Name: obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds by a modified method for gene expression profiling
Uploaded: 2020-05-21T13:00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto nell'area tematica CGIAR Global Rice Agri-Food System CRP, RICE, Stress-Tolerant Rice for Africa and South Asia (STRASA) Phase III, e I'N (Interdisciplinary Centre for Crop Plant Research, Halle (Saale), Germania. Ringraziamo Mandy Pàffeld per la sua eccellente assistenza tecnica e la dott.ssa Isabel Maria Mora-Ramirez per la condivisione di informazioni ed esperienze con il chip di grano. Ringraziamo la Dott.ssa Rhonda Meyer (RG Heterosis, IPK Gatersleben, Germania) per i commenti e la lettura critica del manoscritto.

<ol>
	<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+intact-tissue+sequencing+of+single-cell+transcriptional+states.">Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li><li>P&#252;ffeld, M., Seiler, C., Kuhlmann, M., Sreenivasulu, N., Butardo, V. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+mapping+of+putative+regulator+genes+of+barley+grain+development+characterized+by+expression+profiling.">Linkage mapping of putative regulator genes of barley grain development characterized by expression profiling.</a> BMC Plant Biology. 9, 4 (2009).</li><li>Druka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+gene+expression+from+seed+to+seed+through+barley+development.">An atlas of gene expression from seed to seed through barley development.</a> Functional &amp; Integrative Genomics. 6 (3), 202-211 (2006).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+Expression+Atlas+In+Reproductive+Development.">Rice Expression Atlas In Reproductive Development.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (12), 2060-2081 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+gene+expression+atlas+covering+the+entire+life+cycle+of+rice.">A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice.</a> The Plant Journal. 61 (5), 752-766 (2010).</li><li>Yamakawa, H., Hakata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+rice+grain+filling-related+metabolism+under+high+temperature:+Joint+analysis+of+metabolome+and+transcriptome+demonstrated+inhibition+of+starch+accumulation+and+induction+of+amino+acid+accumulation.">Atlas of rice grain filling-related metabolism under high temperature: Joint analysis of metabolome and transcriptome demonstrated inhibition of starch accumulation and induction of amino acid accumulation.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (5), 795-809 (2010).</li><li>Shakoor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sorghum+bicolor+expression+atlas+reveals+dynamic+genotype-specific+expression+profiles+for+vegetative+tissues+of+grain,+sweet+and+bioenergy+sorghums.">A Sorghum bicolor expression atlas reveals dynamic genotype-specific expression profiles for vegetative tissues of grain, sweet and bioenergy sorghums.</a> BMC Plant Biology. 14, 35 (2014).</li><li>Yu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+reveals+key+differentially+expressed+genes+involved+in+wheat+grain+development.">Transcriptome analysis reveals key differentially expressed genes involved in wheat grain development.</a> Crop Journal. 4 (2), 92-106 (2016).</li><li>Kochevenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+QTL+hot+spots+for+malting+quality+in+two+elite+breeding+lines+with+distinct+tolerance+to+abiotic+stress.">Identification of QTL hot spots for malting quality in two elite breeding lines with distinct tolerance to abiotic stress.</a> BMC Plant Biology. 18 (1), 106 (2018).</li></ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Il metodo descritto fornisce risultati altamente riproducibili per estratti di RNA ad alto rendimento e di alta qualità (Figura 1). Sulla base della nostra esperienza, raccomandiamo tre repliche biologiche per un genotipo, stadio o condizione per l'analisi. Per essere in grado di rilevare differenze statisticamente significative, è necessario considerare l'abbondanza generale di mRNA. Si prega di notare, tuttavia, che una quantità iniziale di 200 campioni di tessuto mg è necessaria in triplicati per la fase di estrazione dell'RNA. Quindi, per gli esperimenti che hanno una quantità limitata di campioni come materiali vegetali geneticamente modificati, questo metodo potrebbe non essere appropriato.
Durante l'ibridazione microarray, i seguenti passaggi sono i più critici: (1) caricare i campioni sul vetrino della guarnizione (passaggio 4.7) e (2) lavare gli array dopo l'ibridazione (passaggi 4.13 e 4.14). Il caricamento del campione deve essere fatto con molta attenzione per evitare la formazione di bolle e la fuoriuscita di liquidi. È necessario prestare attenzione quando si mette il vetrino microarray sul vetrino della guarnizione contenente i campioni caricati: il lato DNA (con sonde maculate) deve essere rivolto verso il basso per consentire l'ibridazione. Per lavare i microarray, la seconda fase di lavaggio è particolarmente critica: in questo caso, la rimozione dei vetrini dal buffer di lavaggio 2 deve essere eseguita molto lentamente (10 s) per evitare artefatti tamponanti sui vetrini, che possono interferire con l'acquisizione e l'analisi dei dati.
Per ricevere i risultati dell'esperimento di ibridazione ammissibili all'analisi bioinformatica a valle, si dovrebbero seguire alcuni criteri importanti. Il rapporto QC, generato dopo le prestazioni del protocollo precedente, fornisce una buona idea di ciò che dovrebbe essere migliorato e quali dati sono in una condizione utilizzabile (Figura 3). Le prime informazioni ricevute sono la griglia visualizzata (Figura 2). Qui, si può vedere direttamente se tutte le aree per la lettura a fluorescenza sono correttamente allineate. Se c'è uno spostamento rilevabile visivamente, questo influenzerà tutti gli altri valori (Sfondo, intensità del segnale, ecc.) e la lettura di questo chip non può essere utilizzata. Nella panoramica (Distribuzione spaziale di tutti gli outlier), si può facilmente individuare qualsiasi contaminazione (ad esempio, polvere o capelli), che ha influenzato il risultato. Lo sporco può essere rimosso soffiando dolcemente e riscansione del chip. L'istogramma della trama del segnale come indicato in precedenza dovrebbe risultare in un'ampia curva a forma di Gauss, con solo alier minori (Figura 2). A seconda del tessuto analizzato (Figura 1), questa curva può apparire diversa e può apparire per avere due picchi, o un picco predominante con una spalla. Ciò non influenzerà la qualità dei dati. Solo un forte picco spostato, o segnali elevati sui bordi indicano problemi, come "mostri verdi" (intensità di fluorescenza troppo elevate), che non possono essere rimossi con il lavaggio e devono essere segnalati al produttore del chip. Inoltre, il "grafico di distribuzione spaziale per segnali mediani" dovrebbe variare intorno a un valore comune. Questo dovrebbe essere compreso tra 40 e 100, a seconda dell'intensità generale del chip analizzato. Un altro importante controllo di qualità è la valutazione del picco di dati: il grafico del log per il picco di segnali dovrebbe risultare in una linea lineare e regolare. Infine, la tabella delle "metriche di valutazione" offre una visione buona e affidabile dei risultati ricevuti. Qui il produttore fornisce una gamma di valori che possono essere classificati come Eccellente, Buono e Valutare (Figura 3). Secondo la nostra esperienza, alcuni dei valori non possono sempre essere applicati per tutti i chip. Per i chip personalizzati di riso, il "valore nonControl" era spesso fuori portata, ma non influisce in modo significativo sull'ulteriore elaborazione dei dati. Inoltre, l'intervallo per "NegControl" potrebbe essere esteso, in base al tessuto, all'organismo e all'uscita generale del Chip a <80. L'intervallo di valutazione per il valore E1 med CV potrebbe essere esteso a <9, anziché a <8 in base alla nostra esperienza. A seguito di ciò, è possibile una corretta valutazione di tutti i dati letti dal chip. In generale, si dovrebbe sempre tenere a mente che le repliche biologiche indipendenti danno sempre il risultato più affidabile.
Il vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi sta nel fatto che rappresenta un metodo economico e ad alta velocità effettiva per la profilazione trascrizionale. Inoltre, la pipeline di analisi dei dati a valle è più facile e più consolidata. Nonostante i vantaggi, ci sono alcune limitazioni di questa tecnica, come il numero di geni che possono essere analizzati. Il microarray può solo facilitare l'analisi dei geni precedentemente avvistati sonde sull'array. Pertanto, questa tecnica è applicabile solo alle specie vegetali con genomi sequenziati e geni completamente annotati. Immaginiamo che la trascrittomica basata su microarray continuerà ad essere molto utile e rilevante non solo per la profilazione dell'espressione genica, ma anche per altre pipeline bioinformatiche a valle, come l'analisi della rete di regolazione genica e lo studio di associazione a livello di trascrittoma.

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The&#160;names were&#160;corrected from:
Christianne&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreeenivasulu
to:
Christiane&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreenivasulu

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Erratum: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Il trascrittoma rappresenta l'insieme completo di trascrizioni dell'acido ribonucleico (RNA) espresse dal genoma di un organismo in un dato momento e in particolari condizioni ambientali e di crescita. Ogni cellula ha il suo trascrittoma individuale, che riflette il suo attuale stato fisiologico e metabolico. Una raccolta di cellule derivate da un tessuto o un organo simile viene utilizzata in un tipico studio del trascrittoma, ma la trascrittomica a cella singola e risolta nello spazio sta diventando popolare1. Le analisi trascrittomiche iniziano con l'estrazione dell'RNA totale da un tessuto selezionato in un determinato momento e in condizioni di crescita definite. A tale scopo, raccomandiamo l'uso di un metodo appena sviluppato per l'estrazione dell'RNA totale da campioni ad alto contenuto di amido o di zucchero, come i semi di cereali2. Il confronto dei trascrittomi tra diversi campioni determina l'identificazione di molecole di RNA con abbondanza diversa. Queste molecole di RNA sono considerate come geni espressi in modo differenziale (DEG). L'abbondanza di trascrizioni derivate da specifici geni marcatori può quindi essere utilizzata per stimare lo stato di sviluppo o determinare la risposta di un organismo alle fluttuazioni ambientali. I geni senza cambiamenti rilevabili nella loro abbondanza di trascrizioni nei punti temporali di sviluppo studiati sono spesso usati come geni di riferimento o di pulizia.
L'RNA viene tipicamente rilevato e quantificato con vari metodi, come il blotting del nord e la reazione a catena della polimerasi della trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR), ma gli attuali metodi di transcriptomica ad alto rendimento si basano pesantemente sull'ibridazione dell'acido nucleico utilizzando la tecnologia microarray e il sequenziamento dell'RNA (RNA-Seq). RNA-Seq è molto popolare al momento perché fornisce diversi vantaggi per applicazioni trascrittomiche ad alta velocità effettiva come esaminato altrove3,4. Anche se una tecnologia più vecchia, la profilazione dell'espressione genica con chip di microarray è ancora ampiamente utilizzata perché è una tecnologia più consolidata, che richiede meno background in bioinformatica. Rispetto all'RNA-Seq, i set di dati generati dagli esperimenti di microarray sono più piccoli e più facili da analizzare. Inoltre, è più conveniente, soprattutto se si tratta di grandi numeri di campione. Nel nostro laboratorio, utilizziamo regolarmente analisi trascrittomiche utilizzando la tecnologia microarray per determinare il ruolo dei centri normativi centrali che governano le reti molecolari e i percorsi coinvolti nella crescita, nello sviluppo e nel metabolismo dei cereali5,6,7,8,9. Lo usiamo regolarmente anche per condurre studi di profilazione dell'espressione genica a livello di genoma per ottenere una comprensione meccanicistica della risposta dei cereali alle sollecitazioni abiotiche10, così come nella conduzione dell'associazione trascrittoma (TWAS) e nella mappatura delle collegamenti per identificare i geni responsabili della qualità dei cereali e della nutrizione11,12. Altri gruppi hanno anche utilizzato la tecnologia microarray nel fornire atlante di espressione genica specifica dello sviluppo in orzo13, riso14,15,16,sorgo17e grano18.
Lo scopo di questa pubblicazione è quello di fornire una breve sintesi testuale e una descrizione visiva dettagliata del metodo che attualmente impieghiamo nel nostro laboratorio per la profilazione trascrittomica dei cereali utilizzando una piattaforma di microarray Agilent. Si prega di notare che altre piattaforme microarray sono disponibili, ma non saranno coperti in questo metodo. Iniziamo il protocollo presentando una descrizione dettagliata dell'estrazione dell'RNA dallo sviluppo o dalla germinamento di semi di cereali. Sulla base della nostra esperienza, ottenere un trascrittoma di alta qualità e ad alta quantità suscettibile di analisi trascrittomica a valle è spesso il collo di bottiglia quando si utilizzano tessuti di semi di cereali. Abbiamo provato diversi kit di estrazione dell'RNA disponibili in commercio, ma nessuno ha fornito risultati soddisfacenti. Quindi, abbiamo sviluppato un protocollo di estrazione chimica per ottenere un estratto di RNA grezzo che viene poi sottoposto alla purificazione della colonna utilizzando un kit disponibile in commercio. Utilizzando questo metodo, otteniamo regolarmente e riproducibilmente RNA2 di alta qualità (Figura 1), che può essere utilizzato per diverse applicazioni a valle per generare un profilo di trascrittoma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td>Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>To determine quality and quantity of RNA extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crushed ice maker</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>To keep samples on ice during sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar flask</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>Used as liquid nitrogen container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Hybridization Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5242</td>
			<td>Kit components: 
			2X Hi-RPM Hybridization Buffer 
			25X Fragmentation Buffer 
			10X Gene Expression Blocking Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Wash buffer Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5325</td>
			<td>Kit components: 
			Gene Expression Wash Buffer 1 
			Gene Expression Wash Buffer 2 
			Triton X-102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2545A</td>
			<td>Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization gasket slide kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534-60014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQAir air cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9866.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free paper, Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>KC34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Input Quick Amp Labeling Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-2305</td>
			<td>Kit components: 
			T7 Primer 
			5x First Strand Buffer 
			0.1M DTT 
			10 mM dNTP Mix 
			AffinityScript RNAse Block Mix 
			5x Transcription Buffer 
			NTP Mix 
			T7 RNA Polymerase Blend 
			Nuclease-free water 
			Cyanine 3-CTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spatula, small</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes, nuclease-free</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>2.0 mL and 1.5 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td>It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110-230V</td>
			<td>Any small incubator will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and pestle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td>Peqlab / Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>351900302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-Color RNA Spike-In Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5188-5282</td>
			<td>Kit components: 
			One color RNA Spike-Mix 
			Dilution Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ozone barrier slide cover kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2505-60550</td>
			<td>Optional but highly recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube, 0.2 mL, RNase-free</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>Z376426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A156.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, nuclease free, filter tips</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor set</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Extraction Buffer</td>
			<td>10 mM Tri-HCl pH 8.0 
			150 mM LiCl 
			50 mM EDTA 
			1.5% EDTA 
			15 ul/mL &#946;-mercaptoethanol</td>
			<td></td>
			<td>We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add &#946;-mercaptoethanol fresh daily</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Kit components: 
			RNeasy mini spin column (pink) 
			1.5 ml collection tubes 
			2 ml collection tubes 
			Buffer RLT 
			Buffer RW 
			Buffer RPE 
			Nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74904</td>
			<td>Kit components: 
			RNeasy mini spin column (pink) 
			QIAshredder spin column (purple) 
			1.5 ml collection tubes 
			2 ml collection tubes 
			Buffer RLT 
			Buffer RLC 
			Buffer RW1 
			Buffer RPE 
			Nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide holders for DNA microarray scanner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2505-60525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide staining dish with removable rack</td>
			<td>DWK Life Sciences 900200</td>
			<td>Fisher Scientific 08-812</td>
			<td>We recommend DWK Life Sciences Wheaton&#8482; Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultralow temperature freezer</td>
			<td>Various brand</td>
			<td></td>
			<td>Capable of storing sample at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds by a modified method for gene expression profiling

La caratterizzazione dell'espressione genica dipende dalla qualità dell'RNA. Nel germinare, sviluppare e maturi semi di cereali, l'estrazione di RNA di alta qualità è spesso ostacolata da un alto amido e contenuto di zucchero. Questi composti possono ridurre sia la resa che la qualità dell'RNA totale estratto. Il deterioramento della quantità e della qualità dell'RNA totale può successivamente avere un impatto significativo sulle analisi trascrittomiche a valle, che potrebbero non riflettere accuratamente la variazione spaziale e/o temporale nel profilo di espressione genica dei campioni testati. In questo protocollo, descriviamo un metodo ottimizzato per l'estrazione dell'RNA totale con quantità e qualità sufficienti da utilizzare per l'analisi del trascrittoma intero dei cereali. Il metodo descritto è adatto per diverse applicazioni a valle utilizzate per la profilazione trascrittomica dello sviluppo, della germinizzazione e dei semi di cereali maturi. Viene illustrato il metodo di profilazione del trascrittoma utilizzando una piattaforma di microarray. Questo metodo è specificamente progettato per la profilazione dell'espressione genica dei cereali con sequenze genomiche descritte. Viene descritta la procedura dettagliata dalla movimentazione di microarray al controllo di qualità finale. Ciò include la sintesi del cDNA, l'etichettatura cRNA, l'ibridazione dei microarray, la scansione delle diapositive, l'estrazione delle funzionalità e la convalida della qualità dei dati. I dati generati da questo metodo possono essere utilizzati per caratterizzare il trascrittoma dei cereali durante la germinazione, in varie fasi dello sviluppo del grano o in diverse condizioni di stress biotico o abiotico. I risultati qui presentati esemplificano i dati di trascrittomi di alta qualità suscettibili di analisi bioinformatica a valle, come la determinazione dei geni espressi in modo differenziale (DEG), la caratterizzazione delle reti di regolazione genica e lo studio di associazione a livello di trascrittome (TWAS).

Questo metodo è ottimizzato per l'estrazione di campioni di semi di cereali contenenti quantità significative di amido o zuccheri contaminati. È progettato per estrarre l'RNA totale da 24 campioni di semi al giorno. Dovrebbe essere condotta continuamente in un giorno, ma i punti di stop e pausa opzionali sono identificati in tutto il protocollo. In alternativa, il lettore può utilizzare i loro kit di estrazione dell'RNA preferiti o il metodo di estrazione chimica manuale. Tuttavia, sulla base della nostra precedente esperienza, i kit di estrazione dell'RNA vegetale disponibili in commercio non sono appropriati per i semi a causa di quantità significative di amido, proteine, zucchero e/o contaminazione dei lipidi. Nel metodo descritto, un'estrazione chimica dell'RNA grezzo è seguita dalla purificazione delle colonne utilizzando un kit commerciale per l'estrazione dell'RNA. Questo fornisce in genere all'RNA una qualità e una resa più elevate. Figura 1 Mostra il risultato di un'esecuzione BioAnalyzer per testare la qualità dell'estrazione dell'RNA utilizzando il metodo descritto di seguito. I risultati sono presentati per foglia d'orzo (campioni 1 e 2 che rappresentano campioni di contenuto di amido basso) e semi di orzo (campioni 3 e 4 che rappresentano campioni di alto contenuto di amido). Il valore di integrità dell'RNA (RIN) per tutti i campioni è 10.
La figura 1 mostra un gel rappresentativo dell'estratto di RNA purificato, dove la qualità è stata testata utilizzando un Bioanalyzer. I campioni 1 e 2 sono risultati tipici per campioni a basso contenuto di amido come le foglie d'orzo, dove sono evidenti bande di rRNA aggiuntive da cloroplasti. I campioni 3 e 4 sono risultati rappresentativi per campioni ad alto contenuto di amido come i semi d'orzo, che mostrano 18S e 28S rRNA. Si prega di notare che nessun valore RIN automatizzato può essere calcolato per i tessuti vegetali verdi come i campioni di foglie, a causa del rRNA cloroplasto. Tuttavia, l'integrità e l'alta qualità possono essere accertate visivamente dall'assenza di qualsiasi prodotto di degradazione, che in genere appare come basso striscio molecolare. Il valore di RIN per campioni di semi ad alto amido come i semi d'orzo è tipicamente 10 utilizzando il protocollo descritto in questo documento.
Inoltre, presentiamo qui anche i dati rappresentativi di un esperimento di corso temporale di due linee inbred orzo d'elite (Sofiara e Victoriana) utilizzato per l'analisi della qualità del malto19. Durante il processo di maltamento, l'amido viene convertito in zucchero. Pertanto, i campioni rappresentano tessuti con proporzioni variabili di amido e contenuto di zucchero. Poiché il processo di maltaggio industriale è simile al processo di germinazione, sono stati analizzati i trascrittomi di due linee di orzo, diverse per la loro qualità di malto. Gli RNA sono stati estratti dai semi germinanti a 2, 24, 48, 72, 120, 144 e 196 h dopo l'imbibitiazione nei triplicati biologici. La preparazione dell'RNA e l'ibridazione al chip personalizzato per microarray di orzo sono state eseguite come descritto sopra. La figura 2 indica la griglia normalizzata letta dall'ibridazione di microarray fornita nel rapporto di controllo qualità (QC) (Figura 3) e nel grafico dell'istogramma per i segnali rilevati. La griglia fornisce l'esempio di segnali derivati da ogni angolo del chip, inclusi i punti di lettura di sfondo e spike-in utilizzati per la calibrazione. L'istogramma indica la deviazione dei punti rilevabili con le rispettive intensità del segnale. Un'ibridazione di successo dà un'ampia curva a forma gaussiana con solo piccoli outlier, come mostrato nella figura. Le ibridazioni fallite possono provocare un forte spostamento verso un lato ("mostri verdi").
Infine, un risultato rappresentativo dei valori accettabili è riportato nella colonna 4 della figura 3. Per indicare l'affidabilità degli esperimenti eseguiti, i risultati vengono ulteriormente valutati utilizzando il software GeneSpring. I dati raccolti sono presentati come analisi dei componenti principali (PCA). Il PCA integra i valori dei punti (geni) selezionati come vettore. Il numero di punti valutati utilizzati può variare da diverse centinaia all'intero chip e dipende dal software utilizzato. Ogni chip (campione) produce un valore (vettore) risultante dall'intensità del segnale integrato per i punti analizzati. Pertanto, la posizione relativa nel grafico (PCA) indica la somiglianza dei campioni tra loro. Più i campioni sono vicini, più simili sono. Le repliche tecniche dovrebbero essere più vicine rispetto a quelle biologiche, e le repliche biologiche di un campione dovrebbero raggrupparsi più vicine, rispetto a campioni provenienti da diversi punti temporali, tessuti o condizioni.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig1.jpg"> Figura 1: Riepilogo dell'esecuzione del file di elettroforesi ottenuto dopo aver controllato la qualità dell'RNA con Bioanalyzer. I campioni 1 e 2 sono tessuto fogliare d'orzo come indicato da bande ribosomiche aggiuntive da cloroplasti. I campioni 3 e 4 sono tessuti di semi d'orzo con bande di rRNA 18S e 28S mostrate. Un fattore RIN non è sempre calcolato per i tessuti verdi come la foglia, ma secondo il gel, la qualità dell'RNA è molto buona. Il valore RIN per i campioni 3 e 4 è 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig2.jpg"> Figura 2: Rapporto QC da ibridazione di microarray di orzo di successo. A: indica i segnali rilevati sulla rete da tutti gli angoli del chip. L'istogramma mostra il numero di segnali classificati in base all'intensità del segnale (fluorescenza) come logaritmo dopo la sottrazione di fondo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig3.jpg"> Figura 3: Riepilogo del controllo qualità (QC) dopo l'ibridazione e la scansione. I valori per la diapositiva ibridata sono indicati nella colonna 2 (valore) e l'intervallo di valori accettabili è mostrato nella colonna 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Assemblaggio della camera di lavaggio</td>
			<td>Contenuto ed etichetta</td>
			<td>Scopo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Piatto 1</td>
			<td>Vuoto, lasciare sul banco di laboratorio fino al giorno successivo</td>
			<td>Riempire con Wash Buffer 1 il giorno successivo, utilizzato per smontare i vetrini microarray</td>
		</tr>
<tr>
<td>Piatto 2</td>
			<td>Aggiungere un rack di scorrimento microarray e una piccola barra di agitazione magnetica; etichetta con "Wash Buffer 1", lasciare sul banco di laboratorio fino al giorno successivo</td>
			<td>Utilizzato per lavare i vetrini microarray con Wash Buffer 1 il giorno successivo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Piatto 3</td>
			<td>Aggiungere una piccola barra di agitazione magnetica, etichettare con "Wash Buffer 2" e posizionare in una mini incubatrice a 37 gradi centigradi.</td>
			<td>Utilizzato per lavare i vetrini microarray con Wash Buffer 2 il giorno successivo all'interno del mini incubatore 37 c</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Preparazione degli assiemi della camera di lavaggio.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Passi</td>
			<td>Piatto</td>
			<td>Buffer di lavaggio</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Ore</td>
		</tr>
<tr>
<td>Smontaggio</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">Ambientale</td>
			<td rowspan="2">Il più velocemente possibile</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Passaggio 4.13)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primo lavaggio</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">Ambientale</td>
			<td rowspan="2">1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Passaggio 4.14)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Secondo lavaggio</td>
			<td rowspan="2">3</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">37 gradi centigradi</td>
			<td rowspan="2">1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Passaggio 4.15)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Temperatura di incubazione e tempo per gli assiemi della camera di lavaggio.

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Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Viene presentato un metodo per la profilazione trascrittoma dei cereali. La profilazione dell'espressione genica basata su microarray inizia con l'isolamento dell'RNA totale di alta qualità dai cereali e continua con la generazione di cDNA. Dopo l'etichettatura cRNA e l'ibridazione dei microarray, vengono fornite raccomandazioni per il rilevamento del segnale e il controllo della qualità.

Ottenere dati trascrittomi di alta qualità dai semi di cereali con un metodo modificato per la profilazione dell'espressione genica

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Questo metodo di ibridazione del microarray è utile per confrontare un gran numero di campioni di un organismo con un genoma noto. Rispetto a un approccio di sequenziamento ad alta velocità effettiva, la quantità di dati generati da questo metodo è molto più facile da gestire e, inoltre, può essere analizzata in modo più conveniente. A dimostrare la procedura sarà la dott.ssa Christiane Seiler, scienziata post-dottorato che lavora nel gruppo di ricerca di Rosis presso l'IPK di Gatersleben.Prima di eseguire l'ibridazione dei microarray utilizzando il kit di ibridazione dell'espressione genica, preparare l'agente bloccante 10X in base alle specifiche del produttore e aliquotare l'agente bloccante risultante in volumi di 200 microliter. Quindi, conservare l'agente di blocco a meno 20 gradi Celsius fino all'uso. Il giorno dell'ibridazione del microarray, scongelare un'aliquota di 200 microliter dell'agente bloccante 10X sul ghiaccio e prewarm il forno di ibridazione a 65 gradi Celsius e un blocco termico a 60 gradi Celsius.Preparare la miscela di frammentazione per ciascun campione come descritto dal produttore e mescolare delicatamente i campioni su un vortice. Dopo il vortice, far girare brevemente i campioni in un microcentrifugo prima di incubare esattamente per 30 minuti nel blocco termico di 60 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, raffreddare immediatamente ogni tubo sul ghiaccio per un minuto prima di fermare la frammentazione con 25 microlitri di tampone di ibridazione dell'espressione genica 2X, giri elevati al minuto per tubo.Mescolare con pipettazione delicata, facendo molta attenzione a non introdurre bolle e centrifugare i tubi a temperatura ambiente. Alla fine dello spin posizionare immediatamente tutti i tubi sul ghiaccio e caricare ogni campione nello scivolo del microarray il più rapidamente possibile. Successivamente, erogare lentamente 44 microlitri di ogni mix di ibridazione al centro di ogni guarnizione, facendo attenzione a evitare l'introduzione di bolle e aggiungere 44 microlitri di tampone di ibridazione in eventuali pozzi inutilizzati.Posizionare immediatamente lo scivolo microarray con l'orientamento corretto sopra lo scivolo della guarnizione, facendo attenzione a non versare alcun liquido e chiudere saldamente l'assieme di ibridazione. Ruotare l'assieme per confermare la mancanza di bolle d'aria stazionarie e posizionare l'assemblaggio della camera di ibridazione nel rotatore del forno di ibridazione. Impostare la velocità di rotazione su 10 giri al minuto, quindi avviare l'ibridazione a 65 gradi Celsius per esattamente 17 ore.Mentre i campioni si ibridano, preparare tre gruppi di lavapiatti nei tamponi di lavaggio appropriati come indicato nelle tabelle. Dopo esattamente 17 ore di ibridazione, smontare una camera di ibridazione su un banco da laboratorio foderato con carta priva di pelucchi e trasferire un sandwich di microarray su un piatto contenente tampone di lavaggio uno con il codice a barre microarray rivolto verso l'alto in posizione inclinata senza immergere l'intero scivolo nel buffer. Utilizzando le pinze, separare i due vetrini e lasciare che la guarnizione scivoli delicatamente nella parte inferiore del piatto mantenendo una presa ferma sullo scivolo del microarray.Sollevare lentamente lo scivolo microarray lateralmente per un trasferimento immediato nel rack microarray nel piatto due con una minima esposizione all'aria. Quando tutte e otto le diapositive sono state posizionate uniformemente lungo il rack, fissare il portapacchi e trasferire l'intera configurazione del piatto due all'agitatore magnetico. Mescolare delicatamente la configurazione per esattamente un minuto.Mentre i campioni vengono mescolati, trasferire il piatto tre dall'incubatore di 37 gradi Celsius su un secondo agitatore magnetico. Quindi aggiungere delicatamente 37 gradi Celsius tampone di lavaggio due al piatto tre senza formare bolle. Al termine dell'incubazione mescolando, trasferire delicatamente e lentamente il portapacchi per pararegliare tre e rimuovere il supporto del rack.Dopo aver mescolato esattamente per un minuto, rimuovere lentamente e delicatamente il porta scorrevole dal piatto e utilizzare carta priva di pelucchi per asciugare accuratamente entrambi i lati di ogni diapositiva, posizionando ogni diapositiva in una scatola scorrevole mentre viene asciugato. Dopo aver permesso alle diapositive di asciugarsi per 15 minuti, trasferire ogni microarray scivolare in un porta scorrevole con il codice a barre rivolto verso l'alto e caricare i supporti di scorrimento assemblati in un carosello di scansione e sequenza in base al numero del codice a barre. Quindi, scansiona immediatamente le diapositive.In questa figura, viene mostrato un risultato rappresentativo di una corsa per testare la qualità dell'estrazione dell'RNA. Nelle analisi tipiche di campioni a basso contenuto di amido, come le foglie d'orzo, sono evidenti ulteriori bande di RNA ribosomiale dai cloroplasti. Campioni ad alto contenuto di amido, come i semi d'orzo, mostrano RNA ribosomiale 18 e 28S.Si noti che nessun valore automatizzato del numero di integrità dell'RNA può essere calcolato per i tessuti vegetali verdi, come i campioni fogliari, a causa dell'RNA ribosomiale cloroplasto. In questa analisi rappresentativa, sono stati eseguiti una preparazione dell'RNA e l'ibridazione su un chip microarray d'orzo personalizzato come dimostrato. La griglia mostra un esempio di segnali derivati da ogni angolo del chip, incluso lo sfondo e il picco nei punti di lettura utilizzati per la calibrazione.L'istogramma indica la deviazione dei punti rilevabili con le rispettive intensità del segnale. Come osservato, un'ibridazione di successo dà un'ampia curva a forma gaussiana con solo valori anomali minori. Di seguito è riportato il rapporto sul controllo qualità per i segnali rilevati.I valori per la diapositiva ibridata sono indicati nella colonna due e l'intervallo di valori accettabili è mostrato nella colonna quattro. Questo metodo può essere utilizzato per affrontare qualsiasi insieme sperimentale per qualsiasi organismo in cui siano disponibili informazioni sostanziali sul genoma. L'uso di questa tecnica nel nostro laboratorio ci ha permesso di confrontare e analizzare i cambiamenti trascrittomici nel riso e nell'orzo che si verificano dopo l'induzione dello stress da crescita.

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