Name: monitoring pd-1-blocking antibodies bound to t cells derived from a drop of peripheral blood
Uploaded: 2020-02-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами С.К. от Японского общества содействия науке KAKENHI (JP17K16045) и Японского агентства медицинских исследований и разработок (JP18cm0106335 и 19cm0106310).

Выборка проводилась во время обычных клинических процедур. Все образцы человека были получены после получения информированного согласия субъектами в соответствии с Хельсинкской декларацией и с одобрения совета по этике Высшей школы медицины, Университета Осаки, Япония (15383 и 752).
<p cl...

<ol>
	<li>Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+PD-1+and+PD-L1+inhibitors+as+a+form+of+cancer+immunotherapy:+a+comprehensive+review+of+registration+trials+and+future+considerations.">Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8 (2018).</li><li>Borghaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Nonsquamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).</li><li>Brahmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Squamous-Cell+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).</li><li>Herbst, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+versus+docetaxel+for+previously+treated,+PD-L1-positive,+advanced+non-small-cell+lung+cancer+(KEYNOTE-010):+a+randomised+controlled+trial.">Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial.</a> The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).</li><li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-Related+Adverse+Events+Associated+with+Immune+Checkpoint+Blockade.">Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li><li>Weber, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+Profile+of+Nivolumab+Monotherapy:+A+Pooled+Analysis+of+Patients+With+Advanced+Melanoma.">Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).</li><li>Champiat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+immune+checkpoint+blockade+dysimmune+toxicities:+a+collaborative+position+paper.">Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper.</a> Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).</li><li>Brahmer, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+(MDX-1106)+in+refractory+solid+tumors:+safety,+clinical+activity,+pharmacodynamics,+and+immunologic+correlates.">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).</li><li>Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-parametric+flow+cytometry+staining+procedure+for+analyzing+tumor-infiltrating+immune+cells+following+oncolytic+herpes+simplex+virus+immunotherapy+in+intracranial+glioblastoma.">Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma.</a> Journal of Biological Methods. 6 (2), 112 (2019).</li><li>Osa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+monitoring+nivolumab+immunokinetics+in+non-small+cell+lung+cancer+patients.">Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients.</a> JCI Insight. 3 (19), 59125 (2018).</li><li>Zelba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantification+of+T-cells+expressing+PD-1+in+patients+on+anti-PD-1+immunotherapy.">Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).</li><li>Simoni, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bystander+CD8(+)+T+cells+are+abundant+and+phenotypically+distinct+in+human+tumour+infiltrates.">Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates.</a> Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).</li><li>Chiu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+general+method+for+quantifying+IgG-based+therapeutic+monoclonal+antibodies+in+human+plasma+using+protein+G+purification+coupled+with+a+two+internal+standard+calibration+strategy+using+LC-MS/MS.">Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS.</a> Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).</li></ol>

В этой статье мы сообщаем метод с помощью цитометра потока для обнаружения PD-1-блокирующих антител, связанных с Т-клетками, полученными из капли периферической крови, которую мы первоначально разработали для обнаружения ниволумаба10. Хотя этот метод очень прост и прост в вы?...

PD-1-блокирующие антитела стали стандартным выбором для лечения различных видов рака, в том числе немелкоклеточного рака легких (NSCLC)1,2,3,4. Они показывают замечательный терапевтический эффект в подмножестве больных раком, которые не ответили на обычные цитотоксические химиотерапии. Тем не менее, ингибиторы иммунной контрольной точки (ИКИ), которые включают PD-1-блокирующие антитела, может вызвать уникальный и четкий спектр побочных явлений, называемых иммунных побочных явлений (irAEs)5. Хотя irAEs может повлиять почти на все ткани, они чаще всего наблюдаются в желудочно-кишечном тракте, эндокринных желез, кожи и печени, и они могут вызвать зуд, сыпь, тошнота, диарея, и расстройства щитовидной железы6,7. В целом, большинство irAEs появляются в течение 1 до 2 месяцев после начала ИКИ. Однако в некоторых случаях они могут возникнуть позднее, чем через 1 год после начала лечения или даже после прекращения лечения6,7. Они также вызывают различные симптомы, которые могут быть трудно дискриминировать от других патологий. Таким образом, это может быть сложной задачей для оперативной диагностики irAEs и лечить их надлежащим образом. irAEs может повлиять на все ткани, и их начало сильно зависит от циркулирующих иммунных клеток, особенно Т-клеток, связанных с PD-1-блокирующих антител. Таким образом, простой и минимально инвазивный метод для мониторинга антител целевых Т-клеток имеет важное значение в клинических условиях.
Здесь мы разработали простой метод оценки связывания PD-1-блокирующих антител к Т-клеткам с помощью капли периферической цельной крови от онкологических больных, которые получали ниволумаб или пембролизумаб. Используя этот подход, мы смогли контролировать каждый из следующих: 1) продолжительность связывания антител к Т-клеткам, 2) заполняемость т-клеток PD-1 молекул терапевтических антител, и 3) состояние активации и иммунологические особенности Т-клеток. Этот метод является модификацией ранее сообщалось техники8. Количество крови требуется почти так же, как и необходимо для теста глюкозы, и подход не требует моноядерного обогащения клеток или со-культивирования с PD-1-блокирующих антител. Мы подтвердили, что этот метод также может быть выполнен с использованием замороженных образцов, в том числе периферических моноядерных клеток крови (PBMCs) и клеток из плеврального выпота, перикардиального выпота, бронхоальвеолярной жидкости для лаважа и спинномозговой жидкости, предполагая, что эта стратегия может быть полезна в контексте многоцентрового исследования. Этот метод может облегчить раннюю диагностику irAEs, а также помочь определить соответствующие иммуносупрессивные методы лечения для контроля их симптомов и определить оптимальное время для начала последующей терапии после ингибиторов PD-1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X RBC Lysis Buffer (Multi-species)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4300-54</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300518</td>
			<td>Clone RPA-T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301048</td>
			<td>Clone RPA-T8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14249-95</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>352058</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLOWJO</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12676029</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab81200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab99825</td>
			<td>Clone HP6025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>558117</td>
			<td>Clone UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)</td>
			<td>BD</td>
			<td>561272</td>
			<td>Clone EH12.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse IgG1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD</td>
			<td>557646</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring pd-1-blocking antibodies bound to t cells derived from a drop of peripheral blood

Ингибиторы иммунных контрольных точек, в том числе PD-1-блокирующие антитела, значительно улучшили результаты лечения при различных видах рака. Фармакологическая эффективность этих иммунотерапевтических препаратов является длительной, простирающейся даже после прекращения их инъекций, из-за постоянной концентрации крови. Здесь мы разработали простой анализ цитометрии потока для оценки Т-клеточного связывающего статуса PD-1-блокирующих антител ниволумаба и пембролизумаба. Как тест глюкозы, этот анализ требует только одну каплю периферической крови. Визуализация связывания антител на Т-клетках надежнее, чем измерение концентраций в крови антител. Кроме того, при необходимости, мы можем потенциально проанализировать многие отличительные иммунных маркеров на Т-клеток, связанных с PD-1-блокирующих антител. Таким образом, это простая и минимально инвазивная стратегия для анализа фармакологического эффекта PD-1-блокирование антител у онкологических больных.

Стратегия gating и анализ цитометрии потока(Рисунок 1) может обнаружить PD-1-блокирующий связывание антител к Т-клеткам, полученным от капли периферической крови пациента NSCLC. Перед PD-1-блокирующий антитела вводят, нет человека IgG4-положительных CD8 или CD4 Т-клетки присутствуют, ...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood at JoVE.com

Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood

Мы разработали простой анализ цитометрии потока для оценки связывания PD-1-блокирующих антител к Т-клеткам, требуя только капли периферической крови от онкологических больных.

Мониторинг PD-1-Блокирование антител, связанных с Т-клеток, полученных от капли периферической крови

Immune checkpoint inhibitors, including PD-1&#8211;blocking antibodies, have significantly improved treatment outcomes in various types of cancer. The ...

Поскольку этот метод определяет PD-1-блокирующие клетки, связанные с антителами, используя периферическую кровь у пациентов, можно определить конкретное подмножество, отвечающее за противоопухолевые эффекты и связанные с иммунитетом неблагоприятные явления. Этот метод требует лишь небольшое количество образца крови и процесс анализа довольно прост и быстр. Ему просто нужна машина цитометрии потока.Для начала соберите целые образцы крови в трубки для сбора крови, содержащие ЭДТА. Лечить каждые пять миллилитров круглого дна полистирола потока цитометрии трубки с одним миллилитром 2%фетальной сыворотки крупного рогатого скота в PBS. Вихрь в течение 10 секунд.Затем перенесите 20 микролитров целых образцов крови в обработанные пятими миллилитровые круглые нижние трубки. Добавьте 20 микролитров 2%FBS в PBS и 10 микролитров рецептора FC, блокирующего реагент. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.Далее добавьте 500 микролитров буфера лиза красных кровяных телец. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Добавить четыре миллилитров 2%FBS в PBS и спина вниз клетки на 400 раз г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию.Удалите супернатант стремлением. Повторите процесс мытья и аспирации. Повторное использование клеток в 100 микролитров 2%FBS в PBS и разделить на две трубки по 50 микролитров каждый.Добавьте поверхностные маркерные антитела. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте. Мыть образцы в два раза в 2%FBS в PBS, как и раньше.Повторное распределение клеток в 200 микролитров 2%FBS в PBS. Вставьте трубки в цитометр потока и приобретйте клетки в соответствии с рекомендуемым протоколом. Запись 10 000 событий, как лимфоцитов ворота и данные экспортного потока, как FCS файлов для анализа.Откройте файлы в программном обеспечении анализа и нажмите на файл управления изотипом, чтобы визуализировать клетки на вперед рассеяния по сравнению с боковой участок рассеяния и ворота лимфоцитов. Выберите одиночные ячейки с использованием FSCH против FSCW и SSCH против SSCW и отобразить их на CD3 против CD8 или CD3 против участка CD4. Ворота CD8 Т-клеток и CD4 Т-клеток соответственно.Выберите закрытые ячейки и отобразить их на PD-1 против человека IgG4 участка. А затем, основываясь на контроле изотипа, выберите No3 для определения PD-1-блокирующих антител связанных CD8 и CD4 Т-клеток. В этом исследовании стратегия гэтинга и анализ цитометрии потока обнаружили PD-1-блокирующие антитела, связывающиеся с Т-клетками, полученными из капли периферической крови пациента.Сюжет PD-1 против человека IgG4 показывает связывающий статус PD-1-блокирующих антител на Т-клетках. Оранжевые точки и черные точки указывают на антитела против IgG4 и окрашивание изотипа соответственно. До PD-1-блокирующих антител вводили, ни один человек IgG4 положительные CD8 или CD4 Т-клеток присутствовали и PD-1 выражение было подтверждено PD-1 обнаружения антитела.После nivolumab или pembrolizumab администрации, IgG4 может быть обнаружен на Т-клеток анти-IgG4 антитела в то время как PD-1 обнаружения антитела EH12.1 не признает каких-либо PD-1 на Т-клеток. Красные, синие и зеленые ворота указывают на полную привязку, частичную привязку и потерю связывания соответственно. После того, как пациенты прекратили nivolumab и pembrolizumab, статус PD-1-блокирующих антител связывания с CD8 Т-клеток снизилась.Произошла частичная привязка и, наконец, полная утрата привязки. Пожалуйста, не забудьте смешать образец крови с РБК лиза, а также. Кроме того, смешивание РБК лиза до окрашивания поверхностного маркера является ключевым шагом в этом методе.Если исследователь имеет доступ к передовой цитометрии потока машины, PD-1-блокирующих антител связанных Т-клеток могут быть оценены все больше и больше маркеров, связанных с этой стратегией могут быть применены для профилирования Т-клеток фенотипов, ответственных за неблагоприятные события, вызванные PD-1-блокирующих антител. Выборка у пациентов с развитыми неблагоприятными явлениями важна для оценки полезности этой стратегии.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Быстрое Точка-санитарной помощи анализа эффективности эноксапарина антикоагулянтов в цельной крови

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

Repair of a Critical-sized Calvarial Defect Model Using Adipose-derived Stromal Cells Harvested from Lipoaspirate

Ремонт критического размера дефекта свода черепа Модель Используя полученные из жировой ткани стромальных клеток, полученных из Lipoaspirate

Craniofacial skeletal repair and regeneration offers the promise of de novo tissue formation through a cell-based approach utilizing stem cells. ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Высокая пропускная способность последовательного ELISA для проверки биомаркеров острого трансплантат против хозяина

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Выделение, характеристика и сравнительный Дифференциация по правам зубных стволовых клеток, полученных из целлюлозы постоянных зубов с помощью двух различных методов

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Время изображений в заданный промежуток первичной предраковых эпителиальные клетки молочной железы, полученных из генно-инженерных мышей модели рака молочной железы

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

Ортотопическая Имплантация и периферической иммунной Мониторинг сотовый в модели II-45 Сингенная Крыса мезотелиомы

The enormous upsurge of interest in immune-based treatments for cancer such as vaccines and immune checkpoint inhibitors, and increased understanding of ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Генерация пациента рака простаты Производные ксенотрансплантат модели от циркулирующих опухолевых клеток

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System

Повторил забора крови из Вены хвост-наркоз крыс с системой сбора механотронное крови

Blood can be collected from rats in a number of sampling locations. For instance, the tail vein is a superior location for blood sampling. However, the ...

Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery

Метод микроэлектрода Impalement для записи Мембраны Потенциал из канналедированной средней мозговой артерии

Membrane potential (Vm) of vascular smooth muscle cells determines vessel tone and thus blood flow to an organ. Changes in the expression and function of ...

Isolation of Adipose Derived Regenerative Cells for the Treatment of Erectile Dysfunction Following Radical Prostatectomy

Выделение регенеративных клеток жирового происхождения для лечения эректильной дисфункции после радикальной простатэктомии

Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem ...