צריך להיות קרוב יותר מאשר אלה ביולוגיים, ומשכפל ביולוגי של מדגם צריך לקבץ קרוב יותר יחד, מאשר דגימות מנקודות זמן שונות, רקמות או תנאים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig1.jpg"> איור 1: הקובץ האלקטרופורזה בניתוח מתקבל לאחר בדיקת האיכות של RNA עם Bioanalyzer. דגימות 1 ו-2 הם רקמת עלה שעורה כפי שמצוין על ידי להקות ריבוזומתיים נוספות של כלורלופור. דגימות 3 ו-4 הם שעורה רקמת זרע עם 18S ו 28 rRNA להקות המוצג. גורם מרין אינו מחושב תמיד עבור רקמות ירוקות כגון עלה אבל על פי ג'ל, איכות ה-RNA הוא טוב מאוד. ערך רין לדגימות 3 ו-4 הוא 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig2.jpg"> איור 2: מערכת QC מצליחה מהכלאה של מיקרושעורה מוצלחת. A + מציין אותות שאותרו על הרשת מכל הפינות של השבב. ההיסטוגרמה מציגה את מספר האותות המסווגים לפי עוצמת אות (פלואורסצנטית) כלוגריתם לאחר חיסור רקע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig3.jpg"> איור 3: סיכום בקרת איכות (QC) לאחר הכלאה וסריקה. הערכים עבור שקופית הוכלא ניתנים בעמודה 2 (ערך) וטווח הערכים המקובלים מוצג בעמודה 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שוטפים את האסיפה הקאמרית</td>
			<td>תוכן ותווית</td>
			<td>מטרה</td>
		</tr>
<tr>
<td>מנה ראשונה</td>
			<td>ריק, השאר בספסל המעבדה עד היום הבא</td>
			<td>מילוי עם מאגר הכביסה 1 למחרת, משמש לפירוק שקופיות המיקרו-מערך</td>
		</tr>
<tr>
<td>מנה 2</td>
			<td>הוסף מתלה שקופית מיקרוarray אחד ושבר מגנטי קטן. תווית עם "לשטוף מאגר 1", לצאת לספסל המעבדה עד היום הבא</td>
			<td>משמש לשטיפת שקופיות המיקרו-מערך באמצעות מאגר הכביסה 1 למחרת</td>
		</tr>
<tr>
<td>מנה 3</td>
			<td>הוסף אחד משני המהומה מגנטי קטן, תווית עם "לשטוף מאגר 2" ומקום בחממה מיני 37 ° c.</td>
			<td>משמש לשטוף את שקופיות המיקרו-מערך עם מאגר כביסה 2 למחרת בתוך 37 מיני אינקובטור של ° c</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 1: הכנת מכלולים בחדר הכביסה.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>צעדים</td>
			<td>מנה</td>
			<td>שטוף מאגר</td>
			<td>טמפרטורה</td>
			<td>זמן</td>
		</tr>
<tr>
<td>פירוק</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">סביבה</td>
			<td rowspan="2">מהר ככל האפשר</td>
		</tr>
<tr>
<td>(שלב 4.13)</td>
		</tr>
<tr>
<td>שטיפה ראשונה</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">סביבה</td>
			<td rowspan="2">1 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>(שלב 4.14)</td>
		</tr>
<tr>
<td>כביסה שנייה</td>
			<td rowspan="2">3</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">37 ° c</td>
			<td rowspan="2">1 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>(שלב 4.15)</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 2: הטמפרטורה הדגירה והזמן לשטוף הרכבות קאמרית.

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling at JoVE.com

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

מוצגת שיטה ליצירת פרופיל של דגני בוקר. ביטוי גנטי מבוססי מיקרוarray הפרופיל מתחיל עם בידוד של RNA הכולל באיכות גבוהה מדגנים דגנים וממשיך עם הדור של cDNA. לאחר היברידינה של cRNA והכלאה מיקרוarray, ההמלצות ניתנות לזיהוי אותות ולבקרת איכות.

קבלת נתונים באיכות גבוהה טראנסקריפט מזרעי דגנים על ידי שיטה שהשתנתה ליצירת פרופיל ביטוי גנים

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

שיטת הכלאה microarray זה שימושי להשוואת מספר רב של דגימות אורגניזם עם גנום ידוע. בהשוואה לגישה של רצף תפוקה גבוהה, כמות הנתונים שנוצרת על ידי שיטה זו היא הרבה יותר קלה לטיפול ועוד, ניתן לנתח אותה בצורה חסכונית יותר. הפגנת ההליך תהיה ד"ר כריסטיאן סיילר, פוסט-דוקטורט, שעובדת בקבוצת המחקר ברוזיס ב-IPK בגאטרסלבן.לפני ביצוע הכלאה microarray באמצעות ערכת הכלאה ביטוי גנים, להכין סוכן חסימה 10X על פי מפרט היצרן aliquot סוכן חסימה וכתוצאה מכך 200 כרכים microliter. לאחר מכן, לאחסן את סוכן החסימה במינוס 20 מעלות צלזיוס עד השימוש. ביום ההכלאה microarray, להפשיר אחד 200 aliquot microliter של סוכן חסימה 10X על קרח לפני המלחמה את תנור ההכלאה ל 65 מעלות צלזיוס וגוש חום ל 60 מעלות צלזיוס.הכינו את תערובת הפיצול לכל דגימה כפי שתוארה על ידי היצרן וערבבו את הדגימות בעדינות על מערבולת. לאחר מערבולת, לזמן קצר לסובב את הדגימות במיקרוצנטריפוגה לפני הדגירה בדיוק 30 דקות בבלוק חום 60 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, מיד לקרר כל צינור על קרח במשך דקה אחת לפני עצירת הפיצול עם 25 microliters של חיץ הכלאה ביטוי גנים 2X, מהפכות גבוהות לדקה לכל צינור.מערבבים עם צינורות עדינים, דואגים מאוד לא להציג בועות, וצנטריפוגה הצינורות בטמפרטורת החדר הסביבה. בסוף הספין מיד מניחים את כל הצינורות על הקרח ועומסים כל דגימה לתוך מגלשת המיקרו-ריי מהר ככל האפשר. לאחר מכן, מחלקים באיטיות 44 מיקרוליטרים של כל תערובת הכלאה למרכז כל באר אטם, דואגים להימנע מהכנסת בועות, ומוסיפים 44 מיקרוליטרים של מאגר הכלאה לתוך כל בארות שאינן שימוש.מיד למקם את השקופית microarray בכיוון הנכון על גבי מגלשת אטם, דואג לא לשפוך כל נוזל, ולסגור בחוזקה את הרכבה הכלאה. סובב את ההרכבה כדי לאשר את המחסור בבועות אוויר נייחות והצב את הרכבת תא ההכלאה לתוך מסובב תנור ההכלאה. הגדר את מהירות הסיבוב ל 10 מהפכות לדקה, ולאחר מכן להתחיל את ההכלאה ב 65 מעלות צלזיוס בדיוק 17 שעות.בזמן שהדגימות היברידיות, הכינו שלוש הרכבות של כלי שטיפה במאגרי הכביסה המתאימים כמתואר בשולחנות. לאחר 17 שעות בדיוק של הכלאה, לפרק תא הכלאה אחד על ספסל מעבדה מרופד נייר מוך חינם ולהעביר כריך microarray אחד לצלחת המכילה חיץ לשטוף אחד עם ברקוד microarray פונה כלפי מעלה בתנוחה מלוטה מבלי להטביע את כל השקופית במאגר. באמצעות מדפים, להפריד את שתי מגלשות זכוכית ולתת את הגלישה אטם טיפה בעדינות לתוך החלק התחתון של המנה תוך שמירה על אחיזה איתנה על שקופית microarray.הרם באיטיות את החלקת המיקרו-ריי הצידה להעברה מיידית לתוך מתלה המיקרו-ריי בצלחת 2 עם חשיפה מינימלית לאוויר. כאשר כל שמונה השקופיות הונחו באופן שווה לאורך המדף, חבר את מחזיק המדף והעבר את כל המנה 2 לערבב המגנטי. מערבבים את ההתקנה בעדינות במשך דקה אחת בדיוק.בזמן שהדגימות מעורבבות, מעבירים את המנה השלישית מהאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס על גבי ערבוב מגנטי שני. לאחר מכן מוסיפים בעדינות 37 מעלות צלזיוס לשטוף את המאגר 2 כדי צלחת שלוש מבלי להרכיב בועות. בסוף הדגירה המרגשת, מעבירים בעדינות ובאט לאט את מתלה השקופיות לצלחת שלוש ומסירים את מחזיק המדף.לאחר ערבוב של דקה אחת בדיוק, מסירים באיטיות ובעדינות את מתלה השקופיות מהצלחת ולהשתמש בנייר חופשי מוך כדי לייבש בזהירות את שני הצדדים של כל שקופית, הצבת כל שקופית לתוך תיבת שקופית כפי שהוא מיובש. לאחר מתן אפשרות לשקופיות להתייבש למשך 15 דקות, העבר כל שקופית microarray למחזיק שקופית כאשר הברקוד פונה כלפי מעלה וטען את מחזיקי השקופיות שהורכבו לקרוסלה ורצף סריקה בהתאם למספר הברקוד. לאחר מכן, סרוק מיד את השקופיות.בנתון זה, תוצאה מייצגת של ריצה כדי לבדוק את האיכות של מיצוי RNA מוצג. בניתוחים אופייניים של דגימות תוכן עמילן נמוך, כגון עלי שעורה, להקות RNA ריבוזומליות נוספות מכלורופלסטים ניכרות. דגימות תוכן עמילן גבוה, כגון זרעי שעורה, התערוכה 18 ו 28S ריבוזומלי RNA.שים לב כי לא ניתן לחשב ערך אוטומטי של מספר שלמות RNA עבור רקמות צמחיות ירוקות, כגון דגימות עלים, עקב RNA ריבוזומלי כלורופלסט. בניתוח מייצג זה, הכנת RNA והכלאה לשבב microarray שעורה מותאם אישית בוצעו כפי שהוכח. הרשת מציגה דוגמה לאותות נגזרים מכל פינה של השבב, כולל רקע ודקר בנקודות קריאה המשמשות לכיול.ההיסטוגרמה מציינת את הסטייה של נקודות הניתנות לגילוי עם עוצמת אות בהתאמה. כפי שנצפה, הכלאה מוצלחת מעניקה עקומה רחבה בצורת גאוסיאנית עם חריגים קטנים בלבד. מוצג כאן דוח בקרת האיכות עבור אותות שזוהו.הערכים עבור השקופית הכלאית ניתנים בעמודה 2 וטווח הערכים הקביים מוצג בעמודה ארבע. שיטה זו יכולה לשמש לטיפול בכל הגדרה ניסיונית עבור כל אורגניזם שבו מידע משמעותי על הגנום זמין. שימוש בטכניקה זו במעבדה שלנו אפשר לנו להשוות ולנתח שינויים תעתיק באורז ושורה המתרחשים לאחר אינדוקציה מתח הצמיחה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

שיטה יעילה עבור הבידוד של רנ&quot;א מאוד מטוהר מזרעים לשימוש ב כמוני transcriptome ניתוח

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

שיטה המבוססת על סינון של הכנת גרעינים באיכות גבוהה מן שריר השלד צולבות צולבות עבור Immunoprecipitation הכרומטין

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

מיצוי קפאין, פעילות אנזימטיות, ביטוי גנים של קפאין סינתאז מ המתלים תא צמח

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

ביוסינתזה של פלאנונול מתוך Flavanone על ידי הקמת מדורגת ביאנזיטית בסיר אחד

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

זיהוי רצף דנ א על ידי Primase DNA שימוש בתפוקה גבוהה Primase פרופיל

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

הפרדה ברזולוציה גבוהה בפרופיל מלא-ניתוח בהקפאה בסון-MS

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

הכנת מוצר מוצרי הדגים התוססים באיכות גבוהה

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...