Name: obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds by a modified method for gene expression profiling
Uploaded: 2020-05-21T13:00:00
Duration: 7 min 18 s
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この研究は、CGIARのテーマ領域であるグローバルライスアグリフードシステムCRP、RICE、アフリカと南アジア(STRASA)フェーズIIIのストレス耐性米、およびIZN(作物研究のための学際センター、ハレ(サール)、ドイツの下でサポートされています。マンディ・プフフェルトの優れた技術支援と、小麦チップとの情報と経験を共有してくれたイザベル・マリア・モラ=ラミレス博士に感謝します。ロンダ・マイヤー博士(RGヘテロシス、IPKゲータースレーベン、ドイツ)にコメントし、原稿を批判的に読んでいただきありがとうございます。

<ol>
	<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+intact-tissue+sequencing+of+single-cell+transcriptional+states.">Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li><li>P&#252;ffeld, M., Seiler, C., Kuhlmann, M., Sreenivasulu, N., Butardo, V. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+reveals+key+differentially+expressed+genes+involved+in+wheat+grain+development.">Transcriptome analysis reveals key differentially expressed genes involved in wheat grain development.</a> Crop Journal. 4 (2), 92-106 (2016).</li><li>Kochevenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+QTL+hot+spots+for+malting+quality+in+two+elite+breeding+lines+with+distinct+tolerance+to+abiotic+stress.">Identification of QTL hot spots for malting quality in two elite breeding lines with distinct tolerance to abiotic stress.</a> BMC Plant Biology. 18 (1), 106 (2018).</li></ol>

著者は競合する財政的利益を持っていません。

上記の方法は、高収量および高品質のRNA抽出物に対して非常に再現性の高い結果を提供する(図1)。当社の経験に基づいて、1つの遺伝子型、ステージまたは分析の条件に対して3つの生物学的複製をお勧めします。統計的に有意な差を検出できるようにするには、mRNAの一般的な存在を考慮する必要があります。ただし、RNA抽出工程では、トリプライズに200mgの組織サンプルの開始量が必要であることに注意してください。したがって、遺伝子組み換え植物材料のような限られた量のサンプルを有する実験では、この方法は適切でない場合がある。
マイクロアレイハイブリダイゼーションの際には、(1)ガスケットスライドにサンプルをロードする(ステップ4.7)と(2)ハイブリダイゼーション後にアレイを洗浄する(ステップ4.13および4.14)のステップが最も重要です。サンプルの負荷は、気泡の形成と液体のこぼれを避けるために非常に慎重に行う必要があります。マイクロアレイスライドをロードされたサンプルを含むガスケットスライドに置く場合は注意が必要です:DNA側(斑点のあるプローブを使用)は、ハイブリダイゼーションを可能にするために下向きにする必要があります。マイクロアレイを洗浄する場合、第2の洗浄工程は特に重要である:ここでは、洗浄バッファー2からスライドを取り除くことは、データ取得および分析を妨げる可能性のあるスライド上の緩衝物を避けるために、非常にゆっくりと(10秒)実行する必要がある。
ダウンストリームバイオインフォマティクス解析の対象となるハイブリダイゼーション実験の結果を受け取るには、いくつかの重要な基準に従う必要があります。上記のプロトコルのパフォーマンスの後に生成される QC レポートは、何を改善すべきか、どのデータが使用できる状態にあるかを示します (図3)。最初に受信した情報は、視覚化されたグリッドです (図 2)。ここで、蛍光読み出しのための全領域が適切に整列されているかどうかを直接見ることができる。視覚的に検出可能なシフトがある場合、これは他のすべての値(背景、信号強度など)に影響を与え、このチップの読み出しは使用できません。概要(すべての外れ値の空間分布)では、結果に影響を与えた汚染(例えば、ほこりや髪)を簡単に見つけることができます。チップを柔らかく吹き付け、再スキャンすることで汚れを取り除くことができます。上記のような信号プロットのヒストグラムは、わずかな外れ値だけで、ガウス形の曲線を広くするはずです(図2)。分析した組織(図1)によって、この曲線は異なって見え、2つのピーク、または肩を持つ1つの主要なピークを有するように見えることがある。これはデータの品質に影響を与えない。強いシフトピーク、またはエッジ上の高い信号だけが、洗浄では除去できず、チップメーカーに報告する必要がある「緑色のモンスター」(蛍光強度が高すぎる)などの問題を示しています。また、「中央値シグナルの空間分布グラフ」は、共通の値を中心に変化する必要があります。これは、分析されたチップの一般的な強度読み出しに応じて、40と100の間の範囲でなければなりません。もう一つの重要な品質管理は、データのスパイクの評価です:信号のスパイクのロググラフは、線形および規則的な線をもたらすはずです。最後に、「評価指標」の表は、受信した結果の良好で信頼性の高いビューを示します。ここでは、メーカーは、優れた、良いと評価として分類することができる値の範囲を提供します (図 3).私たちの経験によると、値の一部は常にすべてのチップに適用されるとは限りません。米カスタムチップの場合、「非制御値」は、多くの場合、範囲外であったが、それ以上のデータ処理に大きな影響を与えません。さらに、<80にチップの組織、生物および一般的な出力に基づいて、「NegControl」の範囲を拡張することができる。値 E1 med CV の評価範囲は、当社の経験に従って <8 ではなく 、<9 に拡張される可能性があります。これに続いて、すべてのチップ読み出しデータの適切な評価が可能です。一般に、独立した生物学的複製は常に最も信頼性の高い結果を与える点に留意すべきである。
この手法の利点は、他の方法と比較して、転写プロファイリングのための費用対効果の高い高スループットの方法を表す点にあります。さらに、ダウンストリームデータ分析パイプラインがより簡単で、より確立されています。利点にもかかわらず、解析できる遺伝子の数など、この技術には一定の制限があります。マイクロアレイは、アレイ上で以前に発見されたプローブの分析を容易にするだけです。したがって、この技術は、配列配列されたゲノムおよび完全にアポイントトされた遺伝子を有する植物種にのみ適用可能である。マイクロアレイベースのトランスクリプトミクスは、遺伝子発現プロファイリングだけでなく、遺伝子調節ネットワーク分析やトランスクリプトーム全体の関連研究などの他の下流バイオインフォマティクスパイプラインにも非常に有用で関連性が高いと考えています。

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The&#160;names were&#160;corrected from:
Christianne&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreeenivasulu
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Christiane&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreenivasulu

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Erratum: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

トランスクリプトームは、特定の時点で、特に環境および成長条件において、生物のゲノムによって発現されるリボ核酸(RNA)転写物の完全なセットを表す。各細胞は、その現在の生理学的および代謝状態を反映する個々のトランスクリプトームを有する。一般的な転写研究では、類似した組織や器官に由来する細胞の集合が用いられるが、単一細胞および空間的に分解されたトランスクリプトミクスは人気を集めている。トランスクリプトーム解析は、特定の時点で、定義された成長条件で、選択した組織からRNA全体を抽出することから始まります。この目的のために、我々は、穀物種子2のような澱粉または糖度の高いサンプルから総RNAを抽出するための新しく開発された方法の使用をお勧めします。異なるサンプル間でトランスクリプトを比較すると、異なる存在量のRNA分子の同定が得られます。これらのRNA分子は、遺伝子(DEG)を差し出して発現していると考えられる。特定のマーカー遺伝子に由来するトランスクリプトの豊富さは、発達状態を推定したり、環境変動に対する生物の応答を決定するために使用することができます。研究中の発達時のポイント全体で転写産物の豊富さが検出可能な変化を有しない遺伝子は、しばしば基準遺伝子またはハウスキーピング遺伝子として使用される。
RNAは通常、ノーザンブロッティングや定量的な逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)などの様々な方法で検出および定量化されますが、現在のハイスループットトランスクリプト法は、マイクロアレイ技術とRNAシーケンシング(RNA-Seq)を使用した核酸ハイブリダイゼーションに大きく依存しています。RNA-Seq は、他の場所でレビューされた高スループットのトランスクリプトアプリケーションに対していくつかの利点を提供するため、現在では非常に人気があります3,,4 .古い技術ではあるが、マイクロアレイチップを用いた遺伝子発現プロファイリングは、バイオインフォマティクスのバックグラウンドを必要とするより確立された技術であるため、依然として広く使用されている。RNA-Seqと比較して、マイクロアレイ実験から生成されたデータセットは小さく、分析が容易です。また、特にサンプル数が多い場合は、コスト効率が高くなります。当研究室では、マイクロアレイ技術を用いたトランスクリプト分析を日常的に用い、穀物,,,,65,6,7,8,9の成長・発達・代謝に関与する分子ネットワークや経路を支配する中央制御ハブ5の役割を決定しています。789また、ゲノム全体の遺伝子発現プロファイリング研究を行い、非生物的ストレス10に対する穀物の反応の機械学的理解を得るとともに、穀物の品質と栄養を,担う遺伝子を同定するためのトランスクリプトームワイドアソシエーション(TWAS)およびリンケージマッピング研究の実施に使用しています。他の,グループはまた、大麦13、米14、15、16、ソルガム17、および小麦18での開発特異的遺伝子発現アトラスを17提供する際にマイクロ18アレイ技術を使用している。14,1516
本稿の目的は、Agilentマイクロアレイプラットフォームを用いた穀物の転写プロファイリングのために現在研究室で採用している方法の簡潔な説明と詳細な視覚的説明を提供することです。他のマイクロアレイプラットフォームは利用できますが、この方法ではカバーされません。我々は、穀類種子の開発または発芽からのRNA抽出の詳細な説明を提示することによってプロトコルを開始する。当社の経験に基づいて、下流のトランスクリプトーム分析に適した高品質で大量のトランスクリプトームを得ることは、穀物種子組織を使用する際のボトルネックであることが多い。我々はいくつかの市販のRNA抽出キットを試しましたが、満足のいく結果を提供するものはありません。そこで、市販のキットを用いてカラム精製を行う粗RNA抽出液を得るための化学抽出プロトコルを開発しました。この方法を用いて、我々は、トランスクリプトームプロファイルを生成するために異なる下流アプリケーションに使用することができる高品質のRNA2(図1)を日常的かつ再現的に得る。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td>Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>To determine quality and quantity of RNA extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crushed ice maker</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>To keep samples on ice during sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar flask</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>Used as liquid nitrogen container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Hybridization Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5242</td>
			<td>Kit components: 
			2X Hi-RPM Hybridization Buffer 
			25X Fragmentation Buffer 
			10X Gene Expression Blocking Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Wash buffer Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5325</td>
			<td>Kit components: 
			Gene Expression Wash Buffer 1 
			Gene Expression Wash Buffer 2 
			Triton X-102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2545A</td>
			<td>Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization gasket slide kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534-60014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQAir air cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9866.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free paper, Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>KC34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Input Quick Amp Labeling Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-2305</td>
			<td>Kit components: 
			T7 Primer 
			5x First Strand Buffer 
			0.1M DTT 
			10 mM dNTP Mix 
			AffinityScript RNAse Block Mix 
			5x Transcription Buffer 
			NTP Mix 
			T7 RNA Polymerase Blend 
			Nuclease-free water 
			Cyanine 3-CTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spatula, small</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes, nuclease-free</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>2.0 mL and 1.5 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td>It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110-230V</td>
			<td>Any small incubator will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and pestle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td>Peqlab / Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>351900302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-Color RNA Spike-In Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5188-5282</td>
			<td>Kit components: 
			One color RNA Spike-Mix 
			Dilution Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ozone barrier slide cover kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2505-60550</td>
			<td>Optional but highly recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube, 0.2 mL, RNase-free</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>Z376426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A156.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, nuclease free, filter tips</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor set</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Extraction Buffer</td>
			<td>10 mM Tri-HCl pH 8.0 
			150 mM LiCl 
			50 mM EDTA 
			1.5% EDTA 
			15 ul/mL &#946;-mercaptoethanol</td>
			<td></td>
			<td>We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add &#946;-mercaptoethanol fresh daily</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Kit components: 
			RNeasy mini spin column (pink) 
			1.5 ml collection tubes 
			2 ml collection tubes 
			Buffer RLT 
			Buffer RW 
			Buffer RPE 
			Nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74904</td>
			<td>Kit components: 
			RNeasy mini spin column (pink) 
			QIAshredder spin column (purple) 
			1.5 ml collection tubes 
			2 ml collection tubes 
			Buffer RLT 
			Buffer RLC 
			Buffer RW1 
			Buffer RPE 
			Nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide holders for DNA microarray scanner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2505-60525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide staining dish with removable rack</td>
			<td>DWK Life Sciences 900200</td>
			<td>Fisher Scientific 08-812</td>
			<td>We recommend DWK Life Sciences Wheaton&#8482; Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultralow temperature freezer</td>
			<td>Various brand</td>
			<td></td>
			<td>Capable of storing sample at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds by a modified method for gene expression profiling

遺伝子発現の特性はRNAの品質に依存します。発芽、開発、成熟した穀物種子では、高品質のRNAの抽出は、しばしば高デンプンおよび糖度によって妨げられる。これらの化合物は、抽出された全RNAの収率および品質の両方を低減することができる。総RNAの量と質の低下は、その後、下流のトランスクリプトミック分析に大きな影響を与える可能性があり、検査対象のサンプルの遺伝子発現プロファイルの空間的および/または時間的変動を正確に反映していない可能性があります。本プロトコルでは、穀物の全トランスクリプトーム分析に使用するのに十分な量と質を持つ全RNAの抽出に最適化された方法を説明する。記載された方法は、発生、発芽、および成熟した穀物種子の転写プロファイリングに使用されるいくつかの下流用途に適している。マイクロアレイプラットフォームを用いた転写法のプロファイリング方法を示す。この方法は、特に記載されたゲノム配列を有する穀物の遺伝子発現プロファイリング用に設計されている。マイクロアレイ処理から最終品質管理までの詳細な手順について説明します。これには、cDNA合成、cRNAラベリング、マイクロアレイハイブリダイゼーション、スライドスキャン、特徴抽出、データ品質検証が含まれます。この方法で生成されたデータは、発芽中、穀物の発達の様々な段階で、または異なる生物的または生理学的ストレス状態で穀物のトランスクリプトームを特徴付けるために使用することができる。ここで示す結果は、微分発現遺伝子(DEG)の決定、遺伝子調節ネットワークの特徴化、トランスクリプトーム全体の関連研究(TWAS)の実施など、下流のバイオインフォマティクス分析に適した高品質のトランスクリプトームデータを例示しています。

この方法は、汚染デンプンまたは糖の大量を含む穀物種子サンプルを抽出するために最適化されています。1日24種のサンプルから総RNAを抽出するように設計されています。1 日で連続的に実施する必要がありますが、オプションの停止ポイントと一時停止ポイントはプロトコル全体で識別されます。あるいは、読者は、好みのRNA抽出キットまたは手動の化学的抽出方法を使用することができます。しかし、当社のこれまでの経験に基づいて、市販の植物RNA抽出キットは、大量のデンプン、タンパク質、糖および/または脂質汚染のために種子に適していません。記載された方法では、粗RNAの化学的抽出は、市販のRNA抽出キットを用いたカラム精製を続けた。これは通常、より高い品質と収率を持つRNAを提供します。図 1は、ここで説明する方法を使用して RNA 抽出の品質をテストする BioAnalyzer の実行結果を示しています。結果は、大麦葉(サンプル1および2は低デンプン含有量サンプルを表す)と大麦の種子(サンプル3および4は高デンプン含有量サンプルを表す)に対して提示される。すべてのサンプルの RNA 完全性 (RIN) 値は 10 です。
図1は、バイオアナライザを用いて品質を試験した精製RNA抽出物の代表的なゲルを示しています。サンプル1および2は、葉っぱ葉のような低デンプン含有量サンプルの典型的な結果であり、葉芽細胞からの追加のrRNAバンドが明らかである。サンプル3および4は、大麦種子などの高デンプン含有量サンプルの代表的な結果であり、18Sおよび28S rRNAを示す。葉緑体rRNAによる葉試料などの緑色の植物組織に対して、自動RIN値を計算することはできません。しかし、完全性と高品質は、一般的に低分子スミアとして見える任意の分解産物の不在によって視覚的に確認することができます。大麦種子などの高デンプン種子サンプルのRIN値は、通常、この論文に記載されているプロトコルを使用して10である。
また、麦芽の品質19の分析に用いられる2つのエリート大麦近交系(ソフィアラとビクトリアナ)のタイムコース実験の代表的なデータもここで提示する。麦芽の過程で、でんぷんは砂糖に変換されます。したがって、サンプルはデンプンと糖分の様々な割合を有する組織を表す。工業用麦芽工程は発芽過程と類似しているので、麦芽の品質が異なる2つの大麦ラインの転写法を分析した。RNAは、生物学的トリクレート中のインビビションの後、2、24、48、72、120、144および196時間で発芽種子から抽出された。カスタマイズした大麦マイクロアレイチップに対するRNA調製およびハイブリダイゼーションを、上述のように行った。図2は、品質管理(QC)レポート(図3)と検出信号のヒストグラムプロットで示されているマイクロアレイハイブリダイゼーションから読み出された正規化されたグリッドを示しています。グリッドは、キャリブレーションに使用されるバックグラウンドとスパイクイン読み出しドットを含む、チップの各コーナーからの誘導信号の例を示します。ヒストグラムは、検出可能なドットの偏差とそれぞれの信号強度を示します。ハイブリダイゼーションが成功すると、図に示すように、わずかな外れ値のみで広いガウス状の曲線が得られます。失敗したハイブリダイゼーションは、片側(「緑のモンスター」)に向かって強いシフトをもたらす可能性があります。
最後に、許容値の代表的な結果を図 3の 4 列目に示します。実施された実験の信頼性を示すために、結果はGeneSpringソフトウェアを用いてさらに評価される。収集されたデータは、主成分分析 (PCA) として表示されます。PCA は、選択したドット (遺伝子) の値をベクターとして統合します。使用される評価されたドットの数は、数百からチップ全体に変化することができ、使用するソフトウェアに依存します。各チップ(サンプル)は、分析されたドットの一体化された信号強度から生じる1つの値(ベクトル)をもたらします。したがって、グラフ(PCA)における相対位置は、サンプル同士の類似性を示す。サンプルが近いほど、類似しています。技術的な複製は生物学的複製よりも近くなければ、異なる時点、組織または条件からのサンプルよりも、サンプルの生物学的複製が一緒に集まるべきです。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig1.jpg"> 図1:バイオアナライザでRNAの品質を確認した後に得られた電気泳動ファイルの実行の概要。試料1および2は、葉緑体からの追加のリボソームバンドによって示されるように大麦葉組織である。サンプル3および4は、18Sおよび28S rRNAバンドを有する大麦種子組織を示す。RINファクターは、葉などの緑色組織について必ずしも計算されるわけではありませんが、ゲルによれば、RNAの品質は非常に良好です。サンプル 3 および 4 の RIN 値は 10 です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig2.jpg"> 図2:成功した大麦マイクロアレイハイブリダイゼーションからのQCレポート。+ は、チップの全角からグリッド上で検出された信号を示します。ヒストグラムは、バックグラウンド減算後の対数としてシグナル強度(蛍光)に従って分類されたシグナルの数を示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig3.jpg"> 図3:ハイブリダイゼーションとスキャン後の品質管理(QC)の概要ハイブリダイズされたスライドの値は列 2 (値) に、許容値の範囲は 4 桁目に示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>洗浄チャンバーアセンブリ</td>
			<td>コンテンツとラベル</td>
			<td>目的</td>
		</tr>
<tr>
<td>ディッシュ1</td>
			<td>空、翌日までラボベンチに置いておく</td>
			<td>マイクロアレイスライドを分解するために使用される、翌日のウォッシュバッファ1で埋める</td>
		</tr>
<tr>
<td>ディッシュ2</td>
			<td>マイクロアレイスライドラック1個と小さな磁気攪拌棒を追加します。ラベルは「ウォッシュバッファ1」で、翌日までラボベンチに置いておく</td>
			<td>翌日のウォッシュバッファ1でマイクロアレイスライドを洗浄するために使用</td>
		</tr>
<tr>
<td>ディッシュ3</td>
			<td>小さな磁気攪拌棒を1つ追加し、「ウォッシュバッファ2」とラベルを付け、37°Cミニインキュベーターに入れます。</td>
			<td>37°Cミニインキュベーター内で、翌日のウォッシュバッファ2でマイクロアレイスライドを洗浄するために使用</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:洗浄室アセンブリの調製。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>手順</td>
			<td>料理</td>
			<td>洗浄バッファー</td>
			<td>温度</td>
			<td>時間</td>
		</tr>
<tr>
<td>分解</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">周囲</td>
			<td rowspan="2">できるだけ速く</td>
		</tr>
<tr>
<td>(ステップ4.13)</td>
		</tr>
<tr>
<td>最初の洗浄</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">周囲</td>
			<td rowspan="2">1分</td>
		</tr>
<tr>
<td>(ステップ 4.14)</td>
		</tr>
<tr>
<td>セカンドウォッシュ</td>
			<td rowspan="2">3</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">37°C</td>
			<td rowspan="2">1分</td>
		</tr>
<tr>
<td>(ステップ4.15)</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:洗浄室アセンブリのインキュベーション温度と時間。

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Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

穀物の転写物プロファイリングの方法を提示する。マイクロアレイベースの遺伝子発現プロファイリングは、高品質の全RNAを穀物から分離することから始まり、cDNAの生成を続けています。cRNAラベリングとマイクロアレイのハイブリダイゼーションの後、シグナル検出と品質管理のための推奨事項が与えられます。

遺伝子発現プロファイリングのための修飾法による穀物種子からの高品質なトランスクリプトームデータの取得

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

このマイクロアレイハイブリダイゼーション法は、生物由来の多数のサンプルを既知のゲノムと比較するのに有用である。高スループットシーケンシングアプローチと比較すると、この方法で生成されるデータの量は処理が非常に簡単であり、さらに、より費用対効果の高い方法で分析することができます。この手順を実証するのは、ゲータースレーベンのIPKでロシスの研究グループで働く博士研究員です。遺伝子発現ハイブリダイゼーションキットを用いてマイクロアレイハイブリダイゼーションを行う前に、メーカーの仕様に従って10Xブロッキング剤を調製し、得られたブロッキング剤を200マイクロリットルの体積でアリコートします。次に、使用するまで、ブロッキング剤をマイナス20°Cで保存します。マイクロアレイハイブリダイゼーションの日に、氷上の10Xブロッキング剤の1つの200マイクロリットルアリコートを解凍し、ハイブリダイゼーションオーブンを摂氏65度に、ヒートブロックを摂氏60度に予熱します。メーカーの説明に従って、各サンプルの断片化ミックスを準備し、渦の上にそっとサンプルを混ぜます。渦を巻いた後、サンプルをマイクロ遠心分離機で短時間回転させ、60°Cのヒートブロックで正確に30分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、2X遺伝子発現ハイブリダイゼーションバッファーの25マイクロリットルで断片化を停止する前に、氷上の各チューブを1分間すぐに冷却し、1回のチューブ当たり1分間の高回転を行う。穏やかなピペットと混ぜ、気泡を導入しないように細心の注意を払い、周囲の室温でチューブを遠心分離します。スピンの終わりにすぐに氷の上にすべてのチューブを置き、できるだけ早くマイクロアレイスライドに各サンプルをロードします。次に、各ハイブリダイゼーションミックスの44マイクロリットルを各ガスケットウェルの中央にゆっくりと分配し、気泡を導入しないように注意し、44マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーを未使用のウェルに加えます。マイクロアレイスライドをガスケットスライドの上に正しい方向に直ちに配置し、液体をこぼさないで注意し、ハイブリダイゼーションアセンブリをしっかりと閉じます。アセンブリを回転させて、固定式の気泡の欠如を確認し、ハイブリダイゼーションチャンバーアセンブリをハイブリダイゼーションオーブン回転器に配置します。回転速度を毎分10回転に設定し、正確に17時間摂氏65度でハイブリダイゼーションを開始します。サンプルがハイブリダイジングされている間、表に示されているように、適切な洗浄バッファーに3つの洗浄皿アセンブリを準備します。ちょうど17時間のハイブリダイゼーションの後、糸くずのない紙が並ぶラボベンチで1つのハイブリダイゼーションチャンバーを分解し、マイクロアレイバーコードが斜めの位置に向いている洗浄バッファーを含む皿に1つのマイクロアレイサンドイッチを転送します。鉗子を使用して、2つのガラススライドを分離し、ガスケットスライドがマイクロアレイスライドにしっかりと握りしながら、皿の底にそっと落とします。マイクロアレイスライドを横にゆっくりと持ち上げて、空気への露出を最小限に抑えて皿2のマイクロアレイラックに即座に移動します。8枚のスライドがすべてラックに沿って均等に配置されたら、ラックホルダーを取り付け、皿全体を2つのセットアップを磁気スターラーに移します。セットアップを 1 分間ゆっくりかき混ぜます。サンプルが攪拌されている間に、37°Cインキュベーターから2番目の磁気スターラーに皿3を移す。その後、泡を形成することなく、3皿に37度摂氏洗浄バッファー2を静かに追加します。攪拌インキュベーションの最後に、スライドラックを3皿にゆっくりとゆっくりと移し、ラックホルダーを取り外します。ちょうど1分間かき混ぜた後、ゆっくりとそっと皿からスライドラックを取り出し、糸くずフリーペーパーを使用して各スライドの両側を慎重に乾燥させ、各スライドをスライドボックスに入れて乾燥させます。スライドを15分間乾燥させた後、各マイクロアレイスライドをバーコードを上向きにスライドホルダーに移し、組み立てたスライドホルダーをバーコード番号に従ってスキャンカルーセルとシーケンスにロードします。次に、スライドをすぐにスキャンします。この図では、RNA抽出の品質を試験するためのランからの代表的な結果が示されている。大麦葉のような低デンプン含有量サンプルの典型的な分析では、葉芽細胞からの追加のリボソームRNAバンドが明らかである。大麦種子などの高デンプン含量サンプルは、18および28SリボソームRNAを示す。葉緑体のサンプルのような、葉緑の植物組織に対して、葉緑のリボソームRNAによる自動RNA完全性値を計算できないということに注意してください。本代表分析では、カスタマイズされた大麦マイクロアレイチップへのRNA調製およびハイブリダイゼーションを実証したとおりに行った。グリッドは、キャリブレーションに使用される読み出しドットの背景とスパイクを含む、チップの各コーナーからの誘導信号の例を示しています。ヒストグラムは、検出可能なドットの偏差とそれぞれの信号強度を示します。観察されたように、ハイブリダイゼーションが成功すると、わずかな外れ値のみで広いガウス状の曲線が得られます。検出された信号の品質管理レポートを次に示します。ハイブリダイズされたスライドの値は 2 列目に示され、許容値の範囲は 4 桁目に示されます。この方法は、ゲノムに関する実質的な情報が利用可能な任意の生物に対して設定された実験的なアドレス指定に使用することができます。この技術をラボで使用して、成長応力誘導後に発生する米と大麦の転写変化を比較して分析することができました。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

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