Name: obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds by a modified method for gene expression profiling
Uploaded: 2020-05-21T13:00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling at JoVE.com

Detta arbete har fått stöd inom det tematiska området CGIAR Global Rice Agri-Food System CRP, RICE, Stresstolerant Rice for Africa and South Asia (STRASA) Phase III, och IZN (Interdisciplinary Centre for Crop Plant Research, Halle (Saale), Tyskland. Vi tackar Mandy Püffeld för hennes utmärkta tekniska hjälp och Dr Isabel Maria Mora-Ramirez för att dela information och erfarenhet med vete chip. Vi tackar Dr Rhonda Meyer (RG Heterosis, IPK Gatersleben, Tyskland) för kommentarer och kritiskt läsa manuskriptet.

<ol>
	<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+intact-tissue+sequencing+of+single-cell+transcriptional+states.">Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li><li>P&#252;ffeld, M., Seiler, C., Kuhlmann, M., Sreenivasulu, N., Butardo, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Developing+Rice+Grain+Transcriptome+Using+the+Agilent+Microarray+Platform.">Analysis of Developing Rice Grain Transcriptome Using the Agilent Microarray Platform.</a> Methods in Molecular Biology. 1892, 277-300 (2019).</li><li>Martin, L., Fei, Z., Giovannoni, J., Rose, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalyzing+plant+science+research+with+RNA-seq.">Catalyzing plant science research with RNA-seq.</a> Frontiers in Plant Science. 4 (66), (2013).</li><li>Hrdlickova, R., Toloue, M., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+methods+for+transcriptome+analysis.">RNA-Seq methods for transcriptome analysis.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).</li><li>Radchuk, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+profiling+of+starch+biosynthesis+and+degradation+in+the+developing+barley+grain.">Spatiotemporal profiling of starch biosynthesis and degradation in the developing barley grain.</a> Plant Physiology. 150 (1), 190-204 (2009).</li><li>Sreenivasulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+of+seeds:+deciphering+the+molecular+mechanisms+of+seed+storage,+dormancy+and+onset+of+germination.">Systems biology of seeds: deciphering the molecular mechanisms of seed storage, dormancy and onset of germination.</a> Plant Cell Reports. 36 (5), 633-635 (2017).</li><li>Sreenivasulu, N., Wobus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed-development+programs:+a+systems+biology-based+comparison+between+dicots+and+monocots.">Seed-development programs: a systems biology-based comparison between dicots and monocots.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 189-217 (2013).</li><li>Butardo, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+Genetics+Identifies+a+Novel+Regulatory+Domain+of+Amylose+Synthesis.">Systems Genetics Identifies a Novel Regulatory Domain of Amylose Synthesis.</a> Plant Physiology. 173 (1), 887-906 (2017).</li><li>de Guzman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+glycemic+potential+of+rice+by+unraveling+compositional+variations+in+mature+grain+and+starch+mobilization+patterns+during+seed+germination.">Investigating glycemic potential of rice by unraveling compositional variations in mature grain and starch mobilization patterns during seed germination.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5854 (2017).</li><li>Sreenivasulu, N., Sunkar, R., Wobus, U., Strickert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+platforms+and+bioinformatics+tools+for+the+analysis+of+plant+transcriptome+in+response+to+abiotic+stress.">Array platforms and bioinformatics tools for the analysis of plant transcriptome in response to abiotic stress.</a> Methods in Molecular Biology. 639, 71-93 (2010).</li><li>Anacleto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+a+genome-wide+association+study+with+a+large-scale+transcriptome+analysis+to+predict+genetic+regions+influencing+the+glycaemic+index+and+texture+in+rice.">Integrating a genome-wide association study with a large-scale transcriptome analysis to predict genetic regions influencing the glycaemic index and texture in rice.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2018).</li><li>Pietsch, C., Sreenivasulu, N., Wobus, U., Roder, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+mapping+of+putative+regulator+genes+of+barley+grain+development+characterized+by+expression+profiling.">Linkage mapping of putative regulator genes of barley grain development characterized by expression profiling.</a> BMC Plant Biology. 9, 4 (2009).</li><li>Druka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+gene+expression+from+seed+to+seed+through+barley+development.">An atlas of gene expression from seed to seed through barley development.</a> Functional &amp; Integrative Genomics. 6 (3), 202-211 (2006).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+Expression+Atlas+In+Reproductive+Development.">Rice Expression Atlas In Reproductive Development.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (12), 2060-2081 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+gene+expression+atlas+covering+the+entire+life+cycle+of+rice.">A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice.</a> The Plant Journal. 61 (5), 752-766 (2010).</li><li>Yamakawa, H., Hakata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+rice+grain+filling-related+metabolism+under+high+temperature:+Joint+analysis+of+metabolome+and+transcriptome+demonstrated+inhibition+of+starch+accumulation+and+induction+of+amino+acid+accumulation.">Atlas of rice grain filling-related metabolism under high temperature: Joint analysis of metabolome and transcriptome demonstrated inhibition of starch accumulation and induction of amino acid accumulation.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (5), 795-809 (2010).</li><li>Shakoor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sorghum+bicolor+expression+atlas+reveals+dynamic+genotype-specific+expression+profiles+for+vegetative+tissues+of+grain,+sweet+and+bioenergy+sorghums.">A Sorghum bicolor expression atlas reveals dynamic genotype-specific expression profiles for vegetative tissues of grain, sweet and bioenergy sorghums.</a> BMC Plant Biology. 14, 35 (2014).</li><li>Yu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+reveals+key+differentially+expressed+genes+involved+in+wheat+grain+development.">Transcriptome analysis reveals key differentially expressed genes involved in wheat grain development.</a> Crop Journal. 4 (2), 92-106 (2016).</li><li>Kochevenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+QTL+hot+spots+for+malting+quality+in+two+elite+breeding+lines+with+distinct+tolerance+to+abiotic+stress.">Identification of QTL hot spots for malting quality in two elite breeding lines with distinct tolerance to abiotic stress.</a> BMC Plant Biology. 18 (1), 106 (2018).</li></ol>

Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Den beskrivna metoden ger mycket reproducerbara resultat för rna-extrakt av hög avkastning och hög kvalitet (figur 1). Baserat på vår erfarenhet rekommenderar vi tre biologiska replikat för en genotyp, stadium eller tillstånd för analys. För att kunna upptäcka statistiskt meningsfulla skillnader måste det allmänna överflödet av mRNA beaktas. Observera dock att en startmängd på 200 mg vävnadsprover krävs i tre exemplar för RNA-extraktionssteget. För experiment som har en begränsad mängd prover, såsom genetiskt modifierade växtmaterial, kan denna metod därför inte vara lämplig.
Under mikroarrayhybridisering är följande steg mest kritiska: (1) att ladda proverna till packningsbilden (steg 4.7) och (2) tvätta matriserna efter hybridisering (steg 4.13 och 4.14). Provlastning måste göras mycket noggrant för att undvika bubbelbildning och vätskespill. Försiktighet är nödvändigt när mikroarraybilden läggs på packningsbilden som innehåller de laddade proverna: DNA-sidan (med fläckiga sonder) ska vara vänd nedåt för att möjliggöra hybridisering. För att tvätta mikroarrayerna är det andra tvättsteget särskilt kritiskt: här måste du ta bort bilderna från tvättbufferten 2 mycket långsamt (10 s) för att undvika buffertartefakter på bilderna, vilket kan störa datainsamling och analyser.
För att få resultat från hybridiseringsexperimentet som är berättigade till nedströms bioinformatikanalys bör man följa några viktiga kriterier. QC-rapporten, som genereras efter protokollets prestanda ovan, ger en god uppfattning om vad som bör förbättras och vilka data som är i användbart skick (figur 3). Den första information som tas emot är det visualiserade rutnätet (figur 2). Här kan man direkt se om alla områden för fluorescensavläsning är korrekt anpassade. Om det finns en visuellt detekterbar förskjutning, kommer detta att påverka alla andra värden (Bakgrund, signalintensitet, etc.) och avläsningen av detta chip kan inte användas. På överblicken (Rumslig fördelning allra Avvikare), en kan lätt fläcka någon förorening (e.g., damma av eller hår), som påverkade resultatet. Smuts kan avlägsnas genom att mjukt blåsa och skanna chippet. Histogrammet av signalområdet som nämnts ovan bör resultera i en bred Gauss-formad kurva, med endast mindre extremvärden (figur 2). Beroende på vävnaden analyseras (figur 1), denna kurva kan se annorlunda ut och kan tyckas ha två toppar, eller en dominerande topp med en axel. Detta kommer inte att påverka uppgifternas kvalitet. Endast en stark förskjuten topp, eller höga signaler på kanterna indikerar problem, såsom "gröna monster" (för hög fluorescensintensiteter), som inte kan tas bort genom tvätt och bör rapporteras till chiptillverkaren. Dessutom bör "Spatial Distribution graph for Median Signals" variera kring ett gemensamt värde. Detta bör vara i intervallet mellan 40 och 100, beroende på den allmänna intensiteten avläsning av chip analyseras. En annan viktig kvalitetskontroll är utvärderingen av topp i data: Loggdiagrammet för topp i signaler bör resultera i en linjär och regelbunden linje. Slutligen ger tabellen över "utvärderingsmått" en bra och tillförlitlig bild av de mottagna resultaten. Här tillhandahåller tillverkaren en rad värden som kan klassificeras som utmärkta, bra och utvärdera(figur 3). Enligt vår erfarenhet kan vissa värden inte alltid tillämpas för alla marker. För ris anpassade marker, "nonControl värde" var ofta utom räckhåll men påverkar inte signifikant ytterligare databehandling. Dessutom kan intervallet för "NegControl" utökas, baserat på vävnad, organism och allmän produktion av Chip till <80. Intervallet för utvärdering av värde E1 med CV kan utökas till <9, istället för <8 enligt vår erfarenhet. Efter detta är en korrekt utvärdering av alla chip avläsa data möjligt. I allmänhet bör man alltid komma ihåg att oberoende biologiska replikat alltid ger det mest tillförlitliga resultatet.
Fördelen med denna teknik jämfört med andra metoder ligger i det faktum att det representerar en kostnadseffektiv, hög genomströmning metod för transkriptionell profilering. Dessutom är dataanalyspipelinen i efterföljande led lättare och mer etablerad. Trots fördelar finns det vissa begränsningar av denna teknik, såsom antalet gener som kan analyseras. Mikroarrayen kan bara underlätta analysen av gener som tidigare upptäckta sonder på matrisen. Därför är denna teknik endast tillämplig på växtarter med sekvenserade genom och helt kommenterade gener. Vi föreställer oss att de mikroarraybaserade transkriptomikerna kommer att fortsätta att vara mycket användbara och relevanta inte bara för genuttrycksprofilering utan även för andra nedströms bioinformatikpipelpipelar som genreglerande nätverksanalyser och transkriptomomfattande associationsstudie.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/60602/obtaining-high-quality-transcriptome-data-from-cereal-seeds-modified">Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling</a>. Two&#160;author&#160;names were&#160;updated.
The&#160;names were&#160;corrected from:
Christianne&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreeenivasulu
to:
Christiane&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreenivasulu

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/60602/obtaining-high-quality-transcriptome-data-from-cereal-seeds-modified">Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling</a>. Two&#160;author&#160;names were&#160;updated.

Erratum: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Transkriptom representerar den fullständiga uppsättningen av avskrifter av ribonukleic acid (RNA) uttryckt av en organisms arvsmassa vid en viss tidpunkt och i synnerhet miljö- och tillväxtförhållanden. Varje cell har sin individuella transkriptom, vilket återspeglar dess nuvarande fysiologiska och metaboliska tillstånd. En samling celler som härrör från en liknande vävnad eller organ används i en typisk transkriptom studie, men encelliga och rumsligt löst transkriptomik blir populär1. Transkriptomiska analyser börjar med extraktion av det totala RNA från en vald vävnad vid en viss tidpunkt och under definierade tillväxtförhållanden. För detta ändamål rekommenderar vi användning av en nyutvecklad metod för utvinning av totalt RNA från prover med hög stärkelse- eller sockerhalt, såsom spannmålsfrön2. Jämförelsen av transkriptomer mellan olika prover resulterar i identifiering av RNA-molekyler med olika överflöd. Dessa RNA-molekyler anses vara differentiellt uttryckta gener (DEGs). Överflödet av transkriptioner som härrör från specifika markörgener kan sedan användas för att uppskatta utvecklingsstatus eller bestämma en organisms reaktion på miljöfluktuationer. Gener utan påvisbara förändringar i sin avskrift överflöd över utvecklingstidpunkter under studie används ofta som referens eller hushållning gener.
RNA är vanligtvis upptäcks och kvantifieras med olika metoder, såsom norra blotting och kvantitativa omvänd transkriptas polymeras kedjereaktion (qRT-PCR), men nuvarande hög genomströmning transkriptomik metoder är starkt beroende av nukleinsyra hybridisering med microarray teknik samt RNA sekvensering (RNA-Seq). RNA-Seq är mycket populär för närvarande eftersom det ger flera fördelar för hög genomströmning transkriptom applikationer som granskats någon annanstans3,4. Även om en äldre teknik, genuttryck profilering med microarray chips används fortfarande i stor utsträckning eftersom det är en mer etablerad teknik, som kräver mindre av en bakgrund i bioinformatik. Jämfört med RNA-Seq är de datamängder som genereras från mikroarrayexperiment mindre och lättare att analysera. Dessutom är det mer kostnadseffektivt, särskilt om det handlar om stora urvalsnummer. I vårt laboratorium använder vi rutinmässigt transkriptomanalyser med hjälp av mikroarrayteknik för att avgöra vilken roll centrala regleringsnav som styr de molekylära nätverk och vägar som är involverade i tillväxt, utveckling och metabolism av spannmål5,,6,,7,,8,9. Vi använder den också rutinmässigt för att genomföra genomomfattande studier av genuttrycksprofilering för att få en mekanistisk förståelse av spannmålskornens reaktion på abiotiska påfrestningar10,samt i genomförandet av transkriptomomfattande associationsstudier (TWAS) och sammanlänkningskartläggningsstudier för att identifiera gener som ansvarar för spannmålskornskvalitet och näring11,12. Andra grupper har också använt microarray-tekniken för att tillhandahålla utvecklingsspecifik genuttrycksatlas i korn13, ris14,15,16, sorghum17och vete18.
Syftet med denna publikation är att ge en kort textsammanfattning och en detaljerad visuell beskrivning av den metod vi för närvarande använder i vårt laboratorium för transkriptomisk profilering av spannmål med hjälp av en Agilent microarray plattform. Observera att andra microarray-plattformar finns tillgängliga, men kommer inte att omfattas av denna metod. Vi börjar protokollet genom att presentera en detaljerad beskrivning av RNA utvinning från att utveckla eller gro spannmål frön. Baserat på vår erfarenhet, att få en hög kvalitet och hög mängd transkriptom mottagliga för nedströms transkriptomiska analyser är ofta flaskhalsen vid användning av spannmålsfrö vävnader. Vi har provat flera kommersiellt tillgängliga RNA-extraktionssatser, men ingen har gett tillfredsställande resultat. Därför utvecklade vi ett kemiskt extraktionsprotokoll för att få ett grovt RNA-extrakt som sedan utsätts för kolonnrening med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit. Med denna metod får vi rutinmässigt och reproducerbart högkvalitativt RNA2 (figur 1), som kan användas för olika nedströmsapplikationer för att generera en transkriptomprofil.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td>Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>To determine quality and quantity of RNA extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crushed ice maker</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>To keep samples on ice during sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar flask</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>Used as liquid nitrogen container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Hybridization Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5242</td>
			<td>Kit components: 
			2X Hi-RPM Hybridization Buffer 
			25X Fragmentation Buffer 
			10X Gene Expression Blocking Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Wash buffer Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5325</td>
			<td>Kit components: 
			Gene Expression Wash Buffer 1 
			Gene Expression Wash Buffer 2 
			Triton X-102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2545A</td>
			<td>Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization gasket slide kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534-60014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQAir air cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9866.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free paper, Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>KC34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Input Quick Amp Labeling Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-2305</td>
			<td>Kit components: 
			T7 Primer 
			5x First Strand Buffer 
			0.1M DTT 
			10 mM dNTP Mix 
			AffinityScript RNAse Block Mix 
			5x Transcription Buffer 
			NTP Mix 
			T7 RNA Polymerase Blend 
			Nuclease-free water 
			Cyanine 3-CTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spatula, small</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes, nuclease-free</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>2.0 mL and 1.5 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td>It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110-230V</td>
			<td>Any small incubator will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and pestle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td>Peqlab / Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>351900302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-Color RNA Spike-In Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5188-5282</td>
			<td>Kit components: 
			One color RNA Spike-Mix 
			Dilution Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ozone barrier slide cover kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2505-60550</td>
			<td>Optional but highly recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube, 0.2 mL, RNase-free</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>Z376426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A156.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, nuclease free, filter tips</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor set</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Extraction Buffer</td>
			<td>10 mM Tri-HCl pH 8.0 
			150 mM LiCl 
			50 mM EDTA 
			1.5% EDTA 
			15 ul/mL &#946;-mercaptoethanol</td>
			<td></td>
			<td>We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add &#946;-mercaptoethanol fresh daily</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Kit components: 
			RNeasy mini spin column (pink) 
			1.5 ml collection tubes 
			2 ml collection tubes 
			Buffer RLT 
			Buffer RW 
			Buffer RPE 
			Nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74904</td>
			<td>Kit components: 
			RNeasy mini spin column (pink) 
			QIAshredder spin column (purple) 
			1.5 ml collection tubes 
			2 ml collection tubes 
			Buffer RLT 
			Buffer RLC 
			Buffer RW1 
			Buffer RPE 
			Nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide holders for DNA microarray scanner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2505-60525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide staining dish with removable rack</td>
			<td>DWK Life Sciences 900200</td>
			<td>Fisher Scientific 08-812</td>
			<td>We recommend DWK Life Sciences Wheaton&#8482; Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultralow temperature freezer</td>
			<td>Various brand</td>
			<td></td>
			<td>Capable of storing sample at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds by a modified method for gene expression profiling

Karakteriseringen av genuttryck är beroende av RNA-kvalitet. Vid groning, utveckling och mogna spannmålsfrön hindras utvinning av högkvalitativt RNA ofta av hög stärkelse- och sockerhalt. Dessa föreningar kan minska både avkastningen och kvaliteten på den extraherade totala RNA. Försämringen av kvantiteten och kvaliteten på det totala RNA-systemet kan därefter ha en betydande inverkan på transkriptomanalyserna nedströms, vilket kanske inte korrekt återspeglar den rumsliga och/eller tidsmässiga variationen i genuttrycksprofilen för de prover som testas. I detta protokoll beskriver vi en optimerad metod för extraktion av totalt RNA med tillräcklig kvantitet och kvalitet som ska användas för hela transkriptomanalys av spannmål. Den beskrivna metoden är lämplig för flera nedströmsapplikationer som används för transkriptomprofilering av utvecklings-, gronings- och mogna spannmålsfrön. Metoden för transkriptom profilering med hjälp av en microarray plattform visas. Denna metod är speciellt utformad för genuttrycksprofilering av spannmål med beskrivna genomsekvenser. Det detaljerade förfarandet från microarray hantering till slutlig kvalitetskontroll beskrivs. Detta inkluderar cDNA-syntes, cRNA-märkning, mikroarrayhybridisering, glidskanning, funktionsextrahering och validering av datakvalitet. De data som genereras av denna metod kan användas för att karakterisera transkriptom av spannmål under grobarhet, i olika stadier av spannmålsutveckling, eller vid olika biotiska eller abiotiska stressförhållanden. De resultat som presenteras här exemplifierar högkvalitativa transkriptomdata som kan tillämpas för bioinformatikanalyser nedströms, såsom bestämning av differentiellt uttryckta gener (DEGs), karakterisering av genregleringsnätverk och genomförande av transkriptomomfattande associationsstudie (TWAS).

Denna metod är optimerad för utvinning av prover av utsäde av spannmål som innehåller betydande mängder förorenande stärkelse eller socker. Den är utformad för att extrahera totalt RNA från 24 fröprover per dag. Det bör utföras kontinuerligt på en dag, men valfria stopp- och pauspunkter identifieras i hela protokollet. Alternativt kan läsaren använda sina föredragna RNA extraktionssatser eller manuell kemisk extraktionsmetod. Men baserat på vår tidigare erfarenhet, kommersiellt tillgängliga växt RNA extraktion kit är inte lämpliga för frön på grund av betydande mängder stärkelse, proteiner, socker och / eller lipid kontaminering. I den beskrivna metoden följs en kemisk extraktion av rå RNA av kolonnrening med hjälp av en kommersiell RNA-extraktionssats. Detta ger vanligtvis RNA med högre kvalitet och avkastning. Figur 1 visar resultatet av en BioAnalyzer-körning för att testa kvaliteten på RNA-extraktion med den metod som beskrivs här. Resultaten presenteras för kornblad (proverna 1 och 2 som representerar prover med låg stärkelsehalt) och kornfrön (proverna 3 och 4 som representerar prover med hög stärkelse). RNA-värdet (RIN) för alla prover är 10.
Figur 1 visar en representativ gel av det renade RNA-extraktet, där kvaliteten testades med hjälp av en Bioanalyzer. Prov 1 och 2 är typiska resultat för prover med låg stärkelsehalt, t.ex. Proverna 3 och 4 är representativa resultat för prover med hög stärkelsehalt, såsom kornfrön, som visar 18S och 28S rRNA. Observera att inget automatiserat RIN-värde kan beräknas för gröna växtvävnader som bladprover, på grund av kloroplast rRNA. Integritet och hög kvalitet kan dock visuellt fastställas genom att avsaknaden av nedbrytningsprodukter, som vanligtvis visas som låg molekylär utstryk. RIN-värdet för prover med högstärkelsefrön, såsom kornfrön, är vanligtvis 10 med hjälp av det protokoll som beskrivs i detta dokument.
Dessutom presenterar vi här också en representativ data av en tid kurs experiment av två elit korn inavlade linjer (Sofiara och Victoriana) som används för analys av maltkvalitet19. Under maltprocessen omvandlas stärkelse till socker. Därför representerar proverna vävnader med varierande proportioner av stärkelse och sockerinnehåll. Eftersom den industriella maltprocessen liknar grobarhetsprocessen analyserades transkriptomerna av två kornlinjer, som skiljer sig åt i sin maltkvalitet. RNA extraherades från groning frön vid 2, 24, 48, 72, 120, 144 och 196 h efter imbibition i biologiska tre exemplar. RNA-beredningen och hybridiseringen till det anpassade kornmikroarraychipet utfördes enligt beskrivningen ovan. Figur 2 anger det normaliserade rutnätet som avlästs från mikroarrayhybridiseringen i rapporten (QC)(bild 3)och histogramområdet för upptäckta signaler. Rutnätet ger exempel på härledda signaler från varje hörn av chipet, inklusive bakgrund och spike-in avläsning punkter som används för kalibrering. Histogrammet indikerar avvikelsen av detekterbara prickar med respektive signalintensiteter. En lyckad hybridisering ger en bred Gaussisk-formad kurva med endast mindre extremvärden som visas i figuren. Misslyckade hybridiseringar kan resultera i en stark förskjutning mot ena sidan ("gröna monster").
Slutligen visas ett representativt resultat av godtagbara värden i kolumn 4 i figur 3. För att ange tillförlitligheten i de utförda experimenten utvärderas resultaten ytterligare med hjälp av GeneSpring-programvaran. De insamlade uppgifterna presenteras som huvudkomponentanalys (PCA). Pca integrerar värdena för utvalda punkter (gener) som vektor. Antalet utvärderade punkter som används kan variera från flera hundra till hela chipet och är beroende av den programvara som används. Varje chip (prov) resulterar i ett värde (vektor) som härrör från de integrerade signalintensiteterna för de analyserade punkterna. Den relativa positionen i diagrammet (PCA) anger därför att proverna är likheten med varandra. Ju närmare proverna är, desto mer lika är de. Tekniska replikat bör ligga närmare varandra än biologiska, och biologiska replikat av ett prov bör samlas närmare varandra än prover från olika tidpunkter, vävnader eller tillstånd.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig1.jpg"> Figur 1: Electrophoresis filkörning sammanfattning erhålls efter kontroll av kvaliteten på RNA med Bioanalyzer. Proverna 1 och 2 är kornbladsvävnad enligt vad som indikeras av ytterligare ribosomala band från kloroplaster. Proverna 3 och 4 är kornfrövävnad med 18S och 28S rRNA-band. En RIN-faktor beräknas inte alltid för gröna vävnader som blad, men enligt gelen är kvaliteten på RNA mycket god. RIN-värdet för proverna 3 och 4 är 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig2.jpg"> Figur 2: QC Rapport från framgångsrika korn microarray hybridisering. A + indikerar detekterade signaler på rutnätet från alla hörn av chipet. Histogrammet visar antalet signaler kategoriseras enligt signalintensitet (fluorescens) som logaritm efter bakgrund subtraktion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig3.jpg"> Figur 3: Sammanfattning av kvalitetskontroll (QC) efter hybridisering och skanning. Värdena för den hybridiserade bilden anges i kolumn 2 (värde) och intervallet med godtagbara värden visas i kolumn 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tvättkammare Montering</td>
			<td>Innehåll och etikett</td>
			<td>Syfte</td>
		</tr>
<tr>
<td>Maträtt 1</td>
			<td>Tom, lämna på labbbänken tills nästa dag</td>
			<td>Fyll med tvättbuffert 1 nästa dag, som används för att demontera mikroarrayrutschbanorna</td>
		</tr>
<tr>
<td>Maträtt 2</td>
			<td>Lägg till en microarray slide rack och en liten magnetisk omrörning bar; etikett med "Tvättbuffert 1", lämna på labbbänken till nästa dag</td>
			<td>Används för att tvätta microarray diabilder med TvättBuffert 1 nästa dag</td>
		</tr>
<tr>
<td>Maträtt 3</td>
			<td>Tillsätt en liten magnetisk omrörstång, etikett med "Wash Buffer 2" och placera i en 37 °C mini inkubator.</td>
			<td>Används för att tvätta mikroarrayrutschbanorna med tvättbuffert 2 nästa dag inuti 37 °C miniinkubatorn</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Beredning av tvättkammarens sammansättningar.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Steg</td>
			<td>Maträtt</td>
			<td>Tvätta buffert</td>
			<td>Temperatur</td>
			<td>Tid</td>
		</tr>
<tr>
<td>Demontering</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">Omgivande</td>
			<td rowspan="2">Så fort som möjligt</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Steg 4.13)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tvätta först</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">Omgivande</td>
			<td rowspan="2">1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Steg 4.14)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Andra tvätt</td>
			<td rowspan="2">3</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">37 °C</td>
			<td rowspan="2">1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Steg 4.15)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Inkubationstemperatur och tid för tvättkammares sammansättningar.

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling at JoVE.com

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

En metod för transkriptom profilering av spannmål presenteras. Den mikroarraybaserade genuttrycksprofileringen börjar med isolering av högkvalitativt totalt RNA från spannmål och fortsätter med genereringen av cDNA. Efter cRNA-märkning och mikroarrayhybridisering ges rekommendationer för signaldetektering och kvalitetskontroll.

Erhålla högkvalitativa transkriptom data från spannmål frön av en modifierad metod för genuttryck profilering

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Denna mikroarray hybridiseringsmetod är användbar för att jämföra ett stort antal prover från en organism med en känd arvsmassa. Jämfört med en hög genomströmning sekvensering tillvägagångssätt, mängden data som genereras av denna metod är mycket lättare att hantera och ytterligare, det kan analyseras på ett mer kostnadseffektivt sätt. Visar förfarandet kommer att Dr.Christiane Seiler en post-doktorand som arbetar i forskargruppen vid Rosis vid IPK i Gatersleben.Innan du utför microarray hybridisering med hjälp av satsen för genuttryck hybridisering, förbereda 10X blockerande agent enligt tillverkarens specifikationer och alikvoter den resulterande blockerande agent i 200 microliter volymer. Sedan, lagra blockerande agent på minus 20 grader Celsius tills användning. På dagen för mikroarray hybridisering, tina en 200 microliter alikvot av 10X blockerande agent på is och förkrigstiden hybridisering ugnen till 65 grader Celsius och en värme block till 60 grader Celsius.Förbered fragmenteringsmixen för varje prov enligt beskrivningen av tillverkaren och blanda proverna försiktigt på en virvel. Efter virvelning, snurra kort ner proverna i en mikrocentrifug innan inkubering i exakt 30 minuter i 60 grader Celsius värmeblock. I slutet av inkubationen, omedelbart kyla varje rör på is i en minut innan du stoppar fragmenteringen med 25 mikroliter av 2X genuttryck hybridisering buffert, höga varv per minut per rör.Blanda med mild pipettering, var mycket noga med att inte införa några bubblor, och centrifug rören i omgivande rumstemperatur. I slutet av spinn omedelbart placera alla rör på is och ladda varje prov i microarray glida så snabbt som möjligt. Därefter långsamt dispensera 44 mikroliter av varje hybridisering mix i mitten av varje packning väl, var noga med att undvika att införa bubblor, och lägga till 44 mikroliter av hybridisering buffert i alla oanvända brunnar.Placera omedelbart mikroarrayen i rätt orientering ovanpå packningssglaset, var noga med att inte spilla någon vätska, och tätt stänga hybridiseringsenheten. Rotera monteringen för att bekräfta bristen på stationära luftbubblor och placera hybridiseringskammarens församling i hybridiseringsugnsrotatorn. Ställ in rotationshastigheten på 10 varv per minut, starta sedan hybridiseringen i 65 grader Celsius i exakt 17 timmar.Medan proverna hybridiserar, förbereda tre tvätt skålen församlingar i lämpliga tvätt buffertar som beskrivs i tabellerna. Efter exakt 17 timmars hybridisering, demontera en hybridisering kammare på ett labb bänk fodrad med ludd fritt papper och överföra en microarray smörgås till en maträtt som innehåller tvätt buffert en med microarray streckkoden vänd uppåt i en lutande position utan att dränka hela bilden i bufferten. Med hjälp av tämjningar, separera de två glasglas och låt packningen glida släppa försiktigt i botten av skålen samtidigt som ett fast grepp om microarray slide.Lyft långsamt mikroarrayen i sidled för omedelbar överföring till mikroarraystället i skålen två med en minimal exponering för luften. När alla åtta diabilder har placerats jämnt längs racket, fäst rackhållaren och överför hela skålen två setup till den magnetiska omröraren. Rör om i uppställningen försiktigt i exakt en minut.Medan proverna rörs, överföring skålen tre från 37 grader Celsius inkubator på en andra magnetisk omrörare. Tillsätt sedan försiktigt 37 grader Celsius tvätt buffert två till skålen tre utan att bilda bubblor. I slutet av omrörningsinkubationen överför du försiktigt och långsamt glidstället till disken tre och tar bort rackhållaren.Efter omrörning i exakt en minut, långsamt och försiktigt bort glidstället från skålen och använd luddfritt papper för att noggrant torka båda sidor av varje objektglas, placera varje bild i en gliddosa som den torkas. Efter att låta objektglasen torka i 15 minuter, överför varje mikroarraysglas till en glidhållare med streckkoden vänd uppåt och laddar de monterade glidhållarna i en skanningskarusell och sekvens enligt streckkodsnumret. Sedan ska du omedelbart skanna bilderna.I denna figur visas ett representativt resultat från en körning för att testa kvaliteten på RNA-extraktion. I typiska analyser av fettsnåla stärkelsehaltsprover, såsom kornblad, är ytterligare ribosom-RNA-band från kloroplaster uppenbara. Hög stärkelsehalt prover, såsom korn frön, uppvisar 18 och 28S ribosomal RNA.Observera att inget automatiserat RNA-integritetstalsvärde kan beräknas för gröna växtvävnader, till exempel bladprover, på grund av kloroplast ribosomalt RNA. I denna representativa analys utfördes en RNA-beredning och hybridisering till ett anpassat korn microarray chip som visats. Rutnätet visar ett exempel på härledda signaler från varje hörn av chipet, inklusive bakgrund och spik i avläsningspunkter som används för kalibrering.Histogrammet anger avvikelsen för detekterbara punkter med respektive signalintensiteter. Som observerats, ger en lyckad hybridisering en bred Gaussian-formad kurva med endast mindre extremvärden. Här visas rapporten om kvalitetskontroll för avkända signaler.Värdena för den hybridiserade diabilden anges i kolumn två och intervallet för godtagbara värden visas i kolumn fyra. Denna metod kan användas för att ta itu med alla försöksuppsättningar för alla organismer där väsentlig information om arvsmassan finns tillgänglig. Med hjälp av denna teknik i vårt labb gjorde det möjligt för oss att jämföra och analysera transkriptomiska förändringar i ris och korn som uppstår efter tillväxt stress induktion.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metod för isolering av högrenat RNA från frön för användning i kvantitativ transkriptom analys

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

En filtreringsbaserad metod för att förbereda högkvalitativ nukleär från tvärbunden skelettmuskel för kromatinimmunutfällning

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Djupa proteomet profilering av isobariska märkning, omfattande vätskekromatografi, masspektrometri och programvara-assisted kvantifiering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Koffein utvinning, enzymaktivitet och genuttryck av koffein syntas från växten cellsuspensioner

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

Biosyntes av en flavonol från en Flavanone genom att etablera en en-Pot Bienzymatisk kaskad

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering och identifiering illustrerad av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA-sekvens erkännande av DNA-Primase med hög genomströmning Primase profilering

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Högupplöst Complexome-profilering genom att Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

Beredning av högkvalitativ fermenterad fisk produkt

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...