Name: obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds by a modified method for gene expression profiling
Uploaded: 2020-05-21T13:00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling at JoVE.com

Эта работа была поддержана в рамках ТЕМАТической области CGIAR Глобальная рисовая агропродовольственная система CRP, RICE, стрессоустойчивый рис для Африки и южной Азии (STRASA) Фаза III, и ИзН (Междисциплинарный центр исследований растениеводства, Галле (Сале), Германия. Мы благодарим Мэнди Пюффельд за отличную техническую помощь и д-ра Изабель Марию Мора-Рамирес за обмен информацией и опытом с помощью пшеничного чипа. Мы благодарим доктора Ронду Мейер (RG Heterosis, IPK Gatersleben, Германия) за комментарии и критические чтения рукописи.

<ol>
	<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+intact-tissue+sequencing+of+single-cell+transcriptional+states.">Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li><li>P&#252;ffeld, M., Seiler, C., Kuhlmann, M., Sreenivasulu, N., Butardo, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Developing+Rice+Grain+Transcriptome+Using+the+Agilent+Microarray+Platform.">Analysis of Developing Rice Grain Transcriptome Using the Agilent Microarray Platform.</a> Methods in Molecular Biology. 1892, 277-300 (2019).</li><li>Martin, L., Fei, Z., Giovannoni, J., Rose, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalyzing+plant+science+research+with+RNA-seq.">Catalyzing plant science research with RNA-seq.</a> Frontiers in Plant Science. 4 (66), (2013).</li><li>Hrdlickova, R., Toloue, M., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+methods+for+transcriptome+analysis.">RNA-Seq methods for transcriptome analysis.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).</li><li>Radchuk, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+profiling+of+starch+biosynthesis+and+degradation+in+the+developing+barley+grain.">Spatiotemporal profiling of starch biosynthesis and degradation in the developing barley grain.</a> Plant Physiology. 150 (1), 190-204 (2009).</li><li>Sreenivasulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+of+seeds:+deciphering+the+molecular+mechanisms+of+seed+storage,+dormancy+and+onset+of+germination.">Systems biology of seeds: deciphering the molecular mechanisms of seed storage, dormancy and onset of germination.</a> Plant Cell Reports. 36 (5), 633-635 (2017).</li><li>Sreenivasulu, N., Wobus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed-development+programs:+a+systems+biology-based+comparison+between+dicots+and+monocots.">Seed-development programs: a systems biology-based comparison between dicots and monocots.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 189-217 (2013).</li><li>Butardo, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+Genetics+Identifies+a+Novel+Regulatory+Domain+of+Amylose+Synthesis.">Systems Genetics Identifies a Novel Regulatory Domain of Amylose Synthesis.</a> Plant Physiology. 173 (1), 887-906 (2017).</li><li>de Guzman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+glycemic+potential+of+rice+by+unraveling+compositional+variations+in+mature+grain+and+starch+mobilization+patterns+during+seed+germination.">Investigating glycemic potential of rice by unraveling compositional variations in mature grain and starch mobilization patterns during seed germination.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5854 (2017).</li><li>Sreenivasulu, N., Sunkar, R., Wobus, U., Strickert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+platforms+and+bioinformatics+tools+for+the+analysis+of+plant+transcriptome+in+response+to+abiotic+stress.">Array platforms and bioinformatics tools for the analysis of plant transcriptome in response to abiotic stress.</a> Methods in Molecular Biology. 639, 71-93 (2010).</li><li>Anacleto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+a+genome-wide+association+study+with+a+large-scale+transcriptome+analysis+to+predict+genetic+regions+influencing+the+glycaemic+index+and+texture+in+rice.">Integrating a genome-wide association study with a large-scale transcriptome analysis to predict genetic regions influencing the glycaemic index and texture in rice.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2018).</li><li>Pietsch, C., Sreenivasulu, N., Wobus, U., Roder, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+mapping+of+putative+regulator+genes+of+barley+grain+development+characterized+by+expression+profiling.">Linkage mapping of putative regulator genes of barley grain development characterized by expression profiling.</a> BMC Plant Biology. 9, 4 (2009).</li><li>Druka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+gene+expression+from+seed+to+seed+through+barley+development.">An atlas of gene expression from seed to seed through barley development.</a> Functional &amp; Integrative Genomics. 6 (3), 202-211 (2006).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+Expression+Atlas+In+Reproductive+Development.">Rice Expression Atlas In Reproductive Development.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (12), 2060-2081 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+gene+expression+atlas+covering+the+entire+life+cycle+of+rice.">A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice.</a> The Plant Journal. 61 (5), 752-766 (2010).</li><li>Yamakawa, H., Hakata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+rice+grain+filling-related+metabolism+under+high+temperature:+Joint+analysis+of+metabolome+and+transcriptome+demonstrated+inhibition+of+starch+accumulation+and+induction+of+amino+acid+accumulation.">Atlas of rice grain filling-related metabolism under high temperature: Joint analysis of metabolome and transcriptome demonstrated inhibition of starch accumulation and induction of amino acid accumulation.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (5), 795-809 (2010).</li><li>Shakoor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sorghum+bicolor+expression+atlas+reveals+dynamic+genotype-specific+expression+profiles+for+vegetative+tissues+of+grain,+sweet+and+bioenergy+sorghums.">A Sorghum bicolor expression atlas reveals dynamic genotype-specific expression profiles for vegetative tissues of grain, sweet and bioenergy sorghums.</a> BMC Plant Biology. 14, 35 (2014).</li><li>Yu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+reveals+key+differentially+expressed+genes+involved+in+wheat+grain+development.">Transcriptome analysis reveals key differentially expressed genes involved in wheat grain development.</a> Crop Journal. 4 (2), 92-106 (2016).</li><li>Kochevenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+QTL+hot+spots+for+malting+quality+in+two+elite+breeding+lines+with+distinct+tolerance+to+abiotic+stress.">Identification of QTL hot spots for malting quality in two elite breeding lines with distinct tolerance to abiotic stress.</a> BMC Plant Biology. 18 (1), 106 (2018).</li></ol>

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов.

Описанный метод обеспечивает высоковоспроизводимые результаты для высокодоходных и высококачественных экстрактов РНК(рисунок 1). Основываясь на нашем опыте, мы рекомендуем три биологические репликации для одного генотипа, стадии или условия для анализа. Чтобы быть в состоянии обнаружить статистически значимые различия, общее изобилие мРНК должны быть рассмотрены. Пожалуйста, обратите внимание, однако, что начальное количество 200 мг образцов ткани требуется в трипликидляы для шага экстракции РНК. Следовательно, для экспериментов, которые имеют ограниченное количество образцов, таких как генетически модифицированные растительные материалы, этот метод может быть неуместным.
При гибридизации микроаррей наиболее важны следующие шаги: (1) загрузка образцов на горку прокладки (Шаг 4.7) и (2) промывание массивов после гибридизации (Шаги 4.13 и 4.14). Загрузка образцов должна быть сделана очень тщательно, чтобы избежать образования пузырьков и разлива жидкости. Осторожность необходима при размещении microarray слайд на прокладке слайд, содержащий загруженные образцы: ДНК-стороне (с пятнистыми зондами) должны быть лицом вниз, чтобы гибридизации. Для мытья микроаррей, второй шаг мытья особенно критично: здесь, удаление слайдов из буфера мытья 2 должно быть выполнено очень медленно (10 с), чтобы избежать буфера артефактов на слайдах, которые могут помешать сбору данных и анализу.
Для того, чтобы получить результаты эксперимента по гибридизации, которые имеют право на анализ биоинформатики ниже потока, следует следовать нескольким важным критериям. Отчет КК, который генерируется после выполнения вышеуказанного протокола, дает хорошее представление о том, что должно быть улучшено, а какие данные находятся в пригодном для использования состоянии(рисунок 3). Первая полученная информация является визуализированной сетки(рисунок 2). Здесь можно сразу увидеть, если все области для флуоресценции считывания правильно выровнены. При визуальном сдвиге это повлияет на все другие значения (фон, интенсивность сигнала и т.д.), и считывание этого чипа не может быть использовано. На обзоре (пространственное распределение всех выбросов) можно легко обнаружить любое загрязнение (например, пыль или волосы), которое повлияло на результат. Грязь может быть удалена путем мягкого дует и повторного сканирования чипа. Гистограмма сигнального участка, как упоминалось выше, должна привести к широкой кривой в форме Гаусса, и только незначительные выбросы (Рисунок 2). В зависимости от ткани проанализированы (Рисунок 1), эта кривая может выглядеть по-разному и может появиться иметь два пика, или один преобладающий пик с плечом. Это не повлияет на качество данных. Только сильный сдвинутый пик, или высокие сигналы по краям указывают на проблемы, такие как "зеленые монстры" (слишком высокая интенсивность флуоресценции), которые не могут быть удалены путем стирки и должны быть доведены до сведения производителя чипов. Кроме того, "График пространственного распределения для медианных сигналов" должен меняться вокруг общего значения. Это должно быть в диапазоне от 40 до 100, в зависимости от общей интенсивности считывания чипа проанализированы. Другим важным контролем качества является оценка всплеска данных: журнал-график для всплеска сигналов должен привести к линейной и регулярной линии. Наконец, таблица "метрики оценки" дает хорошее и надежное представление о полученных результатах. Здесь производитель предоставляет ряд значений, которые могут быть классифицированы как Отлично, Хорошо и оценить(рисунок 3). Согласно нашему опыту, некоторые ценности не всегда могут быть применены ко всем фишкам. Для чипсов, изготовленных на заказ риса, "неконтрольное значение" часто выходило из диапазона, но не оказывает существенного влияния на дальнейшую обработку данных. Кроме того, диапазон для "NegControl" может быть расширен, на основе ткани, организма и общего выхода чипа до злт;80. Диапазон для оценки значения E1 med CV может быть расширен до злт;9, а не lt;8 в соответствии с нашим опытом. После этого возможна надлежащая оценка всех данных, зачитаных чипами. В общем, всегда следует иметь в виду, что независимые биологические репликации всегда дают самый надежный результат.
Преимущество этого метода по сравнению с другими методами заключается в том, что он представляет собой экономически эффективный, высокопроизводительный метод транскрипционного профилирования. Кроме того, конвейер анализа данных ниже по течению проще и установиться. Несмотря на преимущества, существуют определенные ограничения этой техники, такие как количество генов, которые могут быть проанализированы. Микроаррей может только облегчить анализ генов, ранее замеченных зондов на массиве. Таким образом, этот метод применим только к видам растений с секвенированными геномами и полностью аннотированными генами. Мы предусматриваем, что транскриптомика на основе микроаррей будет по-прежнему очень полезной и актуальной не только для профилирования экспрессии генов, но и для других трубопроводов биоинформатики, таких как анализ регулятивной сети генов и исследование ассоциации в масштабах всей транскриптома.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/60602/obtaining-high-quality-transcriptome-data-from-cereal-seeds-modified">Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling</a>. Two&#160;author&#160;names were&#160;updated.
The&#160;names were&#160;corrected from:
Christianne&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreeenivasulu
to:
Christiane&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreenivasulu

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/60602/obtaining-high-quality-transcriptome-data-from-cereal-seeds-modified">Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling</a>. Two&#160;author&#160;names were&#160;updated.

Erratum: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Транскриптом представляет собой полный набор рибонуклеиновой кислоты (РНК) стенограммы, выраженные генома организма в данный момент времени и, в частности, экологических и условий роста. Каждая клетка имеет свою индивидуальную транскриптом, которая отражает ее текущее физиологичебное и метаболическое состояние. Коллекция клеток, полученных из аналогичных тканей или органов используется в типичном исследовании транскриптома, но одноклеточные и пространственно-решенной транскриптомики становятся популярными1. Транскриптомический анализ начинается с извлечения общей РНК из выбранной ткани в определенный момент времени и в определенных условиях роста. Для этого мы рекомендуем использовать недавно разработанный метод извлечения общей РНК из образцов с высоким содержанием крахмала или сахара, таких как семена зерновых2. Сравнение транскриптомов между различными образцами приводит к идентификации молекул РНК с разным изобилием. Эти молекулы РНК считаются дифференциально выраженными генами (DEGs). Обилие транскриптов, полученных из конкретных генов маркеров, может затем использоваться для оценки состояния развития или определения реакции организма на колебания окружающей среды. Гены без обнаруживаемых изменений в их изобилии транскрипта через изыскивая времени развития часто использованы как справка или гены housekeeping.
РНК, как правило, обнаруживается и количественно определяется различными методами, такими как северная blotting и количественная обратная транскриптаза полимеразной цепной реакции (qRT-PCR), но нынешние методы транскриптомики высокой пропускной способности в значительной степени опираются на гибридизацию нуклеиновой кислоты с использованием технологии микроаррейка, а также секвенирования РНК (RNA-Seq). RNA-Seq очень популярен в настоящее время, поскольку он предоставляет несколько преимуществ для высокой пропускной транскриптомической приложений, как рассмотрены в другом месте3,4. Хотя более старая технология, профилирование экспрессии генов с использованием микросхем микросхем по-прежнему широко используется, потому что это более устоявшаяся технология, которая требует меньше фона в биоинформатике. По сравнению с RNA-Seq наборы данных, полученные в результате экспериментов на микроархе, меньше и их легче анализировать. Кроме того, он является более рентабельным, особенно если речь идет о больших числах выборки. В нашей лаборатории мы регулярно используем транскриптомические анализы с использованием технологии microarray для определения роли центральных регуляторных центров, которые регулируют молекулярные сети и пути, участвующие в росте, развитии и метаболизме зерновых5,6,7,8,9. Мы также регулярно использовать его для проведения генома всей генной экспрессии профилирования исследований для получения механистического понимания реакции зерновых зерновых на абиотических стрессов10, а также в проведении транскриптома всей ассоциации (TWAS) и ссылка картографических исследований для выявления генов, ответственных за качество зерновых зерна и питания11,12. Другие группы также использовали технологию microarray в обеспечении разработки конкретных атлас экспрессии генов в ячмень13, рис14,15,16, сорго17, и пшеница18.
Цель юга состоит в том, чтобы предоставить краткое текстовое резюме и подробное визуальное описание метода, который мы в настоящее время используем в нашей лаборатории для транскриптомического профилирования зерновых с использованием платформы Agilent microarray. Обратите внимание, что другие платформы microarray доступны, но не будут охвачены этим методом. Мы начинаем протокол с представления подробного описания извлечения РНК из развивающихся или прорастающих семян зерновых. Основываясь на нашем опыте, получение высококачественного и высокого количества транскриптома поддается вниз по течению транскриптомического анализа часто является узким местом при использовании тканей семян зерновых. Мы пробовали несколько коммерчески доступных комплектов извлечения РНК, но ни один из них не дал удовлетворительных результатов. Таким образом, мы разработали протокол химической добычи для получения сырой экстрактА РНК, который затем подвергается очистке колонки с помощью коммерчески доступного комплекта. Используя этот метод, мы регулярно и воспроизводим получать высокое качество РНК2 (Рисунок 1), которые могут быть использованы для различных приложений вниз по течению для создания профиля транскриптома.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td>Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>To determine quality and quantity of RNA extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crushed ice maker</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>To keep samples on ice during sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar flask</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>Used as liquid nitrogen container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Hybridization Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5242</td>
			<td>Kit components: 
			2X Hi-RPM Hybridization Buffer 
			25X Fragmentation Buffer 
			10X Gene Expression Blocking Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Wash buffer Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5325</td>
			<td>Kit components: 
			Gene Expression Wash Buffer 1 
			Gene Expression Wash Buffer 2 
			Triton X-102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2545A</td>
			<td>Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization gasket slide kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534-60014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQAir air cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9866.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free paper, Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>KC34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Input Quick Amp Labeling Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-2305</td>
			<td>Kit components: 
			T7 Primer 
			5x First Strand Buffer 
			0.1M DTT 
			10 mM dNTP Mix 
			AffinityScript RNAse Block Mix 
			5x Transcription Buffer 
			NTP Mix 
			T7 RNA Polymerase Blend 
			Nuclease-free water 
			Cyanine 3-CTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spatula, small</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes, nuclease-free</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>2.0 mL and 1.5 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td>It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110-230V</td>
			<td>Any small incubator will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and pestle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td>Peqlab / Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>351900302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-Color RNA Spike-In Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5188-5282</td>
			<td>Kit components: 
			One color RNA Spike-Mix 
			Dilution Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ozone barrier slide cover kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2505-60550</td>
			<td>Optional but highly recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube, 0.2 mL, RNase-free</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>Z376426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A156.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, nuclease free, filter tips</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor set</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Extraction Buffer</td>
			<td>10 mM Tri-HCl pH 8.0 
			150 mM LiCl 
			50 mM EDTA 
			1.5% EDTA 
			15 ul/mL &#946;-mercaptoethanol</td>
			<td></td>
			<td>We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add &#946;-mercaptoethanol fresh daily</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Kit components: 
			RNeasy mini spin column (pink) 
			1.5 ml collection tubes 
			2 ml collection tubes 
			Buffer RLT 
			Buffer RW 
			Buffer RPE 
			Nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74904</td>
			<td>Kit components: 
			RNeasy mini spin column (pink) 
			QIAshredder spin column (purple) 
			1.5 ml collection tubes 
			2 ml collection tubes 
			Buffer RLT 
			Buffer RLC 
			Buffer RW1 
			Buffer RPE 
			Nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide holders for DNA microarray scanner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2505-60525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide staining dish with removable rack</td>
			<td>DWK Life Sciences 900200</td>
			<td>Fisher Scientific 08-812</td>
			<td>We recommend DWK Life Sciences Wheaton&#8482; Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultralow temperature freezer</td>
			<td>Various brand</td>
			<td></td>
			<td>Capable of storing sample at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds by a modified method for gene expression profiling

Характеристика экспрессии генов зависит от качества РНК. При прорастании, развитии и созревании семян зерновых добыче высококачественной РНК часто препятствует высокое содержание крахмала и сахара. Эти соединения могут снизить как урожайность, так и качество извлекаемых РНК. Ухудшение количества и качества общей РНК может впоследствии оказать значительное влияние на транскриптомический анализ вниз по течению, который может не точно отражать пространственные и/или временные изменения в профиле экспрессии генов тестируемых образцов. В этом протоколе мы описываем оптимизированный метод извлечения общей РНК с достаточным количеством и качеством, который будет использоваться для анализа цельного транскриптома зерновых культур. Описанный метод подходит для нескольких вниз по течению приложений, используемых для транскриптомического профилирования развивающихся, прорастание, и зрелые семена зерновых. Показан метод профилирования транскриптома с помощью платформы microarray. Этот метод специально разработан для профилирования экспрессии генов зерновых с описанными последовательностями генома. Описана подробная процедура от обработки микроаррей до окончательного контроля качества. Это включает в себя синтез кДНК, маркировку cRNA, гибридизацию микроаррей, сканирование слайдов, извлечение функций и проверку качества данных. Данные, генерируемые этим методом, могут быть использованы для характеристики транскриптома зерновых во время прорастания, на различных стадиях развития зерна, или в различных биотических или абиотических условиях стресса. Представленные здесь результаты иллюстрируют высококачественные транскриптомные данные, поддающиеся анализу биоинформатики, таким как определение дифференциально выраженных генов (DEGs), характеристика сетей регулятивного гена и проведение исследования ассоциации в масштабах транскриптома (TWAS).

Этот метод оптимизирован для извлечения образцов семян зерновых, содержащих значительное количество загрязняющих крахмала или сахара. Он предназначен для извлечения общей РНК из 24 образцов семян в день. Она должна проводиться непрерывно в один день, но по всему протоколу определяются дополнительные точки остановки и паузы. Кроме того, читатель может использовать свои предпочтительные комплекты извлечения РНК или ручной метод химической добычи. Однако, основываясь на нашем предыдущем опыте, коммерчески доступные наборы для извлечения РНК растений не подходят для семян из-за значительного количества крахмала, белков, сахара и/или липидного загрязнения. В описанном методе химическая добыча сырой РНК сопровождается очисткой столба с использованием коммерческого комплекта для извлечения РНК. Это обычно обеспечивает РНК с более высоким качеством и выходом. На рисунке 1 показан результат запуска BioAnalyzer для проверки качества извлечения РНК с помощью описанного здесь метода. Результаты представлены для листьев ячменя (образцы 1 и 2, представляющие низкое содержание крахмала образцы) и семена ячменя (образцы 3 и 4, представляющие высокий содержание крахмала образцов). Значение целостности РНК (RIN) для всех образцов составляет 10.
На рисунке 1 показан представительный гель очищенного экстракта РНК, где качество было протестировано с помощью биоанализа. Образцы 1 и 2 являются типичными результатами для образцов низкого содержания крахмала, таких как листья ячменя, где видны дополнительные полосы рРНК из хлоропластов. Образцы 3 и 4 являются репрезентативными результатами для образцов высокого содержания крахмала, таких как семена ячменя, показывающие 18S и 28S rRNA. Обратите внимание, что никакая автоматизированная стоимость RIN не может быть рассчитана для зеленых тканей растений, таких как образцы листьев, из-за хлоропластовой rRNA. Тем не менее, целостность и высокое качество могут быть визуально установлены на отсутствие каких-либо продуктов деградации, которая обычно появляется как низкий молекулярный мазок. Значение RIN для образцов семян высокого крахмала, таких как семена ячменя, как правило, 10 с использованием протокола, описанного в настоящей работе.
Кроме того, мы также представляем здесь репрезентативные данные эксперимента курса времени двух элитных линий ячменя (Sofiara и Victoriana), используемых для анализа качества солода19. Во время солодового процесса крахмал преобразуется в сахар. Поэтому в образцах представлены ткани с различной пропорцией содержания крахмала и сахара. Поскольку процесс промышленного солодовки похож на процесс прорастания, были проанализированы транскриптомы двух линий ячменя, отличающихся по качеству солодового. РНК были извлечены из прорастающих семян на 2, 24, 48, 72, 120, 144 и 196 h после впитывания в биологических трипликатов. Подготовка РНК и гибридизация к настроенному чипу микроаррей ячменя были выполнены, как описано выше. Рисунок 2 указывает на нормализованную сетку, зачитанную из гибридизации микроарла, приведенной в отчете по контролю качества (кВ)(рисунок 3)и графике гистограммы для обнаруженных сигналов. Сетка приводит пример производных сигналов из каждого угла чипа, включая фон и пик-в считывании точек, используемых для калибровки. Гистограмма указывает на отклонение обнаруживаемых точек с соответствующей интенсивностью сигнала. Успешная гибридизация дает широкую гауссовскую кривую с незначительными выбросами, как показано на рисунке. Неудачные гибридизации могут привести к сильному сдвигу в одну сторону ("зеленые монстры").
Наконец, репрезентативный результат приемлемых значений отображается в столбце 4 на рисунке 3. Чтобы показать надежность проведенных экспериментов, результаты оцениваются с помощью программного обеспечения GeneSpring. Собранные данные представлены в качестве основного компонентного анализа (PCA). PCA интегрирует значения выбранных точек (генов) в качестве вектора. Количество используемых точек может варьироваться от нескольких сотен до всего чипа и зависеть от используемого программного обеспечения. Каждый чип (образец) приводит к одному значению (вектору), которое является результатом интегрированной интенсивности сигнала для исследуемых точек. Таким образом, относительное положение в графике (PCA) указывает на сходство образцов друг с другом. Чем ближе образцы, тем они больше похожи. Технические репликации должны быть ближе друг к другу, чем биологические, а биологические репликации образца должны сгруппироваться ближе друг к другу, чем образцы из разных временных точек, тканей или условий.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig1.jpg"> Рисунок 1: Электрофорез файл запустить резюме, полученное после проверки качества РНК с Bioanalyzer. Образцы 1 и 2 представляют сярю ячмена, как указано дополнительными рибосомными полосами из хлоропластов. Образцы 3 и 4 представляют собой ткань семян ячменя с 18S и 28S rRNA полос ы показано. Коэффициент RIN не всегда рассчитывается для зеленых тканей, таких как листья, но в соответствии с гель, качество РНК очень хорошо. Значение RIN для образцов 3 и 4 составляет 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig2.jpg"> Рисунок 2: Отчет о КК от успешной гибридизации ячменя microarray. А- указывает на обнаруженные сигналы на сетке со всех углов чипа. Гистограмма показывает количество сигналов, классифицированных в соответствии с интенсивностью сигнала (флуоресценция) как logarithm после фонового вычитания. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig3.jpg"> Рисунок 3: Резюме контроля качества (КК) после гибридизации и сканирования. Значения для гибридизированного слайда приведены в столбце 2 (значение), а диапазон приемлемых значений отображается в столбце 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Уош палата Ассамблеи</td>
			<td>Содержимое и этикетка</td>
			<td>Цель</td>
		</tr>
<tr>
<td>Блюдо 1</td>
			<td>Пустые, оставьте на лабораторной скамейке до следующего дня</td>
			<td>Заполните с мытьем буфера 1 на следующий день, используется для разборки microarray слайды</td>
		</tr>
<tr>
<td>Блюдо 2</td>
			<td>Добавьте одну стойку слайда microarray и небольшую магнитную панель перемешивания; этикетка с "Wash Buffer 1", оставьте на лабораторной скамейке до следующего дня</td>
			<td>Используется для мытья microarray слайды с мытью буфера 1 на следующий день</td>
		</tr>
<tr>
<td>Блюдо 3</td>
			<td>Добавьте одну небольшую магнитную панель перемешивания, наклейте этикеткой с надписью "Wash Buffer 2" и поместите в мини-инкубатор 37 градусов по Цельсию.</td>
			<td>Используется для мытья microarray слайды с мытью буфера 2 на следующий день внутри 37 КК мини-инкубатор</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Подготовка сборок стиральной камеры.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Шаги</td>
			<td>Блюдо</td>
			<td>Вымойте буфер</td>
			<td>Температура</td>
			<td>Время</td>
		</tr>
<tr>
<td>Разборка</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">Окружающей среды</td>
			<td rowspan="2">Как можно быстрее</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Шаг 4.13)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Первая стирка</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">Окружающей среды</td>
			<td rowspan="2">1 мин.</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Шаг 4.14)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Вторая стирка</td>
			<td rowspan="2">3</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">37 кк</td>
			<td rowspan="2">1 мин.</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Шаг 4.15)</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2: Температура инкубации и время сборки стиральной камеры.

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling at JoVE.com

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Представлен метод транскриптомного профилирования зерновых. Профилирование экспрессии генов на основе микроаррей начинается с изоляции высококачественной тотальной РНК от зерновых зерен и продолжается с генерацией кДНК. После маркировки cRNA и гибридизации микроаррей даются рекомендации по обнаружению сигналов и контролю качества.

Получение высококачественных транскриптомных данных из зерновых семян с помощью модифицированного метода профилирования экспрессии генов

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Этот метод гибридизации микроаррей полезен для сравнения большого количества образцов из организма с известным геномом. По сравнению с подходом к секвенированию с высокой пропускной способностью объем данных, генерируемых этим методом, гораздо проще в обработке и далее, его можно анализировать более рентабельным способом. Демонстрация процедуры будет д-р Кристиан Зайлер пост-докторской ученый, работающий в исследовательской группе в Rosis в IPK в Gatersleben.Перед выполнением микроаррей гибридизации с использованием набора гибридизации экспрессии генов, подготовить 10X блокирующий агент в соответствии со спецификациями производителя и aliquot в результате блокирующего агента в 200 микролитер томов. Затем храните блокирующий агент при температуре минус 20 градусов по Цельсию до его использования. В день гибридизации микроаррей, оттепель один 200 микролитер aliquot 10X блокирующий агент на льду и довоенную печь гибридизации до 65 градусов по Цельсию и тепловой блок до 60 градусов по Цельсию.Подготовьте смесь фрагментации для каждого образца, описанную производителем, и аккуратно смешайте образцы на вихре. После вихря, кратко спина вниз образцов в микроцентрифуге перед инкубацией в течение ровно 30 минут в 60 градусов по Цельсию теплового блока. В конце инкубации, немедленно охладить каждую трубку на льду в течение одной минуты, прежде чем остановить фрагментацию с 25 микролитров 2X буфера гибридизации экспрессии генов, высокие обороты в минуту на трубку.Смешайте с нежным пипетки, принимая большую осторожность, чтобы не ввести пузырьки, и центрифуга труб в окружающей комнатной температуре. В конце спина немедленно поместите все трубки на лед и загрузите каждый образец в микроаррей слайд как можно быстрее. Далее, медленно обойтись 44 микролитров каждой гибридизации смеси в центре каждой скважины прокладки, заботясь, чтобы избежать введения пузырьков, и добавить 44 микролитров буфера гибридизации в любой неиспользованных скважин.Сразу же поместите микроаррей слайд в правильной ориентации на верхней части прокладки слайда, заботясь, чтобы не пролить жидкость, и плотно закрыть сборку гибридизации. Поверните сборку, чтобы подтвердить отсутствие стационарных пузырьков воздуха и поместите сборку камеры гибридизации в ротатор печи гибридизации. Установите скорость вращения до 10 оборотов в минуту, а затем начните гибридизацию при 65 градусах по Цельсию ровно на 17 часов.В то время как образцы гибридизируются, подготовьте три сборки мытья посуды в соответствующих буферах мытья, как указано в таблицах. После ровно 17 часов гибридизации, разобрать одну камеру гибридизации на лабораторной скамейке выстроились с ворсинкой свободной бумаги и передачи одного микроаррей бутерброд с блюдом, содержащим мыть буфер один с микроаррей штрих-код, стоящий в наклонном положении, не погружая весь слайд в буфер. Используя тиски, отделить два стеклянных слайдов и пусть прокладка слайд падение мягко в нижней части блюда, сохраняя при этом твердое сцепление с микроаррей слайд.Медленно поднимите микроаррей слайд боком для немедленной передачи в стойку microarray в блюдо два с минимальным воздействием воздуха. Когда все восемь слайдов были равномерно размещены вдоль стойки, прикрепите держатель стойки и перенесите всю установку блюда на магнитный мешалка. Перемешать установку осторожно ровно на одну минуту.В то время как образцы перемешивают, передача блюдо три из 37 градусов по Цельсию инкубатор на второй магнитный мешалка. Затем аккуратно добавить 37 градусов по Цельсию мыть буфер два блюдо три без формирования пузырьков. В конце перемешивания инкубации, осторожно и медленно передать слайд стойку блюдо три и удалить держатель стойки.После перемешивания в течение ровно одной минуты, медленно и осторожно удалить слайд стойку из блюда и использовать ворсинку свободной бумаги, чтобы тщательно высушить обе стороны каждого слайда, размещение каждого слайда в слайд-бокс, как он высушивается. После того, как слайды высохнут в течение 15 минут, перенесите каждый микроаррей слайд в держатель слайда со штрих-кодом вверх и загрузите собранные держатели слайдов в сканирующей карусели и последовательности в соответствии с номером штрих-кода. Затем немедленно сканируйте слайды.На этом рисунке показан репрезентативный результат запуска для проверки качества извлечения РНК. В типичных анализах образцов низкого содержания крахмала, таких как листья ячменя, видны дополнительные рибосомные РНК-полосы из хлоропластов. Образцы с высоким содержанием крахмала, такие как семена ячменя, демонстрируют 18 и 28S рибосомную РНК.Обратите внимание, что не автоматизированное значение числа целостности РНК может быть рассчитано для зеленых тканей растений, таких как образцы листьев, из-за хлоропласт рибосомной РНК. В этом репрезентативном анализе, подготовка РНК и гибридизация на заказ чипа микроаррей ячменя были выполнены, как попродемонстрировано. Сетка показывает пример полученных сигналов из каждого угла чипа, включая фон и всплеск точек считывания, используемых для калибровки.Гистограмма указывает на отклонение обнаруживаемых точек с соответствующей интенсивности сигнала. Как отмечается, успешная гибридизация дает широкую гауссийской кривой с незначительными выбросами. Здесь показан отчет о контроле качества обнаруженных сигналов.Значения для гибридизированного слайда даются во второй колонке, а диапазон допустимых значений отображается в столбце 4. Этот метод может быть использован для решения любых экспериментальных создан для любого организма, где существенная информация о геноме доступна. Использование этого метода в нашей лаборатории позволило нам сравнить и проанализировать транскрипционные изменения в рисе и ячмене, которые происходят после индукции стресса роста.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Эффективный метод для выделения высокоочищенного РНК из семян для использования в количественном анализе Транскриптом

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Метод на основе фильтрации на основе высококачественных ядер из сшитой скелетной мышцы для иммунопреципитации хроматина

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Глубокая протеома профилирование Изобарический маркировки, обширные жидкостная хроматография, масс-спектрометрии и при содействии программного обеспечения количественной оценки

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Экстракции кофеина, ферментативной активности и экспрессии генов синтетазы кофеин из суспензий клеток растений

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

Биосинтез флавона на флаваноне путем создания одногоршкового биензиматического каскада

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

НитропептидНое профилирование и идентификация Иллюстрировано Ангиотензином II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Распознавание последовательности ДНК с помощью высокопроходимых профилирований primase

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Высокое разрешение Комплекс Профилирование криосликинг BN-MS Анализ

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

Приготовление высококачественного ферментированного рыбного продукта

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...