Name: hemocompatibility testing of blood-contacting implants in a flow loop model mimicking human blood flow
Uploaded: 2020-03-05T14:00:00
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Pour la performance de la microscopie électronique à balayage, nous remercions Ernst Schweizer de la section des sciences et de la technologie des matériaux médicaux de l’hôpital universitaire de Tuebingen. La recherche a été soutenue par le ministère de l’Éducation, de la Jeunesse et des Sports du CR dans le cadre du Programme national de développement durable II (Projet BIOCEV-FAR LQ1604) et par le projet no 18-01163S de la Fondation scientifique tchèque.

La procédure d’échantillonnage du sang a été approuvée par le Comité d’éthique de la faculté de médecine de l’Université de Tuebingen (code d’identification du projet: 270/2010BO1). Tous les sujets ont fourni un consentement écrit et éclairé pour l’inclusion avant la participation.
1. Préparation des Monovettes chargées d’Héparine
<ol><li>Mélanger l’héparine non diluée (5 000 UI/ml) avec du chlorure de sodium (NaCl, 0,9 %) solution et préparer une solution a...

<ol>
	<li>ISO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological evaluation of medical devices. , (2002).</li><li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Contacting+Biomaterials:+In+Vitro+Evaluation+of+the+Hemocompatibility.">Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).</li><li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+contamination:+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies.">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).</li><li>Cattaneo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigation+of+chemical+properties+and+biocompatibility+of+neurovascular+braided+implants.">In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).</li><li>Stang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocompatibility+testing+according+to+ISO+10993-4:+discrimination+between+pyrogen-+and+device-induced+hemostatic+activation.">Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation.</a> Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).</li><li>van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacles+in+haemocompatibility+testing.">Obstacles in haemocompatibility testing.</a> Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).</li><li>Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+blood+flow+model+with+physiological+wall+shear+stress+for+hemocompatibility+testing-An+example+of+coronary+stent+testing.">In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing.</a> Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).</li><li>Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hemocompatibility+testing:+The+importance+of+fresh+blood.">In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood.</a> Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).</li><li>Kaplan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-thrombogenic+fibrin-heparin+coating+promotes+in+vitro+endothelialization.">Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).</li><li>. SEM Imaging of Biological Samples Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples">https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples</a> (2019)</li><li>Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hemocompatibility+and+vascular+endothelial+cell+functionality+on+titania+nanostructures+under+static+and+dynamic+conditions+for+improved+coronary+stenting+applications.">In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications.</a> Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).</li><li>Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+evaluation+of+novel+blood+incubation+systems+for+in+vitro+hemocompatibility+assessment+of+planar+solid+surfaces.">Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces.</a> The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).</li><li>Sanak, M., Jakie&#322;a, B., W&#281;grzyn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+hemocompatibility+of+materials+with+arterial+blood+flow+by+platelet+functional+tests.">Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests.</a> Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).</li><li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocompatibility+evaluation+of+different+silver+nanoparticle+concentrations+employing+a+modified+Chandler-loop+in+vitro+assay+on+human+blood.">Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood.</a> Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).</li><li>Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+shear+rate+on+the+adhesion/activation+of+human+platelets+in+flow+through+a+closed-loop+polymeric+tubular+system.">The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).</li><li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers-a+practical+guide.">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide.</a> Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+vitro+hemocompatibility+testing-improving+the+signal+to+noise+ratio.">Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio.</a> Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, 549-552 (2012).</li><li>Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+diagnostic+value+of+leukocyte+and+platelet+accumulations+around+"air+bubbles"+in+blood+after+venous+air+embolism.">Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism.</a> International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).</li><li>Miller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+initial+period+of+protein+adsorption+by+dynamic+surface+tension+measurements+using+different+drop+techniques.">Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).</li><li>van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+modified+chandler,+roller+pump,+and+ball+valve+circulation+models+for+in+vitro+testing+in+high+blood+flow+conditions:+application+in+thrombogenicity+testing+of+different+materials+for+vascular+applications.">Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications.</a> International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).</li><li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+the+thrombogenicity+and+endothelialization+of+bare+metal+and+surface-coated+neurovascular+stents.">Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents.</a> AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).</li><li>Monnink, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon-carbide+coated+coronary+stents+have+low+platelet+and+leukocyte+adhesion+during+platelet+activation.">Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation.</a> Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).</li><li>Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilink+stent+promotes+less+platelet+and+leukocyte+adhesion+than+a+traditional+stainless+steel+stent:+an+in+vitro+experimental+study.">Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study.</a> Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).</li><li>Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+haemodialysis+membrane+biocompatibility+by+parallel+assessment+in+an+ex+vivo+model+in+healthy+volunteers.">Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).</li><li>Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+model+for+studying+the+interactions+between+human+whole+blood+and+endothelium.">A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).</li></ol>

Le protocole présenté décrit une méthode complète et fiable pour l’essai d’hémocompatibilité des implants de contact sanguin conformément à ISO 10993-4 dans un modèle de débit de cisaillement imitant le flux sanguin humain. Cette étude est basée sur l’essai d’implants neurovasculaires découpés au laser, mais peut être réalisée avec une variété d’échantillons. Les résultats démontrent que cette méthode permet l’analyse large de divers paramètres tels que la numération des cellules san...

L’application in vivo d’implants et de biomatériaux, qui interagissent avec le sang humain, nécessite des tests précliniques intenses axés sur l’étude de divers marqueurs du système hémostatique. L’Organisation internationale pour la normalisation 10993-4 (ISO 10993-4) précise les principes centraux pour l’évaluation des dispositifs de contact sanguin (c.-à-d. les endoprothèses et les greffes vasculaires) et considère la conception de l’appareil, l’utilité clinique et les matériaux nécessaires1.
Le sang humain est un liquide qui contient diverses protéines et cellules plasmatiques, y compris les leucocytes (globules blancs [WBC]), les érythrocytes (globules rouges [RBC]), et les plaquettes, qui effectuent des fonctions complexes dans le corps humain2. Le contact direct des matériaux étrangers avec le sang peut causer des effets indésirables, tels que l’activation du système immunitaire ou de coagulation, qui peut conduire à une inflammation ou des complications thrombotiques et des problèmes graves après l’implantation3,4,5. Parconséquent, la validation d’hémocompatibilité in vitro offre une occasion avant l’implantation de détecter et d’exclure toutes les complications hématologiques qui peuvent être induites au contact du sang avec une surface étrangère6.
Le modèle présenté de boucle d’écoulement a été établi pour évaluer l’hémocompatibilité des endoprothèses neurovasculaires et des dispositifs similaires en appliquant un débit de 150 ml/min dans les tubes (diamètre de 3,2 mm) pour imiter les conditions de débit cérébral et les diamètres de l’artère2,7. Outre la nécessité d’un modèle in vitro optimal, la source de sang est un facteur important dans l’obtention de résultats fiables et inchangés lors de l’analyse de l’hémocompatibilité d’un biomatériau8. Le sang recueilli doit être utilisé immédiatement après l’échantillonnage afin d’éviter les changements causés par un stockage prolongé. En général, une douce collecte de sang sans stase à l’aide d’une aiguille de 21 G devrait être effectuée pour minimiser la préactivation des plaquettes et la cascade de coagulation pendant le prélèvement sanguin. En outre, les critères d’exclusion des donneurs comprennent ceux qui fument, sont enceintes, sont en mauvais état de santé ou ont pris des contraceptifs oraux ou des analgésiques au cours des 14 jours précédents.
Cette étude décrit un modèle in vitro pour les tests d’hémocompatibilité étendu des implants endoprothèses dans des conditions d’écoulement. En comparant les endoprothèses non couchées aux endoprothèses enduites de fibrine-heparin, les résultats des tests complets d’hémocompatibilité reflètent une amélioration de l’hémocompatibilité des endoprothèses enduites de fibrine-héparine9. En revanche, les endoprothèses non enduites induisent l’activation de la cascade de coagulation, comme en témoigne l’augmentation des concentrations de thombin-antithrombin III (TAT) et la perte du nombre de plaquettes sanguines due à l’adhérence des plaquettes à la surface en endoprothèse. Dans l’ensemble, l’intégration de ce modèle d’hémocompatibilité comme un test préclinique est recommandée pour détecter tout effet indésirable sur le système hémostatique qui sont causés par l’appareil.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>aqua ad iniectabilia</td>
			<td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany</td>
			<td>1088813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-TG ELISA</td>
			<td>Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany</td>
			<td>00950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotana 460 R</td>
			<td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrat monovettes (1.4 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>6,16,68,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAD monovettes (2.7 mL)</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>367562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA monovettes (1.2 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>6,16,62,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol p.A. (1000 mL)</td>
			<td>AppliChem, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1,31,08,61,611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25 % in water)</td>
			<td>SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany</td>
			<td>23114.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin coating for tubes</td>
			<td>Ension, Pittsburgh, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL)</td>
			<td>LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany</td>
			<td>PZN 15261203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate Reader Mithras LB 940</td>
			<td>Berthold, Bad Wildbad, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,9%</td>
			<td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany</td>
			<td>1312813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral monovettes (9 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>2,10,63,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump ISM444B</td>
			<td>Cole Parmer, Wertheim, Germany</td>
			<td>3475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3124000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic container (100 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>7,55,62,300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMN-Elastase ELISA</td>
			<td>Demeditec Diagnostics, Kiel Germany</td>
			<td>DEH3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride tube</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>30123328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neurovascular laser-cut implants</td>
			<td>Acandis GmbH, Pforzheim</td>
			<td>01-0011x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC5b-9 ELISA</td>
			<td>TECOmedical, Buende, Germany</td>
			<td>A029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>Cambridge Instruments, Cambridge, UK</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape (96 well plate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>15036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10/12 mL Norm-Ject</td>
			<td>Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>10080010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAT micro kit</td>
			<td>Siemens Healthcare, Marburg, Germany</td>
			<td>OWMG15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath Type 1083</td>
			<td>Gesellschaft f&#252;r Labortechnik, Burgwedel, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemocompatibility testing of blood-contacting implants in a flow loop model mimicking human blood flow

L’utilisation croissante de dispositifs médicaux (p. ex. greffes vasculaires, endoprothèses et cathéters cardiaques) à des fins temporaires ou permanentes qui demeurent dans le système circulatoire de l’organisme exige une approche fiable et multiparamétrique qui évalue les complications hématologiques possibles causées par ces dispositifs (c.-à-d. l’activation et la destruction des composants sanguins). L’essai complet d’hémocompatibilité in vitro des implants de contact sanguin est la première étape vers la mise en œuvre in vivo réussie. Par conséquent, une analyse approfondie selon l’Organisation internationale pour la normalisation 10993-4 (ISO 10993-4) est obligatoire avant l’application clinique. La boucle de débit présentée décrit un modèle sensible pour analyser les performances hémostatiques des endoprothèses (dans ce cas, neurovasculaire) et révéler des effets indésirables. L’utilisation du sang entier humain frais et l’échantillonnage doux du sang sont essentiels pour éviter la préactivation du sang. Le sang est perfusé à travers un tube héparinisé contenant le spécimen d’essai à l’aide d’une pompe périssaltique à un taux de 150 ml/min à 37 oC pendant 60 min. Avant et après la perfusion, marqueurs hématologiques (c.-à-d. la numération des cellules sanguines, l’hémoglobine, l’hématocrit et les marqueurs plasmatiques) indiquant l’activation des leucocytes (polymorphonuclear [PMN]-elastase), des plaquettes (-thromboglobuline), du système de coagulation (thombin-antithrombin III [TAT]), et de la cascade de complément (SC5b-9) sont analysées. En conclusion, nous présentons un modèle essentiel et fiable pour des tests d’hémocompatibilité étendus des endoprothèses et autres dispositifs de contact sanguin avant l’application clinique.

Brièvement résumé, le sang entier humain a été recueilli dans les monovettes héparine-chargées puis mis en commun et employé pour évaluer les niveaux de base du nombre de cellules aussi bien que les marqueurs plasmatiques d’hémocompatibilité.
Par la suite, le tube contenant les échantillons d’implant neurovasculaire a été rempli, et le sang a été perfusé pendant 60 min à 150 ml/min et 37 oC à l’aide d’une pompe périsstale. Encore une fois, le nombre de cellules a é...

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Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow

Ce protocole décrit une évaluation complète de l’hémocompatibilité des dispositifs de contact sanguin à l’aide d’implants neurovasculaires découpés au laser. Un modèle de boucle de flux avec du sang humain frais et héparinisé est appliqué pour imiter le flux sanguin. Après perfusion, divers marqueurs hématologiques sont analysés et comparés aux valeurs acquises directement après la collecte de sang pour l’évaluation d’hémocompatibilité des dispositifs testés.

Test d’hémocompatibilité des implants de contact sanguin dans un modèle de boucle de flux imitant le flux sanguin humain

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the ...

Ce protocole présente un modèle pour l’enquête sur l’hémocompatibilité des dispositifs de contact avec le sang conformément aux lignes directrices de l’Organisation internationale standard. Le modèle est idéal pour imiter les conditions physiologiques qui correspondent à l’implant puisque le faible fond pour les événements thrombotiques et la faible concentration d’anticoagulants permettent une large analyse du paramètre sanguin. Cette méthode est idéale pour la recherche sur les biomatériaux car elle fournit un moyen simple d’évaluer l’hémocompatibilité.En outre, il peut être utilisé pour des études précliniques. Pour la charge d’héparine, mélangez d’abord 5 000 unités internationales d’héparine non diluée avec du chlorure de sodium de 0,9 % pour obtenir une concentration internationale de 15 unités par millilitre d’héparine. Ensuite, ajoutez 900 microlitres de la solution d’héparine diluée à trois monovettes neutres et trois monovettes réservées par donneur et stockez les monovettes chargées d’héparine à quatre degrés Celsius.30 minutes avant la collecte de l’échantillon de sang, placer les monovettes à température ambiante. Lorsque les monovettes se sont réchauffées, recueillir neuf millilitres de sang dans chacune des trois monovettes par donneur avant de mettre en commun les 27 millilitres de sang de chaque donneur dans un seul récipient en plastique. Pour préparer la boucle d’écoulement, chargez au moins un tube par condition avec l’implant neurovasculaire découpé au laser d’intérêt et placez une extrémité de chaque tube dans un réservoir rempli de chlorure de sodium à 0,9 %.Placez un tube déchargé dans le réservoir et connectez tous les tubes à la tête de la pompe. Insérez ensuite l’autre extrémité de chaque tube dans un cylindre de mesure et ajustez les réglages de la pompe périssaltique à un débit de 150 millilitres par minuterie tout en vérifiant le niveau de remplissage dans le cylindre de mesure. Pour les tests d’hémocompatibilité, utilisez une seringue de 12 millilitres pour remplir chaque tube de six millilitres de sang.Après avoir formé un circuit, utilisez une longueur de 0,5 centimètre de tube de raccordement en silicone pour fermer les tubes étroitement et placer les tubes dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. Ensuite, commencez le tube de 60 minutes. Pour l’analyse de la numération sanguine entière, ajouter 1,2 millilitres de sang non perfusé ou 1,2 millilitres de sang de chaque tube après la perfusion dans des monovettes individuelles contenant de l’EDTA.Inversez soigneusement les monovettes cinq fois et chargez les flacons dans un analyseur de sang pour une analyse de la numémie de chaque échantillon. À la fin de l’analyse, placez les monovettes sur la glace pendant 15 à 60 minutes. Pour la collecte de plasma de citrate, remplissez les monovettes contenant du citrate de 1,4 millilitres de sang non perfusé ou perfusé et inversez soigneusement chaque monovette cinq fois.Séparez le plasma par centrifugation et transférez trois aliquots de 250 microlitres de la fraction plasmatique en tubes de réaction individuels de 1,5 millilitre. Congelez ensuite les échantillons de plasma dans de l’azote liquide et conservez-les à moins 20 degrés Celsius jusqu’à leur analyse. Pour la collecte de plasma EDTA, après l’incubation de quatre degrés Celsius après la mesure du nombre de sang, séparez le plasma par centrifugation et transférez trois aliquots de 250 microlitres de la fraction plasmatique en tubes de réaction individuels de 1,5 millilitre.Congelez ensuite les échantillons de plasma dans de l’azote liquide pour un stockage de moins 20 degrés Celsius. Pour la collecte de plasma CTAD, remplissez les monovettes contenant du CTAD de 2,7 millilitres de sang fraîchement dessiné ou perfusé et inversez soigneusement les tubes cinq fois. Placer les monovettes sur la glace pendant 15-60 minutes avant de recueillir le plasma par centrifugation.Transférer 700 microlitres de chaque fraction de plasma moyen dans des tubes de réaction individuels de 1,5 millilitre et centrifugeuses les tubes de réaction remplis à nouveau. Ensuite, transférez deux aliquots de 100 microlitres de la fraction moyenne en tubes de réaction individuels de 1,5 millilitre et congelez les tubes dans de l’azote liquide pour leur stockage à moins 20 degrés Celsius. Pour mesurer les niveaux de TAT dans les échantillons de plasma de citrate, ajoutez 50 microlitres de tampon d’échantillon ELISA dans chaque puits d’une plaque inférieure plate de 96 puits et 50 microlitres de plasma standard, de contrôle plasmatique et d’échantillons de plasma non dilués en doublons aux puits appropriés de la plaque.Après avoir scellé la plaque, incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes avec des secousses douces. À la fin de l’incubation, lavez la plaque trois fois avec 300 microlitres de solution de lavage par puits avant d’ajouter 100 microlitres d’anticorps TAT conjugués à chaque puits. Après une incubation de 15 minutes à 37 degrés Celsius avec secousses, lavez la plaque trois fois avec 300 microlitres de solution de lavage frais par puits.Après le dernier lavage, ajouter 100 microlitres de solution chromogène fraîchement préparée par puits pour une incubation de 30 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, ajouter 100 microlitres de solution d’arrêt à chaque puits et lire la densité optique sur un photomètre à 490 à 500 nanomètres en utilisant les données de courbe standard comme ligne de tendance pour calculer la concentration de TAT de chaque échantillon. Pour préparer les implants à la numérisation de la microscopie électronique, utilisez des forceps pour enlever les implants des tubes et rincer brièvement chaque implant trois fois dans du chlorure de sodium frais de 0,9 % par lavage.Après le dernier lavage, conserver les implants dans des contenants individuels de 2% de glutaraldehyde dans PBS sans calcium et magnésium pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, incuber les implants dans des contenants individuels de PBS pendant 10 minutes avant de déshydrater les implants dans des concentrations ascendantes d’éthanol pendant 10 minutes par concentration comme indiqué. Directement après la collecte de sang et la perfusion, aucun changement n’est détecté dans le nombre de globules blancs ou rouges ou dans les valeurs hématocritiques.Cependant, une diminution des niveaux d’hémoglobine est détectée après perfusion dans le système de boucle d’écoulement. On observe également une diminution du nombre de plaquettes, qui est augmentée lorsqu’un endoprocent non encolé est présent dans le tube. Notamment, cette perte est réduite lorsque le sang est incubé avec un enfilent recouvert de fibrine-héparine.La concentration complexe de TAT est légèrement augmentée en réponse à la perfusion. Toutefois, lorsqu’un stent en métal nu est ajouté, une augmentation significative du TAT est détectée, ce qui indique une activation profonde du système de coagulation. L’utilisation d’un stent enduit de fibrine-héparine empêche cette activation.La perfusion conduit à une activation accrue de la cascade de compliments qui n’est pas affectée par la présence d’endonts non enrobés ou recouverts de fibrine-héparine. De même, les granulocytes de neutrophile sont activés comme démontré par la quantification des niveaux polymorphonuclear d’elastase de neutrophile. La visualisation par microscopie électronique à balayage révèle que la présence d’un réseau dense de cellules sanguines et de protéines à la surface de l’endoprocent non encodé après perfusion qui n’est pas observée sur les endoprocents enduits de fibrine-héparine.Il est de la plus haute importance de confirmer que le sang remplit les critères d’inclusion pour l’obtention d’échantillons et d’utiliser du sang fraîchement prélevé aussi rapidement que possible. Le sang humain peut contenir des virus transmissibles par le sang et d’autres agents et comporte le risque d’infection alors assurez-vous de toujours porter des EPI appropriés lors de la manipulation des échantillons.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Visualisation et analyse du flux sanguin et la consommation d&#39;oxygène dans la microcirculation hépatique: Application à un modèle de l&#39;hépatite aiguë

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Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

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