Name: monitoring pd-1-blocking antibodies bound to t cells derived from a drop of peripheral blood
Uploaded: 2020-02-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd til S.K. fra Japan Society for The Promotion of Science KAKENHI (JP17K16045) og Japan Agency for Medical Research and Development (JP18cm0106335 og 19cm0106310).

Prøvetaking ble utført under rutinemessige kliniske prosedyrer. Alle menneskelige prøver ble innhentet etter informert samtykke ble gitt av fagene, i samsvar med Helsingfors erklæringen og med godkjenning av etisk gjennomgang styret av Graduate School of Medicine, Osaka University, Japan (15383 og 752).
1. Hele blodprøveforberedelser og farging
<ol><li>Samle fullblodprøver i blodinnsamlingsrør som inneholder etylendiamin tetra-eddiksyre (EDTA). MERK: Blodoppsamling kan utføres ved...

<ol>
	<li>Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+PD-1+and+PD-L1+inhibitors+as+a+form+of+cancer+immunotherapy:+a+comprehensive+review+of+registration+trials+and+future+considerations.">Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8 (2018).</li><li>Borghaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Nonsquamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).</li><li>Brahmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Squamous-Cell+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).</li><li>Herbst, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+versus+docetaxel+for+previously+treated,+PD-L1-positive,+advanced+non-small-cell+lung+cancer+(KEYNOTE-010):+a+randomised+controlled+trial.">Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial.</a> The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).</li><li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-Related+Adverse+Events+Associated+with+Immune+Checkpoint+Blockade.">Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li><li>Weber, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+Profile+of+Nivolumab+Monotherapy:+A+Pooled+Analysis+of+Patients+With+Advanced+Melanoma.">Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).</li><li>Champiat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+immune+checkpoint+blockade+dysimmune+toxicities:+a+collaborative+position+paper.">Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper.</a> Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).</li><li>Brahmer, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+(MDX-1106)+in+refractory+solid+tumors:+safety,+clinical+activity,+pharmacodynamics,+and+immunologic+correlates.">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).</li><li>Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-parametric+flow+cytometry+staining+procedure+for+analyzing+tumor-infiltrating+immune+cells+following+oncolytic+herpes+simplex+virus+immunotherapy+in+intracranial+glioblastoma.">Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma.</a> Journal of Biological Methods. 6 (2), 112 (2019).</li><li>Osa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+monitoring+nivolumab+immunokinetics+in+non-small+cell+lung+cancer+patients.">Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients.</a> JCI Insight. 3 (19), 59125 (2018).</li><li>Zelba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantification+of+T-cells+expressing+PD-1+in+patients+on+anti-PD-1+immunotherapy.">Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).</li><li>Simoni, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bystander+CD8(+)+T+cells+are+abundant+and+phenotypically+distinct+in+human+tumour+infiltrates.">Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates.</a> Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).</li><li>Chiu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+general+method+for+quantifying+IgG-based+therapeutic+monoclonal+antibodies+in+human+plasma+using+protein+G+purification+coupled+with+a+two+internal+standard+calibration+strategy+using+LC-MS/MS.">Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS.</a> Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).</li></ol>

I denne artikkelen rapporterer vi en metode ved hjelp av et strømningscytometer for å oppdage PD-1-blokkerende antistoffer bundet til T-celler avledet fra en dråpe perifert blod, som vi opprinnelig utviklet for nivolumab deteksjon10. Selv om denne teknikken er veldig enkel og enkel å utføre, bør to viktige punkter noteres for å oppnå nøyaktige resultater. Det ene er at for å oppdage PD-1 molekyler, bør et passende antistoff som konkurrerer med nivolumab og pembrolizumab brukes. Dette pr...

PD-1-blokkerende antistoffer har blitt standardvalget for behandling av ulike typer kreft, inkludert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC)1,2,3,4. De viser en bemerkelsesverdig terapeutisk effekt hos en undergruppe av kreftpasienter som ikke har respondert på konvensjonelle cytotoksiske kjemoterapier. Imidlertid kan immunkontrollpunkthemmere (ICIer), som inkluderer PD-1-blokkerende antistoffer, forårsake et unikt og tydelig spekter av bivirkninger, kalt immunrelaterte bivirkninger (irAV-er)5. Selv om irAE kan påvirke nesten alle vev, de er oftest observert i mage-tarmkanalen, endokrine kjertler, hud, og lever, og de kan forårsake kløe,, kvalme, diaré, og skjoldbrusk lidelser6,7. Generelt vises de fleste irAE er innen 1 til 2 måneder etter initiering av ICIer. Men i noen tilfeller kan de oppstå senere enn 1 år etter begynnelsen av behandlingen eller til og med etter behandlingsopphør6,7. De forårsaker også ulike symptomer som kan være vanskelige å diskriminere fra andre patologier. Dermed kan det være utfordrende å umiddelbart diagnostisere irAE og behandle dem riktig. irAE kan påvirke alle vev, og deres utbrudd er sterkt påvirket av sirkulerende immunceller, spesielt T-celler bundet til PD-1-blokkerende antistoffer. Derfor er en enkel og minimal invasiv metode for å overvåke antistoffmålrettede T-celler viktig i kliniske innstillinger.
Her utviklet vi en enkel metode for å vurdere bindingen av PD-1-blokkerende antistoffer mot T-celler ved hjelp av en dråpe perifert fullblod fra kreftpasienter som fikk nivolumab eller pembrolizumab. Ved hjelp av denne tilnærmingen var vi i stand til å overvåke hvert av følgende: 1) varigheten av antistoffbinding til T-celler, 2) belegget til T-celle PD-1 molekyler ved terapeutiske antistoffer, og 3) aktiveringsstatus og immunologiske egenskaper i T-celler. Denne metoden er en endring av en tidligere rapportert teknikk8. Mengden blod som kreves er nesten den samme som det som trengs for en glukosetest, og tilnærmingen krever ikke enukleær celleberikelse eller co-culturing med PD-1-blokkerende antistoffer. Vi bekreftet at denne metoden også kan utføres ved hjelp av frosne prøver, inkludert perifert blod mononukleære celler (PBMCs) og celler fra pleural effusjon, perikardial effusjon, bronkoalveoor lavage væske, og cerebrospinalvæske, noe som tyder på at denne strategien kan være nyttig i sammenheng med en multisenterstudie. Denne metoden kan lette tidlig diagnose av irAE, og også bidra til å bestemme de riktige immunsuppressive behandlingene for å kontrollere symptomene og identifisere de optimale tidene for å initiere påfølgende behandlinger etter PD-1-hemmere.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X RBC Lysis Buffer (Multi-species)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4300-54</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300518</td>
			<td>Clone RPA-T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301048</td>
			<td>Clone RPA-T8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14249-95</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>352058</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLOWJO</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12676029</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab81200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab99825</td>
			<td>Clone HP6025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>558117</td>
			<td>Clone UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)</td>
			<td>BD</td>
			<td>561272</td>
			<td>Clone EH12.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse IgG1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD</td>
			<td>557646</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring pd-1-blocking antibodies bound to t cells derived from a drop of peripheral blood

Immunsjekkpunkthemmere, inkludert PD-1-blokkerende antistoffer, har betydelig forbedret behandlingsutfall i ulike typer kreft. Den farmakologiske effekten av disse immunterapiene er langvarig, og strekker seg selv utover seponeringen av injeksjonene, på grunn av vedvarende blodkonsentrasjoner. Her utviklet vi en enkel flyt cytometri analyse for å evaluere T celle binding status for PD-1-blokkerende antistoffer nivolumab og pembrolizumab. Som en glukosetest krever denne analysen bare en enkelt dråpe perifert blod. Visualisere antistoffbinding på T-celler er mer pålitelig enn å måle antistoffblodkonsentrasjoner. I tillegg kan vi potensielt analysere mange karakteristiske immunrelaterte markører på T-celler bundet til PD-1-blokkerende antistoffer. Dermed er dette en enkel og minimal invasiv strategi for å analysere den farmakologiske effekten av PD-1-blokkerende antistoffer hos kreftpasienter.

Gating strategi og flyt cytometri analyse (Figur 1) kan oppdage PD-1-blokkereantistoff binding til T-celler hentet fra en dråpe NSCLC pasient perifert blod. Før PD-1-blokkerende antistoff administreres, finnes ingen humane IgG4-positive CD8- eller CD4 T-celler, og PD-1-uttrykk kan bekreftes av et PD-1-detekterende antistoff (EH12.1) (figur 2A). Etter administrering av nivolumab eller pembrolizumab kan IgG4 (nivolumab, pembrolizumab) påvises p...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood at JoVE.com

Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood

Vi utviklet en enkel flow cytometri analyse for å evaluere bindingen av PD-1-blokkerende antistoffer mot T-celler, krever bare en dråpe perifert blod fra kreftpasienter.

Overvåking av PD-1-blokkerende antistoffer bundet til T-celler avledet fra en dråpe perifert blod

Immune checkpoint inhibitors, including PD-1&#8211;blocking antibodies, have significantly improved treatment outcomes in various types of cancer. The ...

Fordi denne metoden bestemmer PD-1-blokkerende antistoffbundne celler ved hjelp av perifert blod fra pasienter, kan den spesifikke undergruppen som er ansvarlig for antitumoreffekter og immunrelaterte bivirkninger identifiseres. Denne metoden trenger bare en liten mengde blodprøve, og analyseprosessen er ganske enkel og rask. Den trenger bare en strømningscytometrimaskin.For å begynne, samle fullblodsprøver i blodinnsamlingsrør som inneholder EDTA. Behandle hver fem milliliter runde bunn polystyren strømning cytometri rør med en milliliter av 2% fosterbovin serum i PBS. Vortex i 10 sekunder.Deretter overfører du 20 mikroliter med fullblodsprøver til de behandlede fem milliliter runde bunnrørene. Tilsett 20 mikroliter på 2 % FBS i PBS og 10 mikroliter med menneskespesifikke FC-reseptorblokkeringsreagens. Bland godt og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur.Deretter legger du til 500 mikroliter med røde blodlegemerlysbuffer. Bland godt og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur. Tilsett fire milliliter på 2% FBS i PBS og spinn ned celler på 400 ganger g i fem minutter ved fire grader Celsius.Fjern det overnaturlige ved aspirasjon. Gjenta vaske- og aspirasjonsprosessen. Resuspend cellene i 100 mikroliter på 2% FBS i PBS og dele inn i to rør på 50 mikroliter hver.Tilsett overflatemarkørantistoffer. Bland godt og inkuber i 20 minutter ved romtemperatur i mørket. Vask prøver to ganger i 2% FBS i PBS som tidligere.Resuspend cellene i 200 mikroliter på 2% FBS i PBS. Sett rørene inn i strømningscytometeret og hent celler etter den anbefalte protokollen. Registrer 10 000 hendelser som lymfocytt gate og eksport flyt data som FCS filer for analyse.Åpne filer i analyseprogramvaren og klikk på filen av isotypekontroll for å visualisere cellene på en fremoverspød mot side scatter plot og gate lymfocytter. Velg enkeltceller ved hjelp av FSCH versus FSCW og SSCH versus SSCW, og vis dem på en CD3 versus CD8 eller CD3 versus CD4-plott. Gate CD8 T-celler og CD4 T-celler henholdsvis.Velg de inngjerdede cellene og vis dem på en PD-1 versus menneskelig IgG4-plott. Og så basert på isotypekontroll, velg Q3 for å identifisere PD-1-blokkerende antistoffbundne CD8- og CD4 T-celler. I denne studien oppdaget gatingstrategien og flytcytometrianalysen PD-1-blokkerende antistoffbinding til T-celler hentet fra en dråpe perifert blod hos pasienter.PD-1 versus human IgG4-plottet viser bindingsstatusen til PD-1-blokkerende antistoffer på T-celler. Oransje prikker og svarte prikker indikerer henholdsvis anti-IgG4 antistoff og isotypekontroll. Før PD-1-blokkerende antistoff ble administrert, var det ingen humane IgG4-positive CD8- eller CD4 T-celler til stede, og PD-1-uttrykk ble bekreftet av et PD-1-påvisende antistoff.Etter administrering av nivolumab eller pembrolizumab kan IgG4 påvises på T-celler med anti-IgG4-antistoff, mens PD-1-påvising av antistoff-EH12.1 ikke gjenkjenner noen PD-1 på T-celler. De røde, blå og grønne portene indikerer henholdsvis fullstendig binding, delvis binding og tap av binding. Etter at pasientene seponerte nivolumab og pembrolizumab, ble statusen for PD-1-blokkerende antistoffbinding til CD8 T-celler redusert.Det var delvis bindende og til slutt fullstendig tap av binding. Pass på at du også blander blodprøven med RBC lysis. Også blanding av RBC lysis før overflatemarkørfarging er det viktigste trinnet i denne metoden.Hvis forskeren har tilgang til en avansert strømningscytometrimaskin, kan PD-1-blokkerende antistoffbundne T-celler evalueres med flere og flere markører knyttet til Denne strategien kan brukes til profilering av T-cellefenotyper som er ansvarlige for bivirkninger forårsaket av PD-1-blokkerende antistoffer. Prøvetaking fra pasienter med utviklede bivirkninger er viktig for å evaluere nytten av denne strategien.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Rapid Point-of-Care-analysen av Enoksaparin Antikoagulerende Effekt i fullblod

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

Repair of a Critical-sized Calvarial Defect Model Using Adipose-derived Stromal Cells Harvested from Lipoaspirate

Reparasjon av en kritisk størrelse Calvarial Defect Model Bruke adipose-avledet stromale cellene høstet fra Lipoaspirate

Craniofacial skeletal repair and regeneration offers the promise of de novo tissue formation through a cell-based approach utilizing stem cells. ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Høy gjennomstrømning Sekvensiell ELISA for validering av biomarkører for akutt transplantat-mot-vert-sykdom

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolasjon, karakterisering og Comparative Differensiering av Human tannpulpa stamceller hentet fra permanente tenner ved hjelp av to ulike metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse Imaging av Primary Preneoplastic mammary epitelceller Avledet fra genmodifisert mus modeller av Breast Cancer

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

Orthotopic Implantasjon og Peripheral Immune Cell Monitoring i II-45 syngeniske Rat Mesothelioma Model

The enormous upsurge of interest in immune-based treatments for cancer such as vaccines and immune checkpoint inhibitors, and increased understanding of ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Generering av Prostate Cancer Patient Avledet xenotransplantat Modeller fra Sirkulasjonstumorceller

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System

Gjentatt blod samling fra halen fotsporene til ikke-Anesthetized rotter med vakuum blod samling System

Blood can be collected from rats in a number of sampling locations. For instance, the tail vein is a superior location for blood sampling. However, the ...

Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery

Microelectrode Impalement metode for å Record membran potensial fra en Kanylert Middle cerebral arterie

Membrane potential (Vm) of vascular smooth muscle cells determines vessel tone and thus blood flow to an organ. Changes in the expression and function of ...

Isolation of Adipose Derived Regenerative Cells for the Treatment of Erectile Dysfunction Following Radical Prostatectomy

Isolering av adipose avledede regenerative celler for behandling av erektil dysfunksjon etter radikal prostatektomi

Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem ...