Name: hemocompatibility testing of blood-contacting implants in a flow loop model mimicking human blood flow
Uploaded: 2020-03-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow at JoVE.com

Voor de uitvoering van scanning elektronenmicroscopie bedanken we Ernst Schweizer van de sectie Medical Materials Science and Technology van het Universitair Ziekenhuis Tuebingen. Het onderzoek werd ondersteund door het Ministerie van Onderwijs, Jeugd en Sport van de CR binnen National Sustainability Program II (Project BIOCEV-FAR LQ1604) en door Czech Science Foundation project Nr. 18-01163S.

De bloedafnameprocedure werd goedgekeurd door de ethische commissie van de medische faculteit van de Universiteit van Tuebingen (projectidentificatiecode: 270/2010BO1). Alle onderwerpen verstrekt schriftelijke, geïnformeerde toestemming voor opname voor deelname.
1. Voorbereiding van heparin-loaded Monovettes
<ol><li>Meng de onverdunde heparine (5.000 IU/mL) met natriumchloride (NaCl, 0,9%) oplossing en bereiden een oplossing met een resulterende concentratie van 15 IE/mL heparine.</li>
	<l...

<ol>
	<li>ISO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological evaluation of medical devices. , (2002).</li><li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Contacting+Biomaterials:+In+Vitro+Evaluation+of+the+Hemocompatibility.">Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).</li><li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+contamination:+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies.">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).</li><li>Cattaneo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigation+of+chemical+properties+and+biocompatibility+of+neurovascular+braided+implants.">In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).</li><li>Stang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocompatibility+testing+according+to+ISO+10993-4:+discrimination+between+pyrogen-+and+device-induced+hemostatic+activation.">Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation.</a> Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).</li><li>van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacles+in+haemocompatibility+testing.">Obstacles in haemocompatibility testing.</a> Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).</li><li>Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+blood+flow+model+with+physiological+wall+shear+stress+for+hemocompatibility+testing-An+example+of+coronary+stent+testing.">In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing.</a> Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).</li><li>Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hemocompatibility+testing:+The+importance+of+fresh+blood.">In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood.</a> Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).</li><li>Kaplan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-thrombogenic+fibrin-heparin+coating+promotes+in+vitro+endothelialization.">Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).</li><li>. SEM Imaging of Biological Samples Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples">https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples</a> (2019)</li><li>Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hemocompatibility+and+vascular+endothelial+cell+functionality+on+titania+nanostructures+under+static+and+dynamic+conditions+for+improved+coronary+stenting+applications.">In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications.</a> Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).</li><li>Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+evaluation+of+novel+blood+incubation+systems+for+in+vitro+hemocompatibility+assessment+of+planar+solid+surfaces.">Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces.</a> The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).</li><li>Sanak, M., Jakie&#322;a, B., W&#281;grzyn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+hemocompatibility+of+materials+with+arterial+blood+flow+by+platelet+functional+tests.">Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests.</a> Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).</li><li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocompatibility+evaluation+of+different+silver+nanoparticle+concentrations+employing+a+modified+Chandler-loop+in+vitro+assay+on+human+blood.">Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood.</a> Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).</li><li>Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+shear+rate+on+the+adhesion/activation+of+human+platelets+in+flow+through+a+closed-loop+polymeric+tubular+system.">The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).</li><li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers-a+practical+guide.">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide.</a> Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+vitro+hemocompatibility+testing-improving+the+signal+to+noise+ratio.">Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio.</a> Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, 549-552 (2012).</li><li>Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+diagnostic+value+of+leukocyte+and+platelet+accumulations+around+"air+bubbles"+in+blood+after+venous+air+embolism.">Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism.</a> International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).</li><li>Miller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+initial+period+of+protein+adsorption+by+dynamic+surface+tension+measurements+using+different+drop+techniques.">Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).</li><li>van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+modified+chandler,+roller+pump,+and+ball+valve+circulation+models+for+in+vitro+testing+in+high+blood+flow+conditions:+application+in+thrombogenicity+testing+of+different+materials+for+vascular+applications.">Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications.</a> International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).</li><li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+the+thrombogenicity+and+endothelialization+of+bare+metal+and+surface-coated+neurovascular+stents.">Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents.</a> AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).</li><li>Monnink, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon-carbide+coated+coronary+stents+have+low+platelet+and+leukocyte+adhesion+during+platelet+activation.">Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation.</a> Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).</li><li>Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilink+stent+promotes+less+platelet+and+leukocyte+adhesion+than+a+traditional+stainless+steel+stent:+an+in+vitro+experimental+study.">Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study.</a> Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).</li><li>Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+haemodialysis+membrane+biocompatibility+by+parallel+assessment+in+an+ex+vivo+model+in+healthy+volunteers.">Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).</li><li>Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+model+for+studying+the+interactions+between+human+whole+blood+and+endothelium.">A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).</li></ol>

Het gepresenteerde protocol beschrijft een uitgebreide en betrouwbare methode voor het hemocompatibiliteitsonderzoek van bloedcontactimplantaten overeenkomstig ISO 10993-4 in een schuifstroommodel dat de menselijke bloedstroom imiteert. Deze studie is gebaseerd op het testen van lasergesneden neurovasculaire implantaten, maar kan worden uitgevoerd met een verscheidenheid aan monsters. De resultaten tonen aan dat deze methode de brede analyse van verschillende parameters mogelijk maakt, zoals het aantal bloedcellen, preva...

De in vivo toepassing van implantaten en biomaterialen, die interageren met menselijk bloed, vereist intensieve preklinische tests gericht op het onderzoek van verschillende markers van het hemostatisch systeem. De Internationale Organisatie voor Normalisatie 10993-4 (ISO 10993-4) specificeert de centrale principes voor de evaluatie van bloedcontactapparatuur (d.w.z. stents en vasculaire grafts) en beschouwt het apparaatontwerp, klinisch nut en benodigde materialen1.
Menselijk bloed is een vloeistof die verschillende plasma-eiwitten en cellen bevat, waaronder leukocyten (witte bloedcellen [WBC's]), erytrocyten (rode bloedcellen [RBCs]), en bloedplaatjes, die complexe functies in het menselijk lichaam uitvoeren2. Het directe contact van vreemde materialen met bloed kan nadelige effecten veroorzaken, zoals activering van het immuunsysteem of stollingssysteem, wat kan leiden tot ontsteking of trombotische complicaties en ernstige problemen na implantatie3,4,5. Daarom biedt in vitro hemocompatibiliteitsvalidatie een mogelijkheid voorafgaand aan de implantatie om eventuele hematologische complicaties op te sporen en uit te sluiten die kunnen worden veroorzaakt bij contact van het bloed met een vreemd oppervlak6.
Het gepresenteerde stroomlusmodel werd opgericht om de hemocompatibiliteit van neurovasculaire stents en soortgelijke apparaten te beoordelen door een stroomsnelheid van 150 mL/min in buizen (diameter van 3,2 mm) aan te passen om cerebrale stroomomstandigheden en slagaderdiameters na te bootsen2,7. Naast de behoefte aan een optimaal in vitro model, is de bron van bloed een belangrijke factor bij het verkrijgen van betrouwbare en ongewijzigde resultaten bij het analyseren van hemocompatibiliteit van een biomateriaal8. Het verzamelde bloed moet onmiddellijk na de bemonstering worden gebruikt om veranderingen veroorzaakt door langdurige opslag te voorkomen. In het algemeen moet een zachte verzameling bloed zonder stasis met behulp van een 21 G naald worden uitgevoerd om de vooractivering van bloedplaatjes en de stollingscascade tijdens het tekenen van bloed te minimaliseren. Bovendien, donor uitsluiting criteria omvatten degenen die roken, zwanger zijn, zijn in een slechte staat van gezondheid, of hebben orale anticonceptiva of pijnstillers genomen tijdens de voorgaande 14 dagen.
Deze studie beschrijft een in vitro model voor de uitgebreide hemocompatibiliteittesten van stentimplantaten onder stromingsomstandigheden. Bij het vergelijken van ongecoate stents met fibrine-heparine, weerspiegelen de resultaten van de uitgebreide hemocompatibiliteitstests een verbeterde hemocompatibiliteit van de met fibrine-heparine gecoate stents9. Daarentegen veroorzaken de ongecoate stents activering van de stollingscascade, zoals blijkt uit een toename van thombin-antitrombine III (TAT) concentraties en verlies van bloedplaatjesnummers als gevolg van de hechting van bloedplaatjes aan het stentoppervlak. Over het algemeen wordt aanbevolen om dit hemocompatibiliteitsmodel als preklinische test te integreren om eventuele nadelige effecten op het hemostatische systeem te detecteren die door het apparaat worden veroorzaakt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>aqua ad iniectabilia</td>
			<td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany</td>
			<td>1088813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-TG ELISA</td>
			<td>Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany</td>
			<td>00950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotana 460 R</td>
			<td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrat monovettes (1.4 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>6,16,68,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAD monovettes (2.7 mL)</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>367562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA monovettes (1.2 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>6,16,62,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol p.A. (1000 mL)</td>
			<td>AppliChem, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1,31,08,61,611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25 % in water)</td>
			<td>SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany</td>
			<td>23114.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin coating for tubes</td>
			<td>Ension, Pittsburgh, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL)</td>
			<td>LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany</td>
			<td>PZN 15261203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate Reader Mithras LB 940</td>
			<td>Berthold, Bad Wildbad, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,9%</td>
			<td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany</td>
			<td>1312813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral monovettes (9 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>2,10,63,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump ISM444B</td>
			<td>Cole Parmer, Wertheim, Germany</td>
			<td>3475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3124000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic container (100 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>7,55,62,300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMN-Elastase ELISA</td>
			<td>Demeditec Diagnostics, Kiel Germany</td>
			<td>DEH3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride tube</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>30123328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neurovascular laser-cut implants</td>
			<td>Acandis GmbH, Pforzheim</td>
			<td>01-0011x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC5b-9 ELISA</td>
			<td>TECOmedical, Buende, Germany</td>
			<td>A029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>Cambridge Instruments, Cambridge, UK</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape (96 well plate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>15036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10/12 mL Norm-Ject</td>
			<td>Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>10080010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAT micro kit</td>
			<td>Siemens Healthcare, Marburg, Germany</td>
			<td>OWMG15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath Type 1083</td>
			<td>Gesellschaft f&#252;r Labortechnik, Burgwedel, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemocompatibility testing of blood-contacting implants in a flow loop model mimicking human blood flow

Het toenemende gebruik van medische hulpmiddelen (bijvoorbeeld vaattransplantaties, stents en hartkatheters) voor tijdelijke of permanente doeleinden die in de bloedsomloop van het lichaam achterblijven, vereist een betrouwbare en multiparametrische aanpak die de mogelijke hematologische complicaties door deze apparaten evalueert (d.w.z. activering en vernietiging van bloedbestanddelen). Uitgebreide in vitro hemocompatibiliteitstests van bloedcontactimplantaten is de eerste stap naar een succesvolle implementatie in vivo. Daarom is uitgebreide analyse volgens de International Organization for Standardization 10993-4 (ISO 10993-4) verplicht voorafgaand aan de klinische toepassing. De gepresenteerde stroomlus beschrijft een gevoelig model om de hemostatische prestaties van stents te analyseren (in dit geval neurovasculair) en bijwerkingen te onthullen. Het gebruik van vers menselijk volbloed en zachte bloedafname zijn essentieel om de preactivering van bloed te voorkomen. Het bloed wordt geperfundeerd door een gehepariniseerde slang die het testmonster bevat met behulp van een peristaltische pomp met een snelheid van 150 mL/min bij 37 °C gedurende 60 min. Voor en na perfusie, hematologische markers (d.w.z. het aantal bloedcellen, hemoglobine, hematocriet en plasmatische markers) die de activering van leukocyten (polymorfoomaat [PMN]-elastase), bloedplaatjes (β-tromboglobine [β-TG]), het stollingssysteem (thombin-antithrombine III [TAT]) en de complementcascade (SC5b-9) worden geanalyseerd. Tot slot presenteren we een essentieel en betrouwbaar model voor uitgebreide hemocompatibiliteitstests van stents en andere bloedcontactapparatuur voorafgaand aan de klinische toepassing.

Kort samengevat, menselijk volbloed werd verzameld in heparine-geladen monovettes vervolgens samengevoegd en gebruikt om de basislijn niveaus van cel tellingen evenals plasmatische hemocompatibiliteit markers te evalueren.
Vervolgens werd de slang met de neurovasculaire implantaatmonsters gevuld en werd het bloed gedurende 60 min geperfundeerd bij 150 mL/min en 37 °C met behulp van een peristaltische pomp. Ook hier werd het aantal cellen in alle groepen geanalyseerd en werden de plasmamonster...

Watch this Scientific Journal Video about Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow at JoVE.com

Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow

Dit protocol beschrijft een uitgebreide hemocompatibiliteitsevaluatie van bloedcontactapparatuur met behulp van lasergesneden neurovasculaire implantaten. Een flow loop model met vers, gehepariniseerd menselijk bloed wordt toegepast om de bloedstroom na te bootsen. Na perfusie worden verschillende hematologische markers geanalyseerd en vergeleken met de waarden die direct na de bloedafname zijn opgedaan voor hemocompatibiliteitsevaluatie van de geteste apparaten.

Hemocompatibiliteittesten van bloedcontactimplantaten in een Flow Loop-model dat menselijke bloedstroom nabootst

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the ...

Dit protocol presenteert een model voor het hemocompatibiliteitsonderzoek van bloedcontactapparaten volgens de richtlijnen van de International Standard Organization. Het model is ideaal voor het nabootsen van de fysiologische omstandigheden die overeenkomen met het implantaat, omdat de lage achtergrond voor trombotische gebeurtenissen en de lage concentratie van antistollingsmiddelen een brede analyse van de bloedparameter mogelijk maken. Deze methode is ideaal voor biomaterieel onderzoek, omdat het een eenvoudige manier biedt om hemocompatibiliteit te evalueren.Bovendien kan het worden gebruikt voor preklinische studies. Voor heparinebelasting mengt u eerst 5.000 internationale eenheden onverdunde heparine met 0,9% natriumchloride om een 15 internationale eenheden per milliliter heparineconcentratie te verkrijgen. Voeg vervolgens 900 microliter van de verdunde heparineoplossing toe aan drie neutrale monovettes en drie gereserveerde monovetten per donor en bewaar de met heparine geladen monovettes op vier graden Celsius.30 minuten voor de bloedmonsterverzameling, plaats de monovettes op kamertemperatuur. Wanneer de monovetten zijn opgewarmd, verzamel dan negen milliliter bloed in elk van de drie monovetten per donor voordat ze alle 27 milliliter bloed van elke donor in één plastic container bundelen. Om de stroomlus voor te bereiden, laadt ten minste één buis per aandoening met het neurovasculaire lasergesneden implantaat van belang en plaatst u één uiteinde van elke buis in een reservoir gevuld met 0,9% natriumchloride.Plaats een ongeladen buis in het reservoir en sluit alle buizen aan op de pompkop. Steek vervolgens het andere uiteinde van elke buis in een meetcilinder en pas de instellingen van de peristaltische pomp aan op een stroomsnelheid van 150 milliliter per minuut met behulp van een timer tijdens het controleren van het vulniveau in de meetcilinder. Voor hemocompatibiliteitstests gebruikt u een spuit van 12 milliliter om elke buis te vullen met zes milliliter bloed.Na het vormen van een circuit, gebruik maken van een 0,5 centimeter lengte van siliconen verbinden buizen om de buizen goed te sluiten en plaats de buizen in een 37 graden Celsius waterbad. Start dan de 60 minuten buis. Voor de analyse van het gehele bloedtelling voegt u 1,2 milliliter niet-geperfundeerd bloed of 1,2 milliliter bloed van elke buis na de perfusie toe in afzonderlijke monovetten die EDTA bevatten.Draai de monovettes vijf keer voorzichtig om en laad de flesjes in een bloedanalyse voor een bloedtellingsanalyse van elk monster. Aan het einde van de analyse, plaats de monovettes op ijs voor 15-60 minuten. Voor citraat plasma verzameling, vul citraat-bevattende monovettes met 1,4 milliliter niet-geperfundeerd of geperfuseerd bloed en zorgvuldig omkeren elke monovette vijf keer.Scheid het plasma door centrifugatie en breng drie 250 microliter aliquots van de plasmafractie over in individuele 1,5 milliliter reactiebuizen. Bevries vervolgens de plasmamonsters in vloeibare stikstof en bewaar ze op min 20 graden Celsius tot hun analyse. Voor EDTA plasma verzameling, na de vier graden Celsius incubatie na de bloedtelling meting, scheiden het plasma door centrifugatie en breng drie 250 microliter aliquots van de plasmafractie in individuele 1,5 milliliter reactiebuizen.Bevries vervolgens de plasmamonsters in vloeibare stikstof voor min 20 graden Celsius opslag. Voor CTAD plasma collectie, vul CTAD-bevattende monovettes met 2,7 milliliter vers getrokken of geperfundeerd bloed en zorgvuldig omkeren de buizen vijf keer. Leg de monovetten 15-60 minuten op ijs voordat u het plasma door centrifugatie verzamelt.Breng 700 microliter van elke middelste plasmafractie over in individuele 1,5 milliliter reactiebuizen en centrifugeer de gevulde reactiebuizen opnieuw. Breng vervolgens twee 100 microliter aliquots van de middelste fractie over in individuele 1,5 milliliter reactiebuizen en vries de buizen in vloeibare stikstof voor hun opslag bij min 20 graden Celsius. Om de TAT-niveaus in de citraatplasmamonsters te meten, voeg u 50 microliter ELISA-monsterbuffer toe in elke put van een 96-bron vlakke bodemplaat en 50 microliters plasmanorm, plasmacontrole en onverdunde plasmamonsters in duplicaten aan de juiste putten van de plaat.Na het afdichten van de plaat, incubeer de monsters op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten met zachte schudden. Aan het einde van de incubatie, was de plaat drie keer met 300 microliters wasoplossing per goed voordat u 100 microliters peroxidase geconjugateerd anti-menselijke TAT-antilichaam aan elke put toevoegt. Na een incubatie van 15 minuten bij 37 graden Celsius met schudden, was de plaat drie keer met 300 microliters verse wasoplossing per put.Voeg na de laatste wasbeurt 100 microliter vers bereide chromogene-oplossing per put toe voor een incubatie van 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg aan het einde van de incubatie 100 microliters stopoplossing toe aan elke put en lees de optische dichtheid op een fotometer op 490 tot 500 nanometer met behulp van de standaardcurvegegevens als trendlijn voor het berekenen van de TAT-concentratie van elk monster. Om de implantaten voor te bereiden op het scannen van elektronenmicroscopie, gebruikt u tangen om de implantaten uit de buizen te verwijderen en elk implantaat kort drie keer te spoelen in verse 0,9% natriumchloride per wasbeurt.Bewaar na de laatste wasbeurt de implantaten in afzonderlijke containers van 2%glutaraldehyde in PBS zonder calcium en magnesium 's nachts bij vier graden Celsius. De volgende ochtend, incubeer de implantaten in individuele containers van PBS gedurende 10 minuten voor het dehydrateren van de implantaten in opgaande concentraties van ethanol gedurende 10 minuten per concentratie zoals aangegeven. Direct na bloedafname en perfusie worden geen veranderingen gedetecteerd in het aantal witte of rode bloedcellen of in de hematocrietwaarden.Er wordt echter een afname van het hemoglobinegehalte gedetecteerd na perfusie in het stroomlussysteem. Er wordt ook een afname van bloedplaatjes waargenomen, die wordt verhoogd wanneer er een ongecoate stent aanwezig is in de slang. Met name wordt dit verlies verminderd wanneer het bloed wordt geïncubeerd met een fibrin-heparine-gecoate stent.De TAT-complexe concentratie wordt licht verhoogd in reactie op de perfusie. Wanneer een kale metalen stent wordt toegevoegd, echter, een aanzienlijke toename van de TAT wordt gedetecteerd die wijst op een diepgaande activering van het stollingssysteem. Het gebruik van een fibrin-heparine-gecoate stent voorkomt deze activering.Perfusie leidt tot een verhoogde activering van de complimentcascade die niet wordt beïnvloed door de aanwezigheid van ongecoate of fibrin-heparine-gecoate stents. Op dezelfde manier worden neutrofiele granulocyten geactiveerd, zoals blijkt uit de kwantificering van polymorfucleaire neutrofiele elastaseniveaus. Visualisatie door het scannen van elektronenmicroscopie blijkt dat de aanwezigheid van een dicht netwerk van bloedcellen en eiwitten op het oppervlak van de ongecoate stent na perfusie die niet wordt waargenomen op de fibrin-heparine-gecoate stents.Het is van het grootste belang om te bevestigen dat het bloed voldoet aan de inclusiecriteria voor het verkrijgen van monsters en om vers getrokken bloed zo snel mogelijk te gebruiken. Menselijk bloed kan bloedoren virussen en andere middelen bevatten en draagt het risico van infectie, dus zorg ervoor dat u altijd de juiste BESCHERMINGsmiddelen draagt bij het hanteren van de monsters.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Visualisatie en analyse van de bloedstroom en zuurstofverbruik in de lever microcirculatie: Toepassing op een acute hepatitis Model

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Intravitale Video Microscopie Metingen van retinale bloedstroom in Muizen

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Geautomatiseerde Meting van Microcirculatoire snelheid van de bloedstroom in longmetastasen van Rats

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Collectie, Isolatie, en Flowcytometrische analyse van de menselijke Endocervicale Monsters

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Echografie gebaseerde beoordeling van coronaire Flow en Coronaire Flow Reserve Met behulp van de druk overbelasting Model in Muizen

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Karakterisering van Immune cellen in menselijke adipeus weefsel met behulp van Stroom Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Gelijktijdige stroming cytometrische karakterisering van meerdere celtypen opgehaald uit muis hersenen/ruggenmerg via verschillende homogenisatie methoden

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

Evaluatie van cerebrale bloedstroom autoregulatie in de rat met behulp van laser doppler flowmetrie

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

A Rabbit Venous Interposition Model Mimicking Revascularization Surgery using Vein Grafts to Assess Intimal Hyperplasia under Arterial Blood Pressure

Een konijn veneuze interposition model nabootsen revascularisatie chirurgie met behulp van ader grafts te beoordelen Intimal Hyperplasie onder arteriële bloeddruk

Although vein grafts have been commonly used as autologous grafts in revascularization surgeries for ischemic diseases, the long-term patency remains poor ...