Name: hemocompatibility testing of blood-contacting implants in a flow loop model mimicking human blood flow
Uploaded: 2020-03-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow at JoVE.com

Für die Leistungsfähigkeit der Rasterelektronenmikroskopie danken wir Ernst Schweizer von der Fachgruppe Medizinische Materialwissenschaft und -technik des Universitätsklinikums Tübingen. Die Forschung wurde vom Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der CR im Rahmen des Nationalen Nachhaltigkeitsprogramms II (Projekt BIOCEV-FAR LQ1604) und vom Projekt Nr. 18-01163S der Tschechischen Wissenschaftsstiftung unterstützt.

Das Blutentnahmeverfahren wurde von der Ethikkommission der medizinischen Fakultät der Universität Tübingen genehmigt (Projekt-Identifikationscode: 270/2010BO1). Alle Personen, die vor der Teilnahme schriftlich und in Kenntnis der Sachkenntnis zur Aufnahme einwilligt werden.
1. Herstellung von Heparin-geladenen Monovetten
<ol><li>Mischen Sie das unverdünnte Heparin (5.000 I.E./ml) mit Natriumchlorid (NaCl, 0,9%) und bereiten eine Lösung mit einer resultierenden Konzentration von 15 I.E....

<ol>
	<li>ISO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological evaluation of medical devices. , (2002).</li><li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Contacting+Biomaterials:+In+Vitro+Evaluation+of+the+Hemocompatibility.">Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).</li><li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+contamination:+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies.">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).</li><li>Cattaneo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigation+of+chemical+properties+and+biocompatibility+of+neurovascular+braided+implants.">In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).</li><li>Stang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocompatibility+testing+according+to+ISO+10993-4:+discrimination+between+pyrogen-+and+device-induced+hemostatic+activation.">Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation.</a> Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).</li><li>van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacles+in+haemocompatibility+testing.">Obstacles in haemocompatibility testing.</a> Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).</li><li>Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+blood+flow+model+with+physiological+wall+shear+stress+for+hemocompatibility+testing-An+example+of+coronary+stent+testing.">In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing.</a> Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).</li><li>Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hemocompatibility+testing:+The+importance+of+fresh+blood.">In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood.</a> Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).</li><li>Kaplan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-thrombogenic+fibrin-heparin+coating+promotes+in+vitro+endothelialization.">Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).</li><li>. SEM Imaging of Biological Samples Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples">https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples</a> (2019)</li><li>Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hemocompatibility+and+vascular+endothelial+cell+functionality+on+titania+nanostructures+under+static+and+dynamic+conditions+for+improved+coronary+stenting+applications.">In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications.</a> Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).</li><li>Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+evaluation+of+novel+blood+incubation+systems+for+in+vitro+hemocompatibility+assessment+of+planar+solid+surfaces.">Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces.</a> The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).</li><li>Sanak, M., Jakie&#322;a, B., W&#281;grzyn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+hemocompatibility+of+materials+with+arterial+blood+flow+by+platelet+functional+tests.">Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests.</a> Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).</li><li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocompatibility+evaluation+of+different+silver+nanoparticle+concentrations+employing+a+modified+Chandler-loop+in+vitro+assay+on+human+blood.">Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood.</a> Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).</li><li>Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+shear+rate+on+the+adhesion/activation+of+human+platelets+in+flow+through+a+closed-loop+polymeric+tubular+system.">The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).</li><li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers-a+practical+guide.">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide.</a> Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+vitro+hemocompatibility+testing-improving+the+signal+to+noise+ratio.">Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio.</a> Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, 549-552 (2012).</li><li>Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+diagnostic+value+of+leukocyte+and+platelet+accumulations+around+"air+bubbles"+in+blood+after+venous+air+embolism.">Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism.</a> International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).</li><li>Miller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+initial+period+of+protein+adsorption+by+dynamic+surface+tension+measurements+using+different+drop+techniques.">Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).</li><li>van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+modified+chandler,+roller+pump,+and+ball+valve+circulation+models+for+in+vitro+testing+in+high+blood+flow+conditions:+application+in+thrombogenicity+testing+of+different+materials+for+vascular+applications.">Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications.</a> International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).</li><li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+the+thrombogenicity+and+endothelialization+of+bare+metal+and+surface-coated+neurovascular+stents.">Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents.</a> AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).</li><li>Monnink, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon-carbide+coated+coronary+stents+have+low+platelet+and+leukocyte+adhesion+during+platelet+activation.">Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation.</a> Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).</li><li>Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilink+stent+promotes+less+platelet+and+leukocyte+adhesion+than+a+traditional+stainless+steel+stent:+an+in+vitro+experimental+study.">Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study.</a> Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).</li><li>Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+haemodialysis+membrane+biocompatibility+by+parallel+assessment+in+an+ex+vivo+model+in+healthy+volunteers.">Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).</li><li>Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+model+for+studying+the+interactions+between+human+whole+blood+and+endothelium.">A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).</li></ol>

Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine umfassende und zuverlässige Methode zur Hämokompatibilitätsprüfung von blutverstättlichen Implantaten gemäß ISO 10993-4 in einem Scherflussmodell, das den menschlichen Blutfluss imitiert. Diese Studie basiert auf der Prüfung von lasergeschnittenen neurovaskulären Implantaten, kann aber mit einer Vielzahl von Proben durchgeführt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode die breite Analyse verschiedener Parameter wie die Blutzellzahl, die Prävalenz mehrerer Häm...

Die In-vivo-Anwendung von Implantaten und Biomaterialien, die mit menschlichem Blut interagieren, erfordert intensive präklinische Tests, die sich auf die Untersuchung verschiedener Marker des hämostatischen Systems konzentrieren. Die Internationale Organisation für Normung 10993-4 (ISO 10993-4) legt die zentralen Grundsätze für die Bewertung von blutverfälschten Geräten (d. h. Stents und Gefäßtransplantaten) fest und berücksichtigt das Gerätedesign, den klinischen Nutzen und die benötigten Materialien1.
Menschliches Blut ist eine Flüssigkeit, die verschiedene Plasmaproteine und Zellen enthält, einschließlich Leukozyten (weiße Blutkörperchen [WBCs]), Erythrozyten (rote Blutkörperchen [RBCs]) und Blutplättchen, die komplexe Funktionen im menschlichen Körper ausführen2. Der direkte Kontakt von Fremdstoffen mit Blut kann schädliche Effekte verursachen, wie z. B. die Aktivierung des Immunsystems oder des Gerinnungssystems, die nach derImplantationzu Entzündungen oder thrombotischen Komplikationen und schwerwiegenden Problemen nach der Implantation 3,4,5führen können. Daher bietet die In-vitro-Hämokompatibilitätsvalidierung eine Möglichkeit vor der Implantation, hämatologische Komplikationen zu erkennen und auszuschließen, die beim Kontakt des Blutes mit einer fremden Oberfläche induziert werden können6.
Das vorgestellte Durchflussschleifenmodell wurde erstellt, um die Hämokompatibilität von neurovaskulären Stents und ähnlichen Geräten zu bewerten, indem eine Durchflussrate von 150 ml/min in Schläuchen (Durchmesser 3,2 mm) angewendet wurde, um die Bedingungen des Zerebralpareseflusses und der Arteriendurchmesser2,7nachzuahmen. Neben der Notwendigkeit eines optimalen In-vitro-Modells ist die Blutquelle ein wichtiger Faktor, um bei der Analyse der Hämokompatibilität eines Biomaterials8zuverlässige und unveränderte Ergebnisse zu erzielen. Das entnommene Blut sollte unmittelbar nach der Probenahme verwendet werden, um Veränderungen zu verhindern, die durch längere Lagerung verursacht werden. Im Allgemeinen sollte eine sanfte Blutentnahme ohne Stase mit einer 21 G Nadel durchgeführt werden, um die Voraktivierung von Blutplättchen und die Gerinnungskaskaskade während der Blutentnahme zu minimieren. Darüber hinaus umfassen die Ausschlusskriterien für Spender diejenigen, die rauchen, schwanger sind, sich in einem schlechten Gesundheitszustand befinden oder in den letzten 14 Tagen orale Kontrazeptiva oder Schmerzmittel eingenommen haben.
Diese Studie beschreibt ein In-vitro-Modell für die umfangreiche Hämokompatibilitätsprüfung von Stentimplantaten unter Strömungsbedingungen. Beim Vergleich unbeschichteter mit fibrin-heparinbeschichteten Stents spiegeln die Ergebnisse der umfassenden Hämokompatibilitätstests eine verbesserte Hämokompatibilität der fibrin-heparinbeschichteten Stents9wider. Im Gegensatz dazu induzieren die unbeschichteten Stents die Aktivierung der Gerinnungskaskade, wie eine Erhöhung der Thombin-Antithrombin-III-Konzentrationen (TAT) und der Verlust von Blutplättchenzahlen aufgrund der Adhäsion der Blutplättchen an der Stentoberfläche zeigen. Insgesamt wird empfohlen, dieses Hämokompatibilitätsmodell als präklinischen Test zu integrieren, um schädliche Auswirkungen auf das hämostatische System zu erkennen, die durch das Gerät verursacht werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>aqua ad iniectabilia</td>
			<td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany</td>
			<td>1088813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-TG ELISA</td>
			<td>Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany</td>
			<td>00950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotana 460 R</td>
			<td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrat monovettes (1.4 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>6,16,68,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAD monovettes (2.7 mL)</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>367562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA monovettes (1.2 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>6,16,62,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol p.A. (1000 mL)</td>
			<td>AppliChem, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1,31,08,61,611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25 % in water)</td>
			<td>SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany</td>
			<td>23114.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin coating for tubes</td>
			<td>Ension, Pittsburgh, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL)</td>
			<td>LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany</td>
			<td>PZN 15261203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate Reader Mithras LB 940</td>
			<td>Berthold, Bad Wildbad, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,9%</td>
			<td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany</td>
			<td>1312813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral monovettes (9 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>2,10,63,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump ISM444B</td>
			<td>Cole Parmer, Wertheim, Germany</td>
			<td>3475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3124000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic container (100 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>7,55,62,300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMN-Elastase ELISA</td>
			<td>Demeditec Diagnostics, Kiel Germany</td>
			<td>DEH3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride tube</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>30123328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neurovascular laser-cut implants</td>
			<td>Acandis GmbH, Pforzheim</td>
			<td>01-0011x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC5b-9 ELISA</td>
			<td>TECOmedical, Buende, Germany</td>
			<td>A029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>Cambridge Instruments, Cambridge, UK</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape (96 well plate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>15036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10/12 mL Norm-Ject</td>
			<td>Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>10080010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAT micro kit</td>
			<td>Siemens Healthcare, Marburg, Germany</td>
			<td>OWMG15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath Type 1083</td>
			<td>Gesellschaft f&#252;r Labortechnik, Burgwedel, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemocompatibility testing of blood-contacting implants in a flow loop model mimicking human blood flow

Der zunehmende Einsatz von Medizinprodukten (z. B. Gefäßtransplantate, Stents und Herzkatheter) für temporäre oder dauerhafte Zwecke, die im Kreislaufsystem des Körpers verbleiben, erfordert einen zuverlässigen und multiparametrischen Ansatz, der die möglichen hämatologischen Komplikationen dieser Geräte (z. B. Aktivierung und Zerstörung von Blutbestandteilen) bewertet. Umfassende In-vitro-Hämokompatibilitätstests von blutverfeinernden Implantaten sind der erste Schritt zur erfolgreichen in vivo-Implementierung. Daher ist eine umfassende Analyse nach der Internationalen Organisation für Normung 10993-4 (ISO 10993-4) vor der klinischen Anwendung obligatorisch. Die vorgestellte Durchflussschleife beschreibt ein empfindliches Modell, um die hämostatische Leistung von Stents (in diesem Fall neurovaskuläre) zu analysieren und Nebenwirkungen aufzudecken. Die Verwendung von frischem menschlichem Vollblut und sanfte Blutentnahme sind wichtig, um die Voraktivierung von Blut zu vermeiden. Das Blut wird durch einen heparinisierten Schlauch, der die Probe enthält, durch eine peristaltische Pumpe mit einer Rate von 150 ml/min bei 37 °C für 60 min durchdrungen. Vor und nach der Perfusion hämatologische Marker (d.h. Blutzellzahl, Hämoglobin, Hämatokrit und Plasmamarker), die auf die Aktivierung von Leukozyten (polymorphonukleäre [PMN]-Elastase), Thrombozyten (-Thromboglobulin [-TG]), das Gerinnungssystem (Thombin-Antithrombin III [TAT]) und die Komplementkaska (SC5b-9) hinweisen, Zusammenfassend stellen wir ein wesentliches und zuverlässiges Modell für umfangreiche Hämokompatibilitätstests von Stents und anderen blutverstigenden Geräten vor der klinischen Anwendung vor.

Kurz zusammengefasst, wurde menschliches Vollblut in Heparin-geladenen Monovetten gesammelt und dann gepoolt und verwendet, um die Grundwerte der Zellzahl sowie plasmatische Hämokompatibilitätsmarker zu bewerten.
Anschließend wurden die Schläuche, die die neurovaskulären Implantatproben enthielten, gefüllt und das Blut 60 min bei 150 ml/min und 37 °C mit einer peristaltischen Pumpe durchtränz. Auch hier wurde die Anzahl der Zellen in allen Gruppen analysiert und die Plasmaproben für E...

Watch this Scientific Journal Video about Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow at JoVE.com

Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow

Dieses Protokoll beschreibt eine umfassende Hämokompatibilitätsbewertung von blutverfälssenden Geräten mit lasergeschnittenen neurovaskulären Implantaten. Ein Flow-Loop-Modell mit frischem, heparinisiertem menschlichem Blut wird angewendet, um den Blutfluss zu imitieren. Nach der Perfusion werden verschiedene hämatologische Marker analysiert und mit den direkt nach der Blutentnahme gewonnenen Werten zur Hämokompatibilitätsbewertung der getesteten Geräte verglichen.

HämokompatibilitätSprüfung von blutverfälschten Implantaten in einem Flow Loop-Modell, das den menschlichen Blutfluss imitiert

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the ...

Dieses Protokoll stellt ein Modell für die Hemokompatibilitätsuntersuchung von blutverstättigenden Geräten gemäß den Richtlinien der Internationalen Standardorganisation dar. Das Modell ist ideal für die Nachahmung der physiologischen Bedingungen, die dem Implantat entsprechen, da der niedrige Hintergrund für thrombotische Ereignisse und die niedrige Konzentration von Antikoagulanzien eine breite Analyse der Blutparameter ermöglichen. Diese Methode ist ideal für die Biomaterialforschung, da sie eine einfache Möglichkeit bietet, die Hämokompatibilität zu bewerten.Darüber hinaus kann es für präklinische Studien verwendet werden. Für die Heparinbelastung mischen Sie zunächst 5 000 internationale Einheiten unverdünnten Heparins mit 0,9 % Natriumchlorid, um eine 15 internationale Einheit pro Milliliter Heparinkonzentration zu erhalten. Als nächstes fügen Sie 900 Mikroliter der verdünnten Heparin-Lösung zu drei neutralen Monovetten und drei reservierten Monovetten pro Spender hinzu und lagern die mit Heparin beladenen Monovetten bei vier Grad Celsius.30 Minuten vor der Blutentnahme die Monovetten bei Raumtemperatur aufstellen. Wenn die Monovetten erwärmt haben, sammeln Sie neun Milliliter Blut in jedem der drei Monovetten pro Spender, bevor Sie alle 27 Milliliter Blut von jedem Spender in einem einzigen Plastikbehälter bündeln. Um die Durchflussschleife vorzubereiten, laden Sie mindestens ein Rohr pro Zustand mit dem neurovaskulären Laser geschnitten Implantat von Interesse und legen Sie ein Ende jeder Röhre in einem Reservoir mit 0,9% Natriumchlorid gefüllt.Legen Sie ein unbeladenes Rohr in das Reservoir und verbinden Sie alle Rohre mit dem Pumpenkopf. Legen Sie dann das andere Ende jedes Rohres in einen Messzylinder ein und stellen Sie die Einstellungen der Peristaltikpumpe mit einem Timer auf einen Durchfluss von 150 Milliliter pro Minute ein, während Sie den Füllstand im Messzylinder überprüfen. Für Hämokompatibilitätstests verwenden Sie eine 12-Milliliter-Spritze, um jede Röhre mit sechs Milliliter Blut zu füllen.Nach der Bildung eines Kreislaufs verwenden Sie eine 0,5 Zentimeter lange Silikon-Verbindungsschläuche, um die Rohre fest zu schließen und die Rohre in ein 37 Grad Celsius Wasserbad zu legen. Dann starten Sie die 60-Minuten-Röhre. Für die Blutbildanalyse fügen Sie 1,2 Milliliter nicht durchblutetes Blut oder 1,2 Milliliter Blut aus jeder Röhre nach der Durchblutung in einzelne Monovetten, die EDTA enthalten, hinzu.Umdie Monovetten fünfmal vorsichtig umzudrehen und die Fläschchen in einen Blutanalysator für eine Blutbildanalyse jeder Probe zu laden. Am Ende der Analyse die Monovetten für 15-60 Minuten auf Eis legen. Für die Citrat-Plasma-Sammlung, füllen Sie Citrat-haltige Monovetten mit 1,4 Milliliter nicht durchblutem oder durchbluteligem Blut und invertieren Sie jede Monovette fünfmal sorgfältig.Trennen Sie das Plasma durch Zentrifugation und übertragen Sie drei 250 Mikroliter Aliquots der Plasmafraktion in einzelne 1,5 Milliliter Reaktionsröhrchen. Dann frieren Sie die Plasmaproben in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius bis zu ihrer Analyse. Für die EDTA-Plasmasammlung trennen Sie nach der Vier-Grad-Celsius-Inkubation nach der Blutbildmessung das Plasma durch Zentrifugation und übertragen drei 250 Mikroliter Aliquots der Plasmafraktion in einzelne 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen.Dann die Plasmaproben in flüssigem Stickstoff für minus 20 Grad Celsius Lagerung einfrieren. Für die CTAD-Plasmasammlung CTAD-haltige Monovetten mit 2,7 Millilitern frisch gezogenem oder durchgeblutetem Blut füllen und die Röhrchen fünfmal sorgfältig invertieren. Legen Sie die Monovetten 15-60 Minuten auf Eis, bevor Sie das Plasma durch Zentrifugation sammeln.700 Mikroliter jeder mittleren Plasmafraktion in einzelne 1,5 Milliliter Reaktionsröhrchen übertragen und die gefüllten Reaktionsröhrchen wieder zentrifugieren. Dann zwei 100 Mikroliter Aliquots der mittleren Fraktion in einzelne 1,5-Milliliter-Reaktionsrohre geben und die Rohre in flüssigem Stickstoff einfrieren, um sie bei minus 20 Grad Celsius zu lagern. Um die TAT-Werte in den Citratplasmaproben zu messen, fügen Sie 50 Mikroliter ELISA-Probenpuffer in jeden Brunnen einer 96-well flachen Bodenplatte und 50 Mikroliter Plasmastandard, Plasmakontrolle und unverdünnte Plasmaproben in Duplikaten in die entsprechenden Bohrguts der Platte ein.Nach dem Abdichten der Platte die Proben bei 37 Grad Celsius 15 Minuten lang mit sanftem Schütteln bebrüten. Am Ende der Inkubation, waschen Sie die Platte dreimal mit 300 Mikroliter Waschlösung pro Brunnen, bevor Sie 100 Mikroliter Peroxidase konjugierten anti-humanen TAT-Antikörper zu jedem Brunnen hinzufügen. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius mit Schütteln den Teller dreimal mit 300 Mikroliter frischer Waschlösung pro Brunnen waschen.Nach der letzten Wäsche 100 Mikroliter frisch zubereitete Chromogenlösung pro Brunnen für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzufügen. Am Ende der Inkubation 100 Mikroliter Stop-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen und die optische Dichte auf einem Photometer bei 490 bis 500 Nanometern unter Verwendung der Standardkurvendaten als Trendlinie für die Berechnung der TAT-Konzentration jeder Probe ablesen. Um die Implantate für die Rasterelektronenmikroskopie vorzubereiten, verwenden Sie Zangen, um die Implantate aus den Röhrchen zu entfernen und jedes Implantat dreimal in frischem 0,9%Natriumchlorid pro Wäsche kurz zu spülen.Nach der letzten Wäsche die Implantate in Einzelbehältern mit 2% Glutaraldehyd in PBS ohne Kalzium und Magnesium über Nacht bei vier Grad Celsius lagern. Am nächsten Morgen die Implantate in einzelnen Behältern von PBS für 10 Minuten inkubieren, bevor die Implantate in aufsteigenden Konzentrationen von Ethanol für 10 Minuten pro Konzentration dehydriert werden, wie angegeben. Direkt nach der Blutentnahme und Perfusion werden keine Veränderungen in der Anzahl der weißen oder roten Blutkörperchen oder in den Hämatokritwerten festgestellt.Jedoch, eine Abnahme der Hämoglobinspiegel wird nach perfusion innerhalb des Durchflussschleifensystems festgestellt. Eine Abnahme der Thrombozytenzahlen wird auch beobachtet, die erhöht wird, wenn ein unbeschichteter Stent innerhalb der Schläuche vorhanden ist. Insbesondere wird dieser Verlust reduziert, wenn das Blut mit einem Fibrin-Heparin-beschichteten Stent inkubiert wird.Die TAT-Komplexkonzentration wird als Reaktion auf die Perfusion leicht erhöht. Wenn jedoch ein Nacktmetallstent zugegeben wird, wird eine signifikante Zunahme des TAT festgestellt, was auf eine tiefgreifende Aktivierung des Gerinnungssystems hindeutet. Die Verwendung eines fibrin-heparinbeschichteten Stents verhindert diese Aktivierung.Perfusion führt zu einer erhöhten Aktivierung der Komplimentkaskade, die nicht durch das Vorhandensein von unbeschichteten oder fibrin-heparinbeschichteten Stents beeinflusst wird. In ähnlicher Weise werden neutrophile Granulozyten aktiviert, wie die Quantifizierung der polymorphonuklearen neutrophilen Elastase zeigt. Die Visualisierung durch Rasterelektronenmikroskopie zeigt, dass das Vorhandensein eines dichten Netzes von Blutzellen und Proteinen auf der Oberfläche des unbeschichteten Stents nach perfusion, das bei den fibrin-heparinbeschichteten Stents nicht beobachtet wird.Es ist von größter Bedeutung zu bestätigen, dass das Blut die Aufnahmekriterien für die Gewinnung von Proben erfüllt und frisch entnommenes Blut so schnell wie möglich zu verwenden. Menschliches Blut kann blutübertragene Viren und andere Wirkstoffe enthalten und birgt das Risiko einer Infektion, also achten Sie darauf, bei der Handhabung der Proben immer geeignete PSA zu tragen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Visualisierung und Analyse des Blutflusses und der Sauerstoffverbrauch in hepatischen Mikrozirkulation: Anwendung auf eine akute Hepatitis-Modell

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Forschung

Medizin

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Automatisierte Messung der Mikrozirkulation Blutflußgeschwindigkeit in Lungenmetastasen von Ratten

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Sammlung, Isolierung, und Durchflusszytometrische Analyse der Menschen Endozervikale Proben

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Ultraschall Basierend Beurteilung der koronaren Herzfluss und koronare Flussreserve Mit der Drucküberlastung Modell an der Maus

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Charakterisierung von Immunzellen im menschlichen Fettgewebe mittels Durchflusszytometrie

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Gleichzeitige zytometrische Charakterisierung mehrerer Zelltypen, die durch verschiedene Homogenisierungsmethoden aus dem Maushirn/Spinalcord abgerufen wurden

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

Auswertung der zerebralen Blutfluss-Autoregulation in der Ratte mit Laser-Doppler-Flowmetrie

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

A Rabbit Venous Interposition Model Mimicking Revascularization Surgery using Vein Grafts to Assess Intimal Hyperplasia under Arterial Blood Pressure

A Rabbit Venous Interposition Model Mimicking Revascularization Surgery using Vein Grafts to Assess Intimal Hyperplasia under Arteriellen Blutdruck

Although vein grafts have been commonly used as autologous grafts in revascularization surgeries for ischemic diseases, the long-term patency remains poor ...