Name: obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds by a modified method for gene expression profiling
Uploaded: 2020-05-21T13:00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling at JoVE.com

Bu çalışma CGIAR tematik alanı Global Rice Tarım-Gıda Sistemi CRP, RICE, Afrika ve Güney Asya (STRASA) Faz III için Strese Dayanıklı Pirinç ve IZN (Disiplinlerarası Bitki Araştırma Merkezi, Halle (Saale), Almanya altında desteklenmiştir. Mandy Püffeld'e mükemmel teknik yardımları ve Dr. Isabel Maria Mora-Ramirez'e buğday çipi ile bilgi ve deneyim paylaştığı için teşekkür ederiz. Dr. Rhonda Meyer'e (RG Heterosis, IPK Gatersleben, Almanya) yorumları ve makalelerini eleştirel bir şekilde okumaları için teşekkür ederiz.

<ol>
	<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+intact-tissue+sequencing+of+single-cell+transcriptional+states.">Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li><li>P&#252;ffeld, M., Seiler, C., Kuhlmann, M., Sreenivasulu, N., Butardo, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Developing+Rice+Grain+Transcriptome+Using+the+Agilent+Microarray+Platform.">Analysis of Developing Rice Grain Transcriptome Using the Agilent Microarray Platform.</a> Methods in Molecular Biology. 1892, 277-300 (2019).</li><li>Martin, L., Fei, Z., Giovannoni, J., Rose, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalyzing+plant+science+research+with+RNA-seq.">Catalyzing plant science research with RNA-seq.</a> Frontiers in Plant Science. 4 (66), (2013).</li><li>Hrdlickova, R., Toloue, M., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+methods+for+transcriptome+analysis.">RNA-Seq methods for transcriptome analysis.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).</li><li>Radchuk, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+profiling+of+starch+biosynthesis+and+degradation+in+the+developing+barley+grain.">Spatiotemporal profiling of starch biosynthesis and degradation in the developing barley grain.</a> Plant Physiology. 150 (1), 190-204 (2009).</li><li>Sreenivasulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+of+seeds:+deciphering+the+molecular+mechanisms+of+seed+storage,+dormancy+and+onset+of+germination.">Systems biology of seeds: deciphering the molecular mechanisms of seed storage, dormancy and onset of germination.</a> Plant Cell Reports. 36 (5), 633-635 (2017).</li><li>Sreenivasulu, N., Wobus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed-development+programs:+a+systems+biology-based+comparison+between+dicots+and+monocots.">Seed-development programs: a systems biology-based comparison between dicots and monocots.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 189-217 (2013).</li><li>Butardo, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+Genetics+Identifies+a+Novel+Regulatory+Domain+of+Amylose+Synthesis.">Systems Genetics Identifies a Novel Regulatory Domain of Amylose Synthesis.</a> Plant Physiology. 173 (1), 887-906 (2017).</li><li>de Guzman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+glycemic+potential+of+rice+by+unraveling+compositional+variations+in+mature+grain+and+starch+mobilization+patterns+during+seed+germination.">Investigating glycemic potential of rice by unraveling compositional variations in mature grain and starch mobilization patterns during seed germination.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5854 (2017).</li><li>Sreenivasulu, N., Sunkar, R., Wobus, U., Strickert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+platforms+and+bioinformatics+tools+for+the+analysis+of+plant+transcriptome+in+response+to+abiotic+stress.">Array platforms and bioinformatics tools for the analysis of plant transcriptome in response to abiotic stress.</a> Methods in Molecular Biology. 639, 71-93 (2010).</li><li>Anacleto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+a+genome-wide+association+study+with+a+large-scale+transcriptome+analysis+to+predict+genetic+regions+influencing+the+glycaemic+index+and+texture+in+rice.">Integrating a genome-wide association study with a large-scale transcriptome analysis to predict genetic regions influencing the glycaemic index and texture in rice.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2018).</li><li>Pietsch, C., Sreenivasulu, N., Wobus, U., Roder, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+mapping+of+putative+regulator+genes+of+barley+grain+development+characterized+by+expression+profiling.">Linkage mapping of putative regulator genes of barley grain development characterized by expression profiling.</a> BMC Plant Biology. 9, 4 (2009).</li><li>Druka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+gene+expression+from+seed+to+seed+through+barley+development.">An atlas of gene expression from seed to seed through barley development.</a> Functional &amp; Integrative Genomics. 6 (3), 202-211 (2006).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+Expression+Atlas+In+Reproductive+Development.">Rice Expression Atlas In Reproductive Development.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (12), 2060-2081 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+gene+expression+atlas+covering+the+entire+life+cycle+of+rice.">A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice.</a> The Plant Journal. 61 (5), 752-766 (2010).</li><li>Yamakawa, H., Hakata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+rice+grain+filling-related+metabolism+under+high+temperature:+Joint+analysis+of+metabolome+and+transcriptome+demonstrated+inhibition+of+starch+accumulation+and+induction+of+amino+acid+accumulation.">Atlas of rice grain filling-related metabolism under high temperature: Joint analysis of metabolome and transcriptome demonstrated inhibition of starch accumulation and induction of amino acid accumulation.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (5), 795-809 (2010).</li><li>Shakoor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sorghum+bicolor+expression+atlas+reveals+dynamic+genotype-specific+expression+profiles+for+vegetative+tissues+of+grain,+sweet+and+bioenergy+sorghums.">A Sorghum bicolor expression atlas reveals dynamic genotype-specific expression profiles for vegetative tissues of grain, sweet and bioenergy sorghums.</a> BMC Plant Biology. 14, 35 (2014).</li><li>Yu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+reveals+key+differentially+expressed+genes+involved+in+wheat+grain+development.">Transcriptome analysis reveals key differentially expressed genes involved in wheat grain development.</a> Crop Journal. 4 (2), 92-106 (2016).</li><li>Kochevenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+QTL+hot+spots+for+malting+quality+in+two+elite+breeding+lines+with+distinct+tolerance+to+abiotic+stress.">Identification of QTL hot spots for malting quality in two elite breeding lines with distinct tolerance to abiotic stress.</a> BMC Plant Biology. 18 (1), 106 (2018).</li></ol>

Yazarların rakip finansal çıkarları yok.

Açıklanan yöntem, yüksek verimli ve yüksek kaliteli RNA ekstreleri için yüksek oranda tekrarlanabilir sonuçlar sağlar(Şekil 1). Deneyimlerimize dayanarak, analiz için bir genotip, aşama veya koşul için üç biyolojik kopya öneririz. İstatistiksel olarak anlamlı farklılıkları tespit edebilmek için mRNA'nın genel bolluğu göz önünde bulundurulmalıdır. Ancak, RNA ekstraksiyon uyrama adımı için triplicates'te başlangıç miktarı nın 200 mg doku numunesi gerektiğini lütfen unutmayın. Bu nedenle, genetiği değiştirilmiş bitki malzemeleri gibi numunelerin sınırlı miktarda olan deneyler için, bu yöntem uygun olmayabilir.
Mikrodizi hibridizasyonu sırasında, aşağıdaki adımlar en kritiktir: (1) örnekleri conta slaytına yükleme (Adım 4.7) ve (2) melezleme den sonra dizileri yıkama (Adımlar 4.13 ve 4.14). Kabarcık oluşumunu ve sıvı dökülmesini önlemek için numune yüklemesi çok dikkatli yapılmalıdır. Yüklü örnekleri içeren conta kaydırak üzerinde mikrodizi slayt koyarken dikkat gereklidir: DNA tarafı (benekli problar ile) hibridizasyon sağlamak için aşağı bakacak şekilde olmalıdır. Mikrodizilerin yıkanması için ikinci yıkama adımı özellikle önemlidir: Burada, slaytlarda veri toplama ve analizleri engelleyebilecek arabellek kalıntılarını önlemek için yıkama arabelleği 2'den slaytların çıkarılması çok yavaş (10 s) yapılmalıdır.
Aşağı akım biyoinformatik analizi için uygun olan hibridizasyon deneyinden sonuç almak için birkaç önemli kriterden yararlanılması gerekir. Yukarıdaki protokolün performansından sonra oluşturulan QC raporu, neyin iyileştirilmesi gerektiği ve hangi verilerin kullanılabilir durumda olduğu hakkında iyi bir fikir verir(Şekil 3). Alınan ilk bilgi görselleştirilmiş ızgaradır (Şekil 2). Burada, floresan okuma için tüm alanların düzgün bir şekilde hizalanmış olup olmadığını doğrudan görebilirsiniz. Görsel olarak algılanabilir bir kayma varsa, bu diğer tüm değerleri (Arka plan, sinyal yoğunluğu, vb)'i etkiler ve bu çipin okunması kullanılamaz. Genel bakışta (tüm Outliers'ın Mekansal Dağılımı), sonucu etkileyen herhangi bir kontaminasyonu (örneğin, toz veya saç) kolayca tespit edebilir. Kir, talaş hafifçe üfleyerek ve yeniden tarayarak çıkarılabilir. Yukarıda belirtildiği gibi sinyal çizimhistogramı geniş bir Gauss şeklinde eğri, sadece küçük aykırı(Şekil 2)ile neden olmalıdır. Analiz edilen dokuya bağlı olarak(Şekil 1),bu eğri farklı görünebilir ve iki tepe noktası veya omuzlu bir baskın tepeye sahip gibi görünebilir. Bu, verilerin kalitesini etkilemez. Yalnızca güçlü bir kaydırılmış tepe noktası veya kenarlarda yüksek sinyaller, yıkanarak çıkarılamayacak ve talaş üreticisine bildirilmesi gereken "yeşil canavarlar" (çok yüksek floresan yoğunlukları) gibi sorunları gösterir. Ayrıca, "Medyan Sinyaller için Uzamsal Dağılım grafiği" ortak bir değer etrafında değişiklik göstermelidir. Bu, analiz edilen çipin genel yoğunluğuna bağlı olarak 40 ile 100 arasında olmalıdır. Bir diğer önemli kalite kontrolü de verideki ani artışın değerlendirilmesidir: Sinyallerdeki ani artış için günlük grafiği doğrusal ve düzenli bir çizgiyle sonuçlanmalıdır. Son olarak, "değerlendirme ölçümleri" tablosu alınan sonuçların iyi ve güvenilir bir görünümünü verir. Burada üretici Mükemmel, İyi ve Değerlendir (Şekil 3)olarak sınıflandırılabilir değerleri bir dizi sağlar. Deneyimlerimize göre, bazı değerler her zaman tüm fişler için uygulanamaz. Pirinç özel yongaları için , "nonControl değeri" sık sık kapsama alanı dışında ydı, ancak daha fazla veri işlemeyi önemli ölçüde etkilemez. Buna ek olarak, "NegControl" için aralık, doku, organizma ve Chip genel çıkış dayalı uzatılabilir <80. Deneyimlerimize göre E1 med CV değeri için değerlendirme aralığı <8 yerine <9'a kadar uzatılabilir. Bunu takiben, tüm çip okuma verilerinin doğru bir şekilde değerlendirilmesi mümkündür. Genel olarak, bağımsız biyolojik kopyaların her zaman en güvenilir sonucu verdiğini her zaman akılda tutmak gerekir.
Bu tekniğin diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında avantajı transkripsiyonel profilleme için uygun maliyetli, yüksek iş yapma yöntemini temsil etmesidir. Ayrıca, downstream veri analizi boru hattı daha kolay ve daha köklü. Avantajlarına rağmen, bu tekniğin analiz edilebilen gen sayısı gibi bazı sınırlamaları vardır. Mikrodizi sadece dizi üzerinde daha önce benekli probların analizini kolaylaştırabilir. Bu nedenle, bu teknik sadece dizili genomları ve tamamen açıklamalı genleri olan bitki türleri için geçerlidir. Mikrodizi tabanlı transkripsiyonların sadece gen ekspresyonu profilleme için değil, aynı zamanda gen düzenleyici ağ analizleri ve transkripsiyon-geniş ilişkilendirme çalışması gibi diğer downstream biyoinformatik boru hatları için de çok yararlı ve alakalı olmaya devam edeceğini öngörüyoruz.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/60602/obtaining-high-quality-transcriptome-data-from-cereal-seeds-modified">Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling</a>. Two&#160;author&#160;names were&#160;updated.
The&#160;names were&#160;corrected from:
Christianne&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreeenivasulu
to:
Christiane&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreenivasulu

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/60602/obtaining-high-quality-transcriptome-data-from-cereal-seeds-modified">Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling</a>. Two&#160;author&#160;names were&#160;updated.

Erratum: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Transkripsiyon, belirli bir zamanda bir organizmanın genomu tarafından ifade edilen ribonükleik asit (RNA) transkriptlerinin tam kümesini ve özellikle çevresel ve büyüme koşullarını temsil eder. Her hücrenin mevcut fizyolojik ve metabolik durumunu yansıtan bireysel transkripsiyonu vardır. Benzer bir doku veya organdan elde edilen hücrelerin bir koleksiyon tipik bir transkripsiyon çalışmada kullanılır, ancak tek hücreli ve mekansal olarak çözülmüş transkripsiyonpopüler 1 alıyorsanız. Transkripsiyonomik analizler, seçilen dokudan belirli bir zaman noktasında ve tanımlanmış büyüme koşullarında toplam RNA'nın çıkarılmasıyla başlar. Bu amaçla, nişasta veya şeker içeriği yüksek numunelerden toplam RNA çıkarılması için yeni geliştirilen bir yöntemin kullanılmasını öneriyoruz, tahıl tohumu gibi2. Transkripsiyonların farklı örnekler arasında karşılaştırılması, RNA moleküllerinin farklı bollukta tanımlanmasıyla sonuçlanır. Bu RNA molekülleri farklı ifade edilmiş genler (DEGs) olarak kabul edilir. Belirli marker genlerinden elde edilen transkriptlerin bolluğu, gelişimsel durumu tahmin etmek veya organizmanın çevresel dalgalanmalara tepkisini belirlemek için kullanılabilir. Çalışma altındaki gelişimsel zaman noktaları arasında transkript bolluğunda saptanabilir bir değişiklik olmayan genler genellikle referans veya temizlik genleri olarak kullanılır.
RNA tipik olarak Kuzey lekeleme ve kantitatif ters transkripsiyonaz polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) gibi çeşitli yöntemlerle tespit edilir ve ölçülür, ancak mevcut yüksek iş lenme li transkripsiyon yöntemleri mikrodizi teknolojisini ve RNA dizilemesi (RNA-Seq) kullanılarak nükleik asit hibridizasyonuna dayanır. RNA-Seq şu anda çok popüler çünkü başka bir yerde gözden olarak yüksek iş artışı transkripsiyontranskinomik uygulamalar için çeşitli avantajlar sağlar3,4. Eski bir teknoloji olmasına rağmen, mikrodizi yongaları kullanarak gen ekspresyonu profilleme biyoinformatik bir arka plan daha az gerektiren daha köklü bir teknoloji olduğu için hala yaygın olarak kullanılmaktadır. RNA-Seq ile karşılaştırıldığında, mikrodizi deneylerinden oluşturulan veri kümeleri daha küçüktür ve analiz etmesi daha kolaydır. Buna ek olarak, özellikle büyük örnek numaraları ile ilgili daha uygun maliyetlidir. Laboratuvarımızda, tahıl tanelerinin 5,6,7,8,9'unbüyümesi, gelişmesi ve metabolizmasında yer alan moleküler ağları ve yolları yöneten merkezi düzenleyici merkezlerin rolünü belirlemek için mikrodizi teknolojisini kullanarak düzenli olarak transkriptomik analizler kullanıyoruz.5 Biz de rutin abiyotik streslere tahıl ların yanıtı mekanistik bir anlayış elde etmek için genom çapında gen ekspresyonu profilleme çalışmaları yapmak için kullanabilirsiniz10, yanı sıra transkripsiyon geniş dernek (TWAS) ve bağlantı haritalama çalışmaları tahıl kalitesi ve beslenme sorumlu genleri belirlemek için evretahıl kalitesi ve beslenme11,12. Diğer gruplar da arpa13geliştirme özgü gen ekspresyonu atlası sağlayan mikrodizi teknolojisini kullandık , pirinç14,15,16, sorgum17, ve buğday18.
Bu yayının amacı, agilent mikrodizi platformu kullanarak tahıl tanelerinin transkripsiyonprofili için laboratuarımızda kullandığımız yöntemin kısa bir metinsel özetini ve ayrıntılı bir görsel açıklamasını sağlamaktır. Diğer mikrodizi platformlarının mevcut olduğunu, ancak bu yöntemde yer almadığını lütfen unutmayın. Biz gelişmekte olan veya tahıl tohumları çimlenme RNA ekstraksiyon ayrıntılı bir açıklama sunarak protokol başlar. Deneyimlerimize dayanarak, yüksek kaliteli ve yüksek miktarda transkripsiyon elde etmek transkripsiyon analizleri için uygun olan tahıl tohumu dokuları kullanırken genellikle darboğazdır. Biz birkaç ticari RNA çıkarma kitleri denedim, ama hiçbiri tatmin edici sonuçlar sağlamıştır. Bu nedenle, daha sonra ticari olarak kullanılabilir bir kit kullanılarak sütun saflaştırmatabi tabi bir ham RNA ekstresi elde etmek için bir kimyasal ekstraksiyon protokolü geliştirdi. Bu yöntemi kullanarak, transkripsiyon profili oluşturmak için farklı downstream uygulamaları için kullanılabilen yüksek kaliteli RNA2 (Şekil 1)rutin ve tekrarlayıcı bir şekilde elde ediyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td>Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>To determine quality and quantity of RNA extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crushed ice maker</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>To keep samples on ice during sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar flask</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>Used as liquid nitrogen container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Hybridization Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5242</td>
			<td>Kit components: 
			2X Hi-RPM Hybridization Buffer 
			25X Fragmentation Buffer 
			10X Gene Expression Blocking Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Wash buffer Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5325</td>
			<td>Kit components: 
			Gene Expression Wash Buffer 1 
			Gene Expression Wash Buffer 2 
			Triton X-102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2545A</td>
			<td>Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization gasket slide kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534-60014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQAir air cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9866.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free paper, Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>KC34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Input Quick Amp Labeling Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-2305</td>
			<td>Kit components: 
			T7 Primer 
			5x First Strand Buffer 
			0.1M DTT 
			10 mM dNTP Mix 
			AffinityScript RNAse Block Mix 
			5x Transcription Buffer 
			NTP Mix 
			T7 RNA Polymerase Blend 
			Nuclease-free water 
			Cyanine 3-CTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spatula, small</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes, nuclease-free</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>2.0 mL and 1.5 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td>It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5110-230V</td>
			<td>Any small incubator will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and pestle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td>Peqlab / Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>351900302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-Color RNA Spike-In Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5188-5282</td>
			<td>Kit components: 
			One color RNA Spike-Mix 
			Dilution Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ozone barrier slide cover kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2505-60550</td>
			<td>Optional but highly recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube, 0.2 mL, RNase-free</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>Z376426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A156.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, nuclease free, filter tips</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor set</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Extraction Buffer</td>
			<td>10 mM Tri-HCl pH 8.0 
			150 mM LiCl 
			50 mM EDTA 
			1.5% EDTA 
			15 ul/mL &#946;-mercaptoethanol</td>
			<td></td>
			<td>We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add &#946;-mercaptoethanol fresh daily</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Kit components: 
			RNeasy mini spin column (pink) 
			1.5 ml collection tubes 
			2 ml collection tubes 
			Buffer RLT 
			Buffer RW 
			Buffer RPE 
			Nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74904</td>
			<td>Kit components: 
			RNeasy mini spin column (pink) 
			QIAshredder spin column (purple) 
			1.5 ml collection tubes 
			2 ml collection tubes 
			Buffer RLT 
			Buffer RLC 
			Buffer RW1 
			Buffer RPE 
			Nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide holders for DNA microarray scanner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2505-60525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide staining dish with removable rack</td>
			<td>DWK Life Sciences 900200</td>
			<td>Fisher Scientific 08-812</td>
			<td>We recommend DWK Life Sciences Wheaton&#8482; Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultralow temperature freezer</td>
			<td>Various brand</td>
			<td></td>
			<td>Capable of storing sample at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Various brands</td>
			<td></td>
			<td>At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds by a modified method for gene expression profiling

Gen ekspresyonunun karakterizasyonu RNA kalitesine bağlıdır. Çimlenme, gelişen ve olgun tahıl tohumları, yüksek kaliteli RNA çıkarma genellikle yüksek nişasta ve şeker içeriği tarafından engellenir. Bu bileşikler hem verimi hem de çıkarılan toplam RNA kalitesini azaltabilir. Toplam RNA'nın miktarı ve kalitesindeki bozulma, test edilen örneklerin gen ekspresyonu profilindeki mekansal ve/veya zamansal değişimi doğru şekilde yansıtmayabilecek alt akım transkripsiyon analizleri üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Bu protokolde, tahıl tanelerinin tam transkripsiyon analizi için kullanılacak yeterli miktar ve kalitede toplam RNA çıkarılması için optimize edilmiş bir yöntem tanımlıyoruz. Açıklanan yöntem, gelişmekte olan, çimlenme ve olgun tahıl tohumlarının transkripsiyonik profilleme için kullanılan çeşitli downstream uygulamaları için uygundur. Bir mikrodizi platformu kullanarak transkripsiyon profilleme yöntemi gösterilmiştir. Bu yöntem özellikle tanımlanmış genom dizileri ile tahılların gen ekspresyonu profilleme için tasarlanmıştır. Mikrodizi işlemeden nihai kalite kontrolüne kadar ayrıntılı prosedür açıklanmıştır. Buna cDNA sentezi, cRNA etiketleme, mikrodizi hibridizasyonu, slayt taraması, özellik çıkarma ve veri kalitesi doğrulaması dahildir. Bu yöntemle elde edilen veriler, hububat ların çimlenme sırasında, tahıl gelişiminin çeşitli aşamalarında veya farklı biyotik veya abiyotik stres koşullarında transkripsiyonuna karakterize etmek için kullanılabilir. Burada sunulan sonuçlar, farklı ifade edilmiş genlerin (DEGs) belirlenmesi, gen düzenleyici ağların karakterizasyonu ve transkripsiyon çapında ilişki çalışması (TWAS) yapılması gibi düşük biyoinformatik analizleri için yüksek kaliteli transkripsiyon verilerini örneklemektedir.

Bu yöntem, önemli miktarda kirletici nişasta veya şeker içeren tahıl tohumu numunelerinin ayıklanması için optimize edilebiyi zedelemedir. Günde 24 tohum örneğinden toplam RNA ayıklamak için tasarlanmıştır. Bir gün içinde sürekli olarak yapılmalıdır, ancak protokol boyunca isteğe bağlı durdurma ve duraklatma noktaları tanımlanır. Alternatif olarak, okuyucu tercih ettikleri RNA ekstraksiyon kitleri veya manuel kimyasal ekstraksiyon yöntemi kullanabilirsiniz. Ancak, önceki deneyimlerimize dayanarak, önemli miktarda nişasta, protein, şeker ve/veya lipid kontaminasyonu nedeniyle, ticari olarak mevcut bitki RNA ekstraksiyon kitleri tohumlar için uygun değildir. Açıklanan yöntemde, ham RNA'nın kimyasal olarak çıkarılmasını, ticari bir RNA ekstraksiyon kiti kullanılarak kolon saflaştırması takip edilir. Bu genellikle RNA'ya daha yüksek kalite ve verim sağlar. Şekil 1 burada açıklanan yöntemi kullanarak RNA çıkarma kalitesini test etmek için bir BioAnalyzer çalışmasının sonucunu gösterir. Sonuçlar arpa yaprağı (Düşük nişasta içeriği örneklerini temsil eden örnekler 1 ve 2) ve arpa tohumu (Yüksek nişasta içeriği örneklerini temsil eden örnek 3 ve 4' tür) için sunulmaktadır. Tüm numuneler için RNA bütünlüğü (RIN) değeri 10'dur.
Şekil 1 saflaştırılmış RNA ekstresinin temsili bir jelini gösterir, burada kalite bir Biyoanalizör kullanılarak test edilmiştir. 1 ve 2'deki örnekler, kloroplastlardan gelen ek rRNA bantlarının belirgin olduğu arpa yaprakları gibi düşük nişasta içeriği örnekleri için tipik sonuçlardır. 3 ve 4'lük örnekler, arpa tohumu gibi yüksek nişasta içeriği örneklerinin 18S ve 28S rRNA'yı göstermesiiçin temsili sonuçlardır. Kloroplast rRNA nedeniyle yaprak numuneleri gibi yeşil bitki dokuları için otomatik RIN değeri hesaplanamaz. Ancak, bütünlük ve yüksek kalite görsel olarak genellikle düşük moleküler yayma olarak görünen herhangi bir bozulma ürünleri, yokluğu ile tespit edilebilir. Arpa tohumu gibi yüksek nişastalı tohum numuneleri için RIN değeri genellikle bu kağıtta açıklanan protokol kullanılarak 10'dur.
Buna ek olarak, biz de burada maltlama kalitesi19analizi için kullanılan iki elit arpa inbred hatları (Sofiara ve Victoriana) bir zaman ders deney temsili bir veri salıyoruz. Maltlama işlemi sırasında nişasta şekere dönüştürülür. Bu nedenle, örnekler nişasta ve şeker içeriği değişen oranlarda dokuları temsil eder. Endüstriyel maltlama işlemi çimlenme işlemine benzebildiği için maltlama kalitesinde farklı olan iki arpa hattının transkripsiyonu analiz edildi. RNA'lar biyolojik trilikitlerde imbibition sonra 2, 24, 48, 72, 120, 144 ve 196 h çimlenme tohumları elde edildi. RNA hazırlık ve özelleştirilmiş arpa mikrodizi çip hibridizasyon yukarıda açıklandığı gibi yapılmıştır. Şekil 2, kalite kontrol (QC) raporunda verilen mikrodizi hibridizasyonundan(Şekil 3)ve tespit edilen sinyaller için histogram çiziminden okunan normalleştirilmiş ızgarayı gösterir. Izgara, arka plan ve kalibrasyon için kullanılan çivili okuma noktalarını da içeren çipin her köşesinden türetilmiş sinyaller örneğini verir. Histogram, ilgili sinyal yoğunluklarına sahip saptanabilir noktasapasyonunu gösterir. Başarılı bir melezleştirme, şekilde gösterildiği gibi yalnızca küçük aykırılıklarla geniş bir Gaussian şeklinde eğri sağlar. Başarısız melezleştirmeler bir tarafa doğru güçlü bir kaymaya neden olabilir ("yeşil canavarlar").
Son olarak, kabul edilebilir değerlerin temsili bir sonucu Şekil 3'ün4. Gerçekleştirilen deneylerin güvenilirliğini belirtmek için sonuçlar GeneSpring yazılımı kullanılarak daha da değerlendirilir. Toplanan veriler temel bileşen analizi (PCA) olarak sunulur. PCA, seçilen noktaların (genlerin) değerlerini vektör olarak bütünleştirir. Kullanılan değerlendirilen nokta sayısı birkaç yüz yonganın tamamına kadar değişebilir ve kullanılan yazılıma bağlıdır. Her yonga (örnek) analiz edilen noktalar için entegre sinyal yoğunluklarından kaynaklanan bir değer (vektör) ile sonuçlanır. Bu nedenle, grafikteki (PCA) göreli konum, örneklerin birbirine benzerliğini gösterir. Örnekler ne kadar yakınsa, o kadar benzerolurlar. Teknik çoğaltmalar biyolojik olanlardan daha yakın olmalı ve bir numunenin biyolojik kopyaları farklı zaman noktalarından, dokulardan veya koşullardan alınan örneklerden daha yakın bir şekilde kümelenmelidir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig1.jpg"> Şekil 1: Bioanalyzer ile RNA kalitesini kontrol ettikten sonra elde edilen elektroforez dosya çalışma özeti. Örnekler 1 ve 2 kloroplastlardan ek ribozomal bantlar ile belirtildiği gibi arpa yaprağı dokusu vardır. 3 ve 4 numaralı örnekler 18S ve 28S rRNA bantlı arpa tohumu dokusuolarak gösterilmiştir. Bir RIN faktörü her zaman yaprak gibi yeşil dokular için hesaplanmaz ama jel göre, RNA kalitesi çok iyidir. 3 ve 4 örnekleri için RIN değeri 10'dur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig2.jpg"> Şekil 2: Başarılı arpa mikrodizi hibridizasyonu NDAN QC Raporu. A + çipin her köşesinden ızgaraüzerinde algılanan sinyalleri gösterir. Histogram, arka plan çıkarmadan sonra logaritma olarak sinyal yoğunluğuna (floresans) göre sınıflandırılan sinyal sayısını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig3.jpg"> Şekil 3: Hibridizasyon ve tarama dan sonra kalite kontrol (QC) özeti. Melezleştirilmiş slayt için değerler sütun 2 (değer) verilir ve kabul edilebilir değerler aralığı sütun 4 gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Yıkama Odası Montajı</td>
			<td>İçerik ve Etiket</td>
			<td>Amaç</td>
		</tr>
<tr>
<td>Çanak 1</td>
			<td>Boş, ertesi güne kadar laboratuar bankında bırak</td>
			<td>Ertesi gün Mikrodizi slaytlarını sökmek için kullanılan Yıkama Tampon1 ile doldurun</td>
		</tr>
<tr>
<td>Çanak 2</td>
			<td>Bir microarray slayt raf ve küçük bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin; etiket "Wash Tampon 1", ertesi güne kadar laboratuvar bankında bırakın</td>
			<td>Ertesi gün Wash Buffer 1 ile mikrodizi slaytları yıkamak için kullanılır</td>
		</tr>
<tr>
<td>Çanak 3</td>
			<td>Küçük bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin, "Yıkama Tampon 2" ile etiket ve 37 °C mini kuluçka yerleştirin.</td>
			<td>Mikrodizi slaytlarını ertesi gün 37 °C mini inkübatör içinde Yıkama Tamponu 2 ile yıkamak için kullanılır</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Yıkama odası montajlarının hazırlanması.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adım -ları</td>
			<td>Çanak</td>
			<td>Yıkama Tampon</td>
			<td>Sıcaklık</td>
			<td>Zaman</td>
		</tr>
<tr>
<td>Demontaj</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">Ortam</td>
			<td rowspan="2">Mümkün olduğunca hızlı</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Adım 4.13)</td>
		</tr>
<tr>
<td>İlk yıkama</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">Ortam</td>
			<td rowspan="2">1 dk</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Adım 4.14)</td>
		</tr>
<tr>
<td>İkinci yıkama</td>
			<td rowspan="2">3</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">37 °C</td>
			<td rowspan="2">1 dk</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Adım 4.15)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Kuluçka odası montajları için kuluçka sıcaklığı ve zamanı.

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling at JoVE.com

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Tahılların transkripsiyon profilini çıkarmak için bir yöntem sunulmaktadır. Mikrodizi tabanlı gen ekspresyonu profilleme tahıl tanelerinden yüksek kaliteli toplam RNA izolasyon ile başlar ve cDNA üretimi ile devam eder. cRNA etiketleme ve mikrodizi hibridizasyonundan sonra sinyal tespiti ve kalite kontrolü için öneriler verilmiştir.

Gen Ekspresyonu Profilleme için Modifiye Yöntemi ile Tahıl Tohumlarından Yüksek Kaliteli Transkripsiyon Verilerinin Elde Edilmesi

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Bu mikrodizi hibridizasyon yöntemi bilinen bir genom ile bir organizmadan örnekleri çok sayıda karşılaştırmak için yararlıdır. Yüksek iş elde etme sıralaması yaklaşımıyla karşılaştırıldığında, bu yöntemle oluşturulan veri miktarının kullanımı çok daha kolaydır ve daha da zorlaşır, daha uygun maliyetli bir şekilde analiz edilebilir. Prosedürü gösteren Dr.Christiane Seiler Gatersleben IPK de Rosis araştırma grubunda çalışan bir doktora sonrası bilim adamı olacaktır.Gen ekspresyonu hibridizasyon kitini kullanarak mikrodizi hibridizasyonunu gerçekleştirmeden önce, üreticinin özelliklerine göre 10X blokaj maddesi hazırlayın ve 200 mikrolitre hacimde elde edilen engelleme maddesini aliquot layın. Ardından, bloke edici maddeyi kullanıma kadar eksi 20 derecede saklayın. Mikrodizi hibridizasyonunun olduğu gün, buz üzerindeki 10X bloke edici maddenin 200 mikrolitrelik bir kısmını eritin ve melezleme fırınını 65 santigrat dereceye ve Bir ısı bloğunu 60 santigrat dereceye ısıtın.Üretici tarafından açıklandığı gibi her numune için parçalanma karışımını hazırlayın ve numuneleri bir girdap üzerinde hafifçe karıştırın. Girdap sonra, kısaca 60 derece Santigrat ısı bloğunda tam 30 dakika kuluçkadan önce bir mikrocentrifuge örnekleri aşağı spin. Kuluçka sonunda, 2X gen ekspresyonu hibridizasyon tamponu 25 mikrolitre ile parçalanma durdurmadan önce hemen bir dakika buz üzerinde her tüp serin, tüp başına dakika başına yüksek devrimler.Nazik pipetleme ile karıştırın, herhangi bir kabarcıktanıtmak için büyük özen, ve ortam oda sıcaklığında tüpler santrifüj. Spinsonunda hemen buz tüm tüpleri yerleştirin ve mümkün olduğunca çabuk mikrodizi slayt içine her örnek yükleyin. Daha sonra, yavaş yavaş her conta iyi merkezine her hibridizasyon karışımı 44 mikrolitre dağıtmak, kabarcıklar tanıtmak önlemek için özen, ve herhangi bir kullanılmayan kuyulara hibridizasyon tampon 44 mikrolitre ekleyin.Mikrodizi kaydırağini hemen conta kaydırağının üzerine doğru yönde yerleştirin, sıvı dökülmemeye özen söyleyin ve hibridizasyon tertibatını sıkıca kapatın. Sabit hava kabarcıklarının eksikliğini doğrulamak için montajı döndürün ve hibridizasyon odası montajını hibridizasyon fırını rotatoruna yerleştirin. Dönüş hızını dakikada 10 devire ayarlayın, sonra melezlemeye tam 17 saat boyunca 65 derecede nisbeten başlayın.Numuneler melezlenirken, tablolarda belirtildiği gibi uygun yıkama arabelleklerinde üç yıkama kabı nı hazırlayın. Tam 17 saatlik hibridizasyondan sonra, tüy bırakmayan kağıtla kaplı bir laboratuvar tezgahındaki bir melezleme odasını sökün ve bir mikrodizi sandviçini, tampondaki tüm kaydırağı batırmadan eğimli bir pozisyonda bakan mikrodizi barkodu yla yıkama tamponu içeren bir tabağa aktarın. Forceps kullanarak, iki cam slayt ayırın ve conta yavaşça mikrodizi slayt üzerinde sıkı bir kavrama tutarken yemeğin altına damla izin.Yavaşça havaya en az maruz kalma ile çanak iki mikrodizi raf içine hemen transferi için mikrodizi slayt yana kaldırın. Sekiz kaydırağınızda raf boyunca eşit olarak yerleştirildiğinde, raf tutucusunu takın ve tüm çanak iki kurulumu manyetik karıştırıcıya aktarın. Kurulumu tam olarak bir dakika boyunca hafifçe karıştırın.Örnekler karıştırılırken, 37 santigrat derecekasyondan üçüncü tabağı ikinci bir manyetik karıştırıcıya aktarın. Sonra yavaşça kabarcıklar oluşturmadan üç çanak 37 derece santigrat yıkama tampon iki ekleyin. Karıştırma kuluçka sonunda, yavaşça ve yavaşça çanak üç slayt raf aktarın ve raf tutucu kaldırın.Tam bir dakika karıştırdıktan sonra, yavaşça ve yavaşça çanak slayt rafkaldırmak ve dikkatle her slayt her iki tarafı kuru, kurutulur gibi bir slayt kutusuna yerleştirerek tiftik serbest kağıt kullanın. Slaytların 15 dakika kurumasını sağladıktan sonra, her mikrodizi slaytını barkod yukarı bakacak şekilde bir slayt tutucuya aktarın ve monte edilmiş slayt tutucuları barkod numarasına göre taramalı bir atlıkarıncaya ve sıraya yükleyin. Ardından, slaytları hemen tarayın.Bu şekilde, RNA çıkarma kalitesini test etmek için bir çalışma dan temsili bir sonuç gösterilir. Arpa yaprakları gibi düşük nişasta içeriği örneklerinin tipik analizlerinde kloroplastlardan gelen ek ribozomal RNA bantları belirgindir. Arpa tohumu gibi yüksek nişasta içeriği örnekleri, sergi 18 ve 28S ribozomal RNA.Kloroplast ribozomal RNA nedeniyle yaprak numuneleri gibi yeşil bitki dokuları için otomatik RNA bütünlüğü sayı değerinin hesaplanamayabileceğini unutmayın. Bu temsili analizde, özelleştirilmiş arpa mikrodizi çipine RNA hazırlama ve hibridizasyon gösterilmiştir. Izgara, yonganın her köşesinden elde edilen sinyallerin bir örneğini gösterir, buna arka plan ve kalibrasyon için kullanılan okuma noktalarında ani artış da dahildir.Histogram, ilgili sinyal yoğunluklarına sahip saptanabilir noktasapasyonunu gösterir. Görüldüğü gibi, başarılı bir hibridizasyon sadece küçük aykırı geniş bir Gauss şeklinde eğri verir. Burada gösterilen tespit sinyalleri için kalite kontrol raporudur.Melezleştirilmiş slayt için değerler sütun iki verilir ve kabul edilebilir değerler aralığı sütun dört gösterilir. Bu yöntem, genom hakkında önemli bilgilerin mevcut olduğu herhangi bir organizma için kurulmuş herhangi bir deneysel kurulumu ele almak için kullanılabilir. Laboratuvarımızda bu tekniğin kullanılması, büyüme stresinin indüksiyonu sonrasında pirinç ve arpadaki transkripsiyondeğişiklikleri karşılaştırmamızı ve analiz etmemizi sağladı.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA&#39;nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Kromatin İmmunopresipitasyon için Çapraz Bağlı İskelet Kasında Yüksek Kaliteli Nükleerlerin Hazırlanması İçin Filtrasyona Dayalı Bir Yöntem

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Kafein ayıklama, enzimatik aktivite ve kafein Synthase bitki hücre kullanılamaz hale gelen gen ifadesi

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

Bir Flavanone bir Flavonol Biyosentezi Bir-pot Bienzymatik Cascade Kurarak

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Dna İlkase tarafından DNA Dizisi Tanıma Yüksek-Throughput Primase Profilleme kullanarak

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

BN-MS Analizi Cryoslicing tarafından Yüksek Çözünürlüklü Complexome Profilleme

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

Yüksek Kaliteli Fermente Balık Ürününün Hazırlanması

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...