Name: monitoring pd-1-blocking antibodies bound to t cells derived from a drop of peripheral blood
Uploaded: 2020-02-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag till S.K. från Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (JP17K16045) och Japan Agency for Medical Research and Development (JP18cm0106335 och 19cm0106310).

Provtagning utfördes under rutinmässiga kliniska förfaranden. Alla mänskliga prover erhölls efter informerat samtycke, i enlighet med Helsingfors förklaring och med godkännande av den etiska granskningsnämnden vid Forskarskolan för medicin, Osakauniversitet, Japan (15383 och 752).
1. Beredning och färgning av helblodsprov
<ol><li>Samla in helblodprover i bloduppsamlingsrör som innehåller etendiamintetraättiksyra (EDTA). OBS: Blodinsamling kan utföras med antingen en vanlig n...

<ol>
	<li>Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+PD-1+and+PD-L1+inhibitors+as+a+form+of+cancer+immunotherapy:+a+comprehensive+review+of+registration+trials+and+future+considerations.">Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8 (2018).</li><li>Borghaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Nonsquamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).</li><li>Brahmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Squamous-Cell+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).</li><li>Herbst, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+versus+docetaxel+for+previously+treated,+PD-L1-positive,+advanced+non-small-cell+lung+cancer+(KEYNOTE-010):+a+randomised+controlled+trial.">Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial.</a> The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).</li><li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-Related+Adverse+Events+Associated+with+Immune+Checkpoint+Blockade.">Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li><li>Weber, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+Profile+of+Nivolumab+Monotherapy:+A+Pooled+Analysis+of+Patients+With+Advanced+Melanoma.">Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).</li><li>Champiat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+immune+checkpoint+blockade+dysimmune+toxicities:+a+collaborative+position+paper.">Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper.</a> Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).</li><li>Brahmer, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+(MDX-1106)+in+refractory+solid+tumors:+safety,+clinical+activity,+pharmacodynamics,+and+immunologic+correlates.">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).</li><li>Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-parametric+flow+cytometry+staining+procedure+for+analyzing+tumor-infiltrating+immune+cells+following+oncolytic+herpes+simplex+virus+immunotherapy+in+intracranial+glioblastoma.">Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma.</a> Journal of Biological Methods. 6 (2), 112 (2019).</li><li>Osa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+monitoring+nivolumab+immunokinetics+in+non-small+cell+lung+cancer+patients.">Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients.</a> JCI Insight. 3 (19), 59125 (2018).</li><li>Zelba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantification+of+T-cells+expressing+PD-1+in+patients+on+anti-PD-1+immunotherapy.">Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).</li><li>Simoni, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bystander+CD8(+)+T+cells+are+abundant+and+phenotypically+distinct+in+human+tumour+infiltrates.">Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates.</a> Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).</li><li>Chiu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+general+method+for+quantifying+IgG-based+therapeutic+monoclonal+antibodies+in+human+plasma+using+protein+G+purification+coupled+with+a+two+internal+standard+calibration+strategy+using+LC-MS/MS.">Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS.</a> Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).</li></ol>

I den här artikeln rapporterar vi en metod med hjälp av en flödescytometer för att upptäcka PD-1-blockerande antikroppar bundna till T-celler som härrör från en droppe perifert blod, som vi ursprungligen utvecklade för nivolumab detektering10. Även om denna teknik är mycket enkel och lätt att utföra, bör två viktiga punkter noteras för att få korrekta resultat. En är att för att upptäcka PD-1 molekyler, en lämplig antikropp som konkurrerar med nivolumab och pembrolizumab bör ...

PD-1-blockerande antikroppar har blivit standardvalet för behandling av olika typer av cancer, inklusive icke-småcellig lungcancer (NSCLC)1,2,3,4. De visar en anmärkningsvärd terapeutisk effekt i en delmängd av cancerpatienter som inte har svarat på konventionella cytotoxiska kemoterapier. Immuncheckpointhämmare (ICI), som inkluderar PD-1-blockerande antikroppar, kan dock orsaka ett unikt och distinkt spektrum av biverkningar, så kallade immunrelaterade biverkningar (irA)5. Även om irAEs kan påverka nästan alla vävnader, de är oftast observeras i mag-tarmkanalen, endokrina körtlar, hud och lever, och de kan orsaka klåda, hudutslag, illamående, diarré, och sköldkörtelrubbningar6,7. I allmänhet uppträder de flesta irAE inom 1 till 2 månader efter det att Icis har inletts. I vissa fall kan de dock förekomma senare än 1 år efter behandlingsbörjan eller till och med efter avslutad behandling6,7. De orsakar också olika symtom som kan vara svåra att diskriminera från andra patologier. Det kan därför vara en utmaning att snabbt diagnostisera irAEs och behandla dem på lämpligt sätt. irAEs kan påverka alla vävnader, och deras debut påverkas starkt av cirkulerande immunceller, särskilt T-celler bundna till PD-1-blockerande antikroppar. Därför är en enkel och minimalt invasiv metod för att övervaka antikroppsriktade T-celler viktigt i kliniska miljöer.
Här utvecklade vi en enkel metod för att bedöma bindningen av PD-1-blockerande antikroppar mot T-celler med hjälp av en droppe perifert helblod från cancerpatienter som fick nivolumab eller pembrolizumab. Med hjälp av detta tillvägagångssätt kunde vi övervaka varoch en av följande: 1) varaktigheten av antikroppar bindning till T-celler, 2) beläggningen av T-cell PD-1 molekyler av terapeutiska antikroppar, och 3) aktiveringstatus och immunologiska funktioner av T-celler. Denna metod är en ändring av en tidigare rapporterad teknik8. Mängden blod som krävs är nästan densamma som det som behövs för ett glukostest, och metoden kräver inte mononukleär cellanrikning eller samodling med PD-1-blockerande antikroppar. Vi bekräftade att denna metod också kan utföras med frysta prover, inklusive perifert blod mononukleära celler (PBMCs) och celler från pleura-effusion, perikardvätska effusion, bronchoalveolar lavage vätska, och ryggmärgsvätskan, vilket tyder på att denna strategi kan vara användbar i samband med en multicenter studie. Denna metod kan underlätta tidig diagnos av irAEs, och även bidra till att bestämma lämpliga immunsuppressiva behandlingar för att kontrollera sina symtom och att identifiera de optimala tiderna för att initiera efterföljande behandlingar efter PD-1-hämmare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X RBC Lysis Buffer (Multi-species)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4300-54</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300518</td>
			<td>Clone RPA-T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301048</td>
			<td>Clone RPA-T8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14249-95</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>352058</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLOWJO</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12676029</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab81200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab99825</td>
			<td>Clone HP6025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>558117</td>
			<td>Clone UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)</td>
			<td>BD</td>
			<td>561272</td>
			<td>Clone EH12.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse IgG1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD</td>
			<td>557646</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring pd-1-blocking antibodies bound to t cells derived from a drop of peripheral blood

Immun checkpointhämmare, inklusive PD-1-blockerande antikroppar, har avsevärt förbättrat behandlingsresultaten i olika typer av cancer. Den farmakologiska effekten av dessa immunterapier är långvarig, som sträcker sig även utöver utsättningen av deras injektioner, på grund av ihållande blodkoncentrationer. Här utvecklade vi en enkel flödescytometrianalys för att utvärdera T-cellbindningsstatusen för PD-1-blockerande antikroppar nivolumab och pembrolizumab. Som ett glukostest kräver denna analys bara en enda droppe perifert blod. Visualisera antikroppsbindning på T-celler är mer tillförlitlig än att mäta antikroppsblodkoncentrationer. Dessutom, om nödvändigt, kan vi potentiellt analysera många särskiljande immunrelaterade markörer på T-celler bundna till PD-1-blockerande antikroppar. Således är detta en enkel och minimalt invasiv strategi för att analysera den farmakologiska effekten av PD-1-blockerande antikroppar hos cancerpatienter.

Gating-strategin och flödescytometrianalysen (figur 1) kan upptäcka PD-1-blockerande antikroppsbindning till T-celler som erhålls från en droppe perifert subandeblod från NSCLC-patienten. Innan PD-1-blockerande antikroppar administreras finns inga humana IgG4-positiva CD8- eller CD4 T-celler och PD-1-uttryck kan bekräftas av ett PD-1-detekteringsantikroppar (EH12.1)(figur 2A). Efter administrering av nivolumab eller pembrolizumab kan IgG4 ...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood at JoVE.com

Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood

Vi utvecklade ett enkelt flöde cytometri analys för att utvärdera bindningen av PD-1-blockerande antikroppar till T-celler, kräver endast en droppe perifert blod från cancerpatienter.

Övervakning PD-1-Blockerande antikroppar bundna till T-celler som härrör från en droppe perifert blod

Immune checkpoint inhibitors, including PD-1&#8211;blocking antibodies, have significantly improved treatment outcomes in various types of cancer. The ...

Eftersom denna metod bestämmer PD-1-blockerande antikroppsbundna celler med hjälp av perifert blod från patienter, kan den specifika delmängd som ansvarar för antitumöreffekter och immunrelaterade biverkningar identifieras. Denna metod behöver bara en liten mängd blodprov och analysera processen är ganska enkel och snabb. Det behöver bara en flödescytometrimaskin.Till att börja samla in helblodsprover i bloduppsamlingsrör som innehåller EDTA. Behandla varje fem milliliter rund botten polystyren flöde cytometrirör med en milliliter av 2%fetala nötkreatur serum i PBS. Vortex i 10 sekunder.Överför sedan 20 mikroliter helblodsprover till de behandlade fem milliliter runda bottenrören. Tillsätt 20 mikroliter på 2%FBS i PBS och 10 mikroliter av humanspecifik FC-receptorblockeringsreagens. Blanda väl och inkubera i 15 minuter i rumstemperatur.Därefter lägger du till 500 mikroliter av röda blodkroppar lysbuffert. Blanda väl och inkubera i 10 minuter i rumstemperatur. Tillsätt fyra milliliter på 2%FBS i PBS och snurra ner celler på 400 gånger g i fem minuter vid fyra grader Celsius.Ta bort supernatanten genom aspiration. Upprepa tvätt- och aspirationsprocessen. Resuspend cellerna i 100 mikroliter av 2%FBS i PBS och dela upp i två rör av 50 mikroliter vardera.Lägg till ytmarkörantikroppar. Blanda väl och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur i mörker. Tvätta prover två gånger i 2%FBS i PBS som tidigare.Resuspend cellerna i 200 mikroliter av 2%FBS i PBS. Sätt in rören i flödescytometern och skaffa celler efter det rekommenderade protokollet. Spela in 10, 000 händelser som lymfocytporten och exportflödesdata som FCS-filer för analys.Öppna filer i analysen programvara och klicka på filen av isotyp kontroll för att visualisera cellerna på en framåt scatter kontra sidan scatter plot och grind lymfocyter. Välj enstaka celler med hjälp av FSCH kontra FSCW och SSCH kontra SSCW och visa dem på en CD3 kontra CD8 eller CD3 kontra CD4-plot. Grind cd8 T-celler respektive CD4 T-celler.Markera gated celler och visa dem på en PD-1 kontra mänskliga IgG4 tomt. Och sedan baserat på isotype kontroll, välj Q3 för att identifiera PD-1-blockerande antikroppsbundna CD8 och CD4 T-celler. I denna studie, den gating strategi och flöde cytometry analys upptäckt PD-1-blockerande antikroppar bindning till T-celler som erhållits från en droppe patient perifert blod.PD-1 kontra mänskliga IgG4 tomten visar bindning status PD-1-blockerande antikroppar på T-celler. Orange prickar och svarta prickar indikerar anti-IgG4 antikropp och isotyp kontroll färgning respektive. Innan PD-1-blockerande antikropp administrerades, var ingen mänsklig IgG4 positiva CD8 eller CD4 T-celler närvarande och PD-1 uttryck bekräftades av en PD-1 upptäcka antikroppar.Efter nivolumab- eller pembrolizumab-administrering kan IgG4 påvisas på T-celler med anti-IgG4-antikropp medan PD-1-påvisande antikroppen EH12.1 inte känner igen någon PD-1 på T-celler. De röda, blå och gröna portarna anger fullständig bindning, partiell bindning respektive förlust av bindning. Efter att patienter avbrutit nivolumab och pembrolizumab minskade statusen för PD- 1-blockerande antikroppsbindning till CD8 T-celler.Det fanns delvis bindande och slutligen fullständig förlust av bindande. Vänligen se till att blanda blodprovet med RBC lys också. Även, blanda RBC lys före ytan markör färgning är nyckeln steg i denna metod.Om forskaren har tillgång till en avancerad flödescytometrimaskin kan PD-1-blockerande antikroppsbundna T-celler utvärderas med fler och fler markörer relaterade till Denna strategi kan tillämpas för profilering av T-cells fenotyper som är ansvariga för oönskade händelser orsakade av PD-1-blockerande antikroppar. Provtagning från patienter med utvecklade biverkningar är viktigt att utvärdera nyttan av denna strategi.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Snabb Point-of-Care analys av enoxaparin antikoagulantia Effekt i helblod

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

Repair of a Critical-sized Calvarial Defect Model Using Adipose-derived Stromal Cells Harvested from Lipoaspirate

Reparation av en kritisk storlek Calvarial Defekt modell med fett-härledda stromaceller skördas från Lipoaspirate

Craniofacial skeletal repair and regeneration offers the promise of de novo tissue formation through a cell-based approach utilizing stem cells. ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Hög genomströmning Sekventiell ELISA för validering av biomarkörer för akut graft-versus-Host Disease

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolering, karakterisering och jämförande differentiering av mänskliga Dental celler Pulp Stem Härstammar från permanenta tänder med hjälp av två olika metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse avbildning av primära preneoplastiska bröstepitelialceller celler från genetiskt modifierade musmodeller av bröstcancer

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

Orthotopic Implantation och perifera immunceller Övervakning av II-45 syngena Rat mesoteliom Modell

The enormous upsurge of interest in immune-based treatments for cancer such as vaccines and immune checkpoint inhibitors, and increased understanding of ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Generation av prostatacancer Patient Härstammar xenograft-modeller från cirkulerande tumörceller

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System

Upprepade blodinsamling från svans åder av icke-sövda råttor med ett System för insamling av vakuum blod

Blood can be collected from rats in a number of sampling locations. For instance, the tail vein is a superior location for blood sampling. However, the ...

Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery

Microelektrod impalement metod för att spela in membran potential från en kanylerade mellersta cerebral artär

Membrane potential (Vm) of vascular smooth muscle cells determines vessel tone and thus blood flow to an organ. Changes in the expression and function of ...

Isolation of Adipose Derived Regenerative Cells for the Treatment of Erectile Dysfunction Following Radical Prostatectomy

Isolering av fetthärledda regenerativa celler för behandling av erektil dysfunktion efter radikal prostatektomi

Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem ...