Name: hemocompatibility testing of blood-contacting implants in a flow loop model mimicking human blood flow
Uploaded: 2020-03-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow at JoVE.com

For udførelsen af scanning elektron mikroskopi, takker vi Ernst Schweizer fra den del af medicinske materialer videnskab og teknologi på universitetshospitalet Tuebingen. Forskningen blev støttet af Undervisnings-, Ungdoms- og Sportsministeriet i CR under Det Nationale Bæredygtighedsprogram II (Projekt BIOCEV-FAR LQ1604) og af Det Tjekkiske Videnskabsinstituts projekt nr.

Blodprøvetagningsproceduren blev godkendt af den etiske komité for det medicinske fakultet ved Universitetet i Tuebingen (projektidentifikationskode: 270/2010BO1). Alle emner gav skriftligt, informeret samtykke til optagelse før deltagelse.
1. Forberedelse af Heparin-loaded Monovetter
<ol><li>Den ufortyndede heparin (5.000 IE/ml) blandes med natriumchlorid (NaCl, 0,9 %) opløsning og fremstille en opløsning med en koncentration på 15 IE/ml heparin.</li>
	<li>900 μL af den fortyndede he...

<ol>
	<li>ISO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological evaluation of medical devices. , (2002).</li><li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Contacting+Biomaterials:+In+Vitro+Evaluation+of+the+Hemocompatibility.">Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).</li><li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+contamination:+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies.">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).</li><li>Cattaneo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigation+of+chemical+properties+and+biocompatibility+of+neurovascular+braided+implants.">In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).</li><li>Stang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocompatibility+testing+according+to+ISO+10993-4:+discrimination+between+pyrogen-+and+device-induced+hemostatic+activation.">Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation.</a> Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).</li><li>van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacles+in+haemocompatibility+testing.">Obstacles in haemocompatibility testing.</a> Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).</li><li>Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+blood+flow+model+with+physiological+wall+shear+stress+for+hemocompatibility+testing-An+example+of+coronary+stent+testing.">In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing.</a> Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).</li><li>Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hemocompatibility+testing:+The+importance+of+fresh+blood.">In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood.</a> Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).</li><li>Kaplan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-thrombogenic+fibrin-heparin+coating+promotes+in+vitro+endothelialization.">Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).</li><li>. SEM Imaging of Biological Samples Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples">https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples</a> (2019)</li><li>Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hemocompatibility+and+vascular+endothelial+cell+functionality+on+titania+nanostructures+under+static+and+dynamic+conditions+for+improved+coronary+stenting+applications.">In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications.</a> Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).</li><li>Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+evaluation+of+novel+blood+incubation+systems+for+in+vitro+hemocompatibility+assessment+of+planar+solid+surfaces.">Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces.</a> The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).</li><li>Sanak, M., Jakie&#322;a, B., W&#281;grzyn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+hemocompatibility+of+materials+with+arterial+blood+flow+by+platelet+functional+tests.">Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests.</a> Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).</li><li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocompatibility+evaluation+of+different+silver+nanoparticle+concentrations+employing+a+modified+Chandler-loop+in+vitro+assay+on+human+blood.">Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood.</a> Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).</li><li>Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+shear+rate+on+the+adhesion/activation+of+human+platelets+in+flow+through+a+closed-loop+polymeric+tubular+system.">The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).</li><li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers-a+practical+guide.">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide.</a> Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+vitro+hemocompatibility+testing-improving+the+signal+to+noise+ratio.">Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio.</a> Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, 549-552 (2012).</li><li>Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+diagnostic+value+of+leukocyte+and+platelet+accumulations+around+"air+bubbles"+in+blood+after+venous+air+embolism.">Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism.</a> International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).</li><li>Miller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+initial+period+of+protein+adsorption+by+dynamic+surface+tension+measurements+using+different+drop+techniques.">Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).</li><li>van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+modified+chandler,+roller+pump,+and+ball+valve+circulation+models+for+in+vitro+testing+in+high+blood+flow+conditions:+application+in+thrombogenicity+testing+of+different+materials+for+vascular+applications.">Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications.</a> International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).</li><li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+the+thrombogenicity+and+endothelialization+of+bare+metal+and+surface-coated+neurovascular+stents.">Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents.</a> AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).</li><li>Monnink, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon-carbide+coated+coronary+stents+have+low+platelet+and+leukocyte+adhesion+during+platelet+activation.">Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation.</a> Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).</li><li>Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilink+stent+promotes+less+platelet+and+leukocyte+adhesion+than+a+traditional+stainless+steel+stent:+an+in+vitro+experimental+study.">Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study.</a> Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).</li><li>Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+haemodialysis+membrane+biocompatibility+by+parallel+assessment+in+an+ex+vivo+model+in+healthy+volunteers.">Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).</li><li>Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+model+for+studying+the+interactions+between+human+whole+blood+and+endothelium.">A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).</li></ol>

Den præsenterede protokol beskriver en omfattende og pålidelig metode til hæmofikompatibilitetstest af blodkontaktende implantater i overensstemmelse med ISO 10993-4 i en forskydningsflowmodel, der efterligner blodgennemstrømningen hos mennesker. Denne undersøgelse er baseret på test af laser-cut neurovaskulære implantater, men kan udføres med en række prøver. Resultaterne viser, at denne metode muliggør en bred analyse af forskellige parametre såsom blodcelletal, forekomsten af flere hæmokompatibilitetsmark...

In vivo-anvendelsen af implantater og biomaterialer, som interagerer med humant blod, kræver intens præklinisk testning med fokus på undersøgelse af forskellige markører for det hæmostatiske system. Den Internationale Standardiseringsorganisation 10993-4 (ISO 10993-4) specificerer de centrale principper for vurdering af blodkontakt (dvs. stents og vaskulære transplantater) og tager hensyn til udstyrets design, kliniske nytteværdi og nødvendige materialer1.
Humant blod er en væske, der indeholder forskellige plasmaproteiner og -celler, herunder leukocytter (hvide blodlegemer [WBCs]), erythrocytter (røde blodlegemer [RBC]), og blodplader, som udfører komplekse funktioner i den menneskelige krop2. Den direkte kontakt mellem fremmede materialer og blod kan forårsage bivirkninger, såsom aktivering af immunsystemet eller koagulationssystemet, hvilket kan føre til betændelse eller trombotiske komplikationer og alvorlige problemer efter implantation3,4,5. Derfor giver in vitro hæmogomkompatibilitetsvalidering en mulighed før implantation for at opdage og udelukke hematologiske komplikationer , der kan fremkaldes ved blods kontakt med en fremmed overflade6.
Den præsenterede flow loop model blev etableret for at vurdere hæmokompatibilitet af neurovaskulære stents og lignende enheder ved at anvende en strømningshastighed på 150 ml / min i slanger (diameter på 3,2 mm) til at efterligne cerebral flow betingelser og arterie diametre2,7. Ud over behovet for en optimal in vitro-model er blodkilden en vigtig faktor for at opnå pålidelige og uændrede resultater, når man analyserer hæmokompatibilitet af et biomateriale8. Det indsamlede blod skal anvendes umiddelbart efter prøveudtagningen for at forhindre ændringer forårsaget af langvarig opbevaring. Generelt bør der udføres en skånsom tapning af blod uden stase ved hjælp af en 21 G nål for at minimere præaktiveringen af blodplader og koagulationskaskade under blodtegning. Endvidere omfatter donorudelukkelseskriterier dem, der ryger, er gravide, er i dårlig sundhedstilstand eller har taget p-piller eller smertestillende midler i løbet af de foregående 14 dage.
Denne undersøgelse beskriver en in vitro model for den omfattende hæmokompatibilitet test af stent implantater under flow betingelser. Når man sammenligner ubestrøget med fibrin-heparin-belagte stents, resultaterne af den omfattende hæmokompatibilitet test afspejler forbedret hæmokompatibilitet af fibrin-heparin-belagte stents9. I modsætning hertil fremkalder de ubestrøget stents aktivering af koagulationskaskade, som det fremgår af en stigning i thombin-antithrombin III (TAT) koncentrationer og tab af blodpladenumre på grund af vedhæftning af blodplader til stent overflade. Samlet set anbefales det at integrere denne hæm/kompatibilitetsmodel som en præklinisk test for at påvise eventuelle bivirkninger på det hæmostatiske system, der er forårsaget af enheden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>aqua ad iniectabilia</td>
			<td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany</td>
			<td>1088813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-TG ELISA</td>
			<td>Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany</td>
			<td>00950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotana 460 R</td>
			<td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrat monovettes (1.4 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>6,16,68,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAD monovettes (2.7 mL)</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>367562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA monovettes (1.2 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>6,16,62,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol p.A. (1000 mL)</td>
			<td>AppliChem, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1,31,08,61,611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25 % in water)</td>
			<td>SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany</td>
			<td>23114.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin coating for tubes</td>
			<td>Ension, Pittsburgh, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL)</td>
			<td>LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany</td>
			<td>PZN 15261203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate Reader Mithras LB 940</td>
			<td>Berthold, Bad Wildbad, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,9%</td>
			<td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany</td>
			<td>1312813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral monovettes (9 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>2,10,63,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump ISM444B</td>
			<td>Cole Parmer, Wertheim, Germany</td>
			<td>3475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3124000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic container (100 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>7,55,62,300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMN-Elastase ELISA</td>
			<td>Demeditec Diagnostics, Kiel Germany</td>
			<td>DEH3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride tube</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>30123328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neurovascular laser-cut implants</td>
			<td>Acandis GmbH, Pforzheim</td>
			<td>01-0011x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC5b-9 ELISA</td>
			<td>TECOmedical, Buende, Germany</td>
			<td>A029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>Cambridge Instruments, Cambridge, UK</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape (96 well plate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>15036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10/12 mL Norm-Ject</td>
			<td>Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>10080010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAT micro kit</td>
			<td>Siemens Healthcare, Marburg, Germany</td>
			<td>OWMG15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath Type 1083</td>
			<td>Gesellschaft f&#252;r Labortechnik, Burgwedel, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemocompatibility testing of blood-contacting implants in a flow loop model mimicking human blood flow

Den stigende brug af medicinsk udstyr (f.eks. vaskulære transplantater, stenter og hjertekatetre) til midlertidige eller permanente formål, der forbliver i kroppens kredsløbssystem, kræver en pålidelig og multiparametrisk tilgang, der evaluerer de mulige hæmatologiske komplikationer forårsaget af disse anordninger (dvs. aktivering og destruktion af blodkomponenter). Omfattende in vitro hæmogomikompatibilitet test af blod-kontakte implantater er det første skridt i retning af en vellykket in vivo gennemførelse. Derfor er omfattende analyse ifølge Den Internationale Standardiseringsorganisation 10993-4 (ISO 10993-4) obligatorisk før klinisk anvendelse. Den præsenterede flow loop beskriver en følsom model til at analysere den hæmostatiske ydeevne af stents (i dette tilfælde, neurovaskulære) og afsløre bivirkninger. Brugen af frisk humant fuldblod og blid blodprøvetagning er afgørende for at undgå præaktivering af blod. Blodet gennembruges gennem en hepariniseret slange, der indeholder prøveemnet, ved hjælp af en peristaltisk pumpe med en hastighed på 150 ml/min. ved 37 °C i 60 min. Før og efter perfusion, hæmatologiske markører (dvs. antallet af blodlegemer, hæmoglobin, hæmatokrit og plasmatiske markører), der angiver aktivering af leukocytter (polymorfocyon [PMN]-elastase), blodplader (β-tromboglobulin [β-TG]), koagulationssystemet (thombin-antithrombin III [TAT]) og komplementkaskade (SC5b-9) analyseres. Afslutningsvis præsenterer vi en vigtig og pålidelig model for omfattende hæmorikompatibilitetstest af stenter og andre blodkontaktenheder forud for klinisk anvendelse.

Kort opsummeret, humant fuldblod blev indsamlet i heparin-loaded monovetter derefter samlet og bruges til at evaluere baseline niveauer af celletal samt plasmatiske hæmomkompatibilitet markører.
Efterfølgende blev slangen indeholdende de neurovaskulære implantatprøver fyldt, og blodet blev perfunderet i 60 min. ved 150 ml/min. og 37 °C ved hjælp af en peristaltpumpe. Igen blev antallet af celler analyseret i alle grupper, og plasmaprøverne blev forberedt til ELISA-analyser (<strong cla...

Watch this Scientific Journal Video about Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow at JoVE.com

Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow

Denne protokol beskriver en omfattende hæmorikompatibilitet evaluering af blod-kontakt enheder ved hjælp af laser-cut neurovaskulære implantater. En flow loop model med frisk, heparinized humant blod anvendes til at efterligne blodgennemstrømningen. Efter perfusion analyseres forskellige hæmatologiske markører og sammenlignes med de værdier, der opnås umiddelbart efter blodtapning for hæmorikompatibilitetsevaluering af de testede enheder.

Hæmorikompatibilitet test af blod-kontakt implantater i en Flow Loop Model efterligne humanblodgennemstrømning

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the ...

Denne protokol præsenterer en model for hemocompatibility undersøgelse af blod-kontakt enheder i henhold til International Standard Organization retningslinjer. Modellen er ideel til at efterligne de fysiologiske forhold, der svarer til implantatet, da den lave baggrund for trombotiske hændelser og den lave koncentration af antikoagulanter muliggør en bred analyse af blodparameteren. Denne metode er ideel til biomateriale forskning, da det giver en enkel måde at vurdere hæmokompatibilitet.Desuden kan det bruges til prækliniske undersøgelser. For heparinbelastning blandes først 5.000 internationale enheder af ufortyndet heparin med 0,9 % natriumchlorid for at opnå 15 internationale enheder pr. milliliter heparinkoncentration. Dernæst tilsættes 900 mikroliter af den fortyndede heparinopløsning til tre neutrale monovetter og tre reserverede monovetter pr. donor og opbevarer de heparinbelastede monovekster ved fire grader Celsius.30 minutter før blodprøvetagningen anbringes monoveterne ved stuetemperatur. Når monovetaterne er varmet op, indsamles der ni milliliter blod i hver af tre monovetter pr. donor, før alle 27 milliliter blod fra hver donor samles i en enkelt plastbeholder. For at forberede flowsløjfen skal der indlæses mindst ét rør pr. tilstand med det neurovaskulære laserskærkeimplantat af interesse og anbringes i en ende af hvert rør i et reservoir fyldt med 0,9 % natriumchlorid.Anlaf et afladet rør ind i beholderen, og tilslut alle rørene til pumpehovedet. Sæt derefter den anden ende af hvert rør i en målecylinder og juster indstillingerne for den peristaltiske pumpe til en strømningshastighed på 150 milliliter i minuttet ved hjælp af en timer, mens du kontrollerer påfyldningsniveauet i målecylinderen. Til hæmokompatibilitetstest skal du bruge en 12 millilitersprøjte til at fylde hvert rør med seks milliliter blod.Efter at have baseret et kredsløb, skal du bruge en 0,5 centimeter lang silikoneforbindelsesslange til at lukke rørene tæt og placere rørene i et 37 grader Celsius vandbad. Start derefter 60 minutters røret. Ved analyse af fuldblodstælling tilsættes 1,2 milliliter ikke-perfunderet blod eller 1,2 milliliter blod fra hvert rør efter perfusionen til individuelle monovegater indeholdende EDTA.Inverter forsigtigt monoveterne fem gange og læg hætteglassene i en blodanalysator for en blodtællingsanalyse af hver prøve. I slutningen af analysen, placere monovetterne på is i 15-60 minutter. Ved indsamling af citratplasma udfyldes citratholdige monovetter med 1,4 milliliter ikke-perperfusedt eller perfunderet blod og omhyggeligt invertere hver monovette fem gange.Plasmaet adskilles ved centrifugering, og tre 250 mikroliter aliquots af plasmafraktionen adskilles i individuelle 1,5 milliliterreaktionsrør. Derefter fryses plasmaprøverne i flydende nitrogen og opbevares på minus 20 grader Celsius, indtil de analyseres. For EDTA plasmaopsamling adskilles plasmaet efter EDTA-plasmaopsamlingen efter inkubationen celsius efter blodtællingen ved centrifugering, og tre 250 mikroliter aliquots af plasmafraktionen overføres til individuelle 1,5 milliliterreaktionsrør.Derefter fryses plasmaprøverne i flydende nitrogen i minus 20 grader Celsius opbevaring. For CTAD plasma indsamling, fylde CTAD-holdige monovetter med 2,7 milliliter friskglasset eller perfunderet blod og omhyggeligt vende rørene fem gange. Monovetterne sættes på is i 15-60 minutter, før plasmaet opsamres ved centrifugering.700 mikroliter af hver mellemplasmafraktion overføres til individuelle 1,5 milliliterreaktionsrør, og de fyldte reaktionsrør centrifres igen. Derefter overføres to 100 mikroliter aliquots af den midterste fraktion i individuelle 1,5 milliliter reaktionsrør og fryse rørene i flydende nitrogen til deres opbevaring ved minus 20 grader Celsius. For at måle TAT-niveauerne i citratplasmaprøverne tilsættes 50 mikroliter ELISA-prøvebuffer i hver brønd på en 96-brønd flad bundplade og 50 mikroliter plasmastandard, plasmakontrol og ufortyndede plasmaprøver i dubletter til de relevante brønde på pladen.Efter forsegling af pladen inkuberes prøverne ved 37 grader Celsius i 15 minutter med let omrystning. Ved slutningen af inkubationen vaskes pladen tre gange med 300 mikroliter vaskeopløsning pr. brønd, før der tilsættes 100 mikroliter peroxidase konjugerede anti-humant TAT-antistof til hver brønd. Efter 15 minutters inkubation ved 37 grader Celsius med omrystning vaskes pladen tre gange med 300 mikroliter frisk vaskeopløsning pr. brønd.Efter den sidste vask tilsættes 100 mikroliter frisklavet kromogenopløsning pr. brønd til en 30-minutters inkubation ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning tilsættes der 100 mikroliter stopopløsning til hver brønd, og den optiske tæthed aflæses på et fotometer ved 490 til 500 nanometer ved hjælp af standardkurvedataene som en tendenslinje til beregning af TAT-koncentrationen af hver prøve. For at forberede implantaterne til scanning af elektronmikroskopi skal du bruge snævler til at fjerne implantaterne fra rørene og kort skylle hvert implantat tre gange i frisk 0,9% natriumchlorid pr. vask.Efter den sidste vask opbevares implantaterne i individuelle beholdere med 2 % glutaraldehyd i PBS uden calcium og magnesium natten over ved fire grader Celsius. Næste morgen inkuberes implantaterne i individuelle beholdere med PBS i 10 minutter, før implantaterne dehydreres i stigende koncentrationer af ethanol i 10 minutter pr. koncentration som angivet. Umiddelbart efter blodtapning og perfusion, ingen ændringer opdages i antallet af hvide eller røde blodlegemer eller i hæmatokrit værdier.Men, et fald i hæmoglobin niveauer opdages efter perfusion i flow loop system. Der observeres også et fald i antallet af blodplader, som øges, når der findes en ubestrøget stent i slangen. Især er dette tab reduceres, når blodet er inkuberet med en fibrin-heparin-belagt stent.TAT-den komplekse koncentration øges mildt som reaktion på perfusionen. Når der tilsættes en stent af bar metal, registreres der imidlertid en betydelig stigning i TAT, hvilket indikerer en gennemgribende aktivering af koagulationssystemet. Brugen af en fibrin-heparin-belagt stent forhindrer denne aktivering.Perfusion fører til en øget aktivering af den kompliment kaskade, der ikke er påvirket af tilstedeværelsen af ubestrøget eller fibrin-heparin-belagt stents. Tilsvarende aktiveres neutrofilgranulocytter som det fremgår af kvantificeringen af polymoronuclear neutrofil elastaseniveauer. Visualisering ved at scanne elektronmikroskopi afslører, at tilstedeværelsen af et tæt netværk af blodlegemer og proteiner på overfladen af den ubestrøget stent efter perfusion, der ikke observeres på de fibrin-heparin-belagte stents.Det er yderst vigtigt at bekræfte, at blodet opfylder inklusionskriterierne for at få prøver og at anvende frisktrukket blod så hurtigt som muligt. Humant blod kan indeholde blodbårne vira og andre agenser og indebærer risiko for infektion, så sørg for altid at bære passende PPE, når du håndterer prøverne.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Visualisering og analyse af blodgennemstrømning og iltforbruget i Nedsat mikrocirkulation: Ansøgning til en akut hepatitis model

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flowcytometri cellebaseret assay til påvisning af antistoffer til N-methyl-D-aspartat-receptor eller dopamin-2-receptoren i humant serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Intravital Video Mikroskopi Målinger af Retinal blodgennemstrømningen i Mus

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Automatiseret Måling af mikrocirkulatorisk Blood Flow Velocity i lungemetastaser af rotter

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Indsamling, Isolation, og flowcytometrisk analyse for Human endocervikale prøver

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Ultralyd funderet vurdering af koronararterie Flow og koronar Flow Reserve Brug af trykoverbelastning Model i mus

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Karakterisering af immunceller i menneskers fedtvæv ved hjælp af flowcytometri

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Samtidige flow Cytometrisk karakterisering af flere celletyper hentet fra mus hjerne/rygmarv gennem forskellige homogenisering metoder

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

Evaluering af cerebral Blood flow Autoregulation i rotter ved hjælp af Laser Doppler Flowmetry

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

A Rabbit Venous Interposition Model Mimicking Revascularization Surgery using Vein Grafts to Assess Intimal Hyperplasia under Arterial Blood Pressure

En kanin venøs interposition model efterligne revaskularisering Kirurgi ved hjælp af vene transplantater til at vurdere intimal hyperplasi under arteriel blodtryk

Although vein grafts have been commonly used as autologous grafts in revascularization surgeries for ischemic diseases, the long-term patency remains poor ...