Name: hemocompatibility testing of blood-contacting implants in a flow loop model mimicking human blood flow
Uploaded: 2020-03-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow at JoVE.com

Per l'esecuzione della microscopia elettronica a scansione, ringraziamo Ernst Schweizer della sezione di Medical Materials Science and Technology dell'University Hospital Tuebingen. La ricerca è stata sostenuta dal Ministero dell'Istruzione, della Gioventù e dello Sport del CR nell'ambito del Programma Nazionale di Sostenibilità II (Progetto BIOCEV-FAR LQ1604) e dal progetto della Fondazione scientifica ceca n. 18-01163S.

La procedura di campionamento del sangue è stata approvata dal Comitato Etico della facoltà di medicina dell'Università di Tuebingen (codice di identificazione del progetto: 270/2010BO1). Tutti i soggetti hanno fornito il consenso scritto e informato per l'inclusione prima della partecipazione.
1. Preparazione delle Monovette caricate da Eparina
<ol><li>Mescolare l'eparina non diluita (5.000 IU/mL) con cloruro di sodio (NaCl, 0,9%) soluzione e preparare una soluzione con una concentrazion...

<ol>
	<li>ISO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological evaluation of medical devices. , (2002).</li><li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Contacting+Biomaterials:+In+Vitro+Evaluation+of+the+Hemocompatibility.">Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).</li><li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+contamination:+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies.">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).</li><li>Cattaneo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigation+of+chemical+properties+and+biocompatibility+of+neurovascular+braided+implants.">In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).</li><li>Stang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocompatibility+testing+according+to+ISO+10993-4:+discrimination+between+pyrogen-+and+device-induced+hemostatic+activation.">Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation.</a> Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).</li><li>van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacles+in+haemocompatibility+testing.">Obstacles in haemocompatibility testing.</a> Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).</li><li>Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+blood+flow+model+with+physiological+wall+shear+stress+for+hemocompatibility+testing-An+example+of+coronary+stent+testing.">In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing.</a> Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).</li><li>Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hemocompatibility+testing:+The+importance+of+fresh+blood.">In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood.</a> Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).</li><li>Kaplan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-thrombogenic+fibrin-heparin+coating+promotes+in+vitro+endothelialization.">Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).</li><li>. SEM Imaging of Biological Samples Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples">https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples</a> (2019)</li><li>Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hemocompatibility+and+vascular+endothelial+cell+functionality+on+titania+nanostructures+under+static+and+dynamic+conditions+for+improved+coronary+stenting+applications.">In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications.</a> Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).</li><li>Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+evaluation+of+novel+blood+incubation+systems+for+in+vitro+hemocompatibility+assessment+of+planar+solid+surfaces.">Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces.</a> The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).</li><li>Sanak, M., Jakie&#322;a, B., W&#281;grzyn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+hemocompatibility+of+materials+with+arterial+blood+flow+by+platelet+functional+tests.">Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests.</a> Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).</li><li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocompatibility+evaluation+of+different+silver+nanoparticle+concentrations+employing+a+modified+Chandler-loop+in+vitro+assay+on+human+blood.">Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood.</a> Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).</li><li>Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+shear+rate+on+the+adhesion/activation+of+human+platelets+in+flow+through+a+closed-loop+polymeric+tubular+system.">The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).</li><li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers-a+practical+guide.">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide.</a> Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+vitro+hemocompatibility+testing-improving+the+signal+to+noise+ratio.">Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio.</a> Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, 549-552 (2012).</li><li>Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+diagnostic+value+of+leukocyte+and+platelet+accumulations+around+"air+bubbles"+in+blood+after+venous+air+embolism.">Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism.</a> International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).</li><li>Miller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+initial+period+of+protein+adsorption+by+dynamic+surface+tension+measurements+using+different+drop+techniques.">Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).</li><li>van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+modified+chandler,+roller+pump,+and+ball+valve+circulation+models+for+in+vitro+testing+in+high+blood+flow+conditions:+application+in+thrombogenicity+testing+of+different+materials+for+vascular+applications.">Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications.</a> International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).</li><li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+the+thrombogenicity+and+endothelialization+of+bare+metal+and+surface-coated+neurovascular+stents.">Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents.</a> AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).</li><li>Monnink, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon-carbide+coated+coronary+stents+have+low+platelet+and+leukocyte+adhesion+during+platelet+activation.">Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation.</a> Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).</li><li>Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilink+stent+promotes+less+platelet+and+leukocyte+adhesion+than+a+traditional+stainless+steel+stent:+an+in+vitro+experimental+study.">Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study.</a> Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).</li><li>Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+haemodialysis+membrane+biocompatibility+by+parallel+assessment+in+an+ex+vivo+model+in+healthy+volunteers.">Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).</li><li>Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+model+for+studying+the+interactions+between+human+whole+blood+and+endothelium.">A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).</li></ol>

Il protocollo presentato descrive un metodo completo e affidabile per il test di emocompatibilità degli impianti a contatto con il sangue in conformità con ISO 10993-4 in un modello di flusso di taglio che imita il flusso sanguigno umano. Questo studio si basa sul test di impianti neurovascolari tagliati al laser, ma può essere eseguito con una varietà di campioni. I risultati dimostrano che questo metodo consente l'analisi ampia di vari parametri come il numero di cellule del sangue, la prevalenza di diversi marcato...

L'applicazione in vivo di impianti e biomateriali, che interagiscono con il sangue umano, richiede intensi test preclinici incentrati sullo studio di vari marcatori del sistema emostatico. L'Organizzazione Internazionale per la Standardizzazione 10993-4 (ISO 10993-4) specifica i principi centrali per la valutazione dei dispositivi di contatto con il sangue (cioè stent e innesti vascolari) e considera la progettazione del dispositivo, l'utilità clinica e i materiali necessari1.
Il sangue umano è un fluido che contiene varie proteine e cellule plasmatiche, tra cui leucociti (globuli bianchi [WBC]), eritrociti (globuli rossi [RBC]), e piastrine, che svolgono funzioni complesse nel corpo umano2. Il contatto diretto di materiali estranei con sangue può causare effetti negativi, come l'attivazione del sistema immunitario o coagulante, che può portare a infiammazione o complicazioni trombotiche e gravi problemi dopo l'impianto3,4,5. Pertanto, la convalida dell'emocompatibilità in vitro offre l'opportunità prima dell'impianto di rilevare ed escludere eventuali complicazioni ematologiche che possono essere indotte a contatto del sangue con una superficie estranea6.
Il modello di loop di flusso presentato è stato stabilito per valutare l'emocompatibilità di stent neurovascolari e dispositivi simili applicando una portata di 150 mL/min in tubi (diametro di 3,2 mm) per imitare le condizioni del flusso cerebrale e diametri arteriosi2,7. Oltre alla necessità di un modello in vitro ottimale, la fonte di sangue è un fattore importante per ottenere risultati affidabili e inalterati quando si analizza l'emocompatibilità di un biomateriale8. Il sangue raccolto deve essere utilizzato immediatamente dopo il campionamento per evitare cambiamenti causati da un accumulo prolungato. In generale, una delicata raccolta di sangue senza stasi utilizzando un ago da 21 G deve essere eseguita per ridurre al minimo la preattivazione delle piastrine e la cascata di coagulazione durante il prelievo del sangue. Inoltre, i criteri di esclusione dei donatori includono coloro che fumano, sono incinte, sono in cattivo stato di salute o hanno assunto contraccettivi orali o antidolorifici nei 14 giorni precedenti.
Questo studio descrive un modello in vitro per l'emocompatibilità esteso dei test di stent in condizioni di flusso. Quando si confrontano gli stent rivestiti di fibrina eparina, i risultati dei test completi di emocompatibilità riflettono una migliore emocompatibilità degli stent rivestiti di mebrina-eparina9. Al contrario, gli stent non rivestiti inducono l'attivazione della cascata di coagulazione, come dimostrato da un aumento delle concentrazioni di thombin-antitrombopina III (TAT) e dalla perdita del numero di piastrine del sangue a causa dell'adesione delle piastrine alla superficie dello stent. Nel complesso, si raccomanda di integrare questo modello di emocompatibilità come test preclinico per rilevare eventuali effetti negativi sul sistema emostatico causati dal dispositivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>aqua ad iniectabilia</td>
			<td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany</td>
			<td>1088813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-TG ELISA</td>
			<td>Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany</td>
			<td>00950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotana 460 R</td>
			<td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrat monovettes (1.4 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>6,16,68,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAD monovettes (2.7 mL)</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>367562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA monovettes (1.2 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>6,16,62,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol p.A. (1000 mL)</td>
			<td>AppliChem, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1,31,08,61,611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25 % in water)</td>
			<td>SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany</td>
			<td>23114.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin coating for tubes</td>
			<td>Ension, Pittsburgh, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL)</td>
			<td>LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany</td>
			<td>PZN 15261203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate Reader Mithras LB 940</td>
			<td>Berthold, Bad Wildbad, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,9%</td>
			<td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany</td>
			<td>1312813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral monovettes (9 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>2,10,63,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump ISM444B</td>
			<td>Cole Parmer, Wertheim, Germany</td>
			<td>3475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3124000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic container (100 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>7,55,62,300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMN-Elastase ELISA</td>
			<td>Demeditec Diagnostics, Kiel Germany</td>
			<td>DEH3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride tube</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>30123328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neurovascular laser-cut implants</td>
			<td>Acandis GmbH, Pforzheim</td>
			<td>01-0011x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC5b-9 ELISA</td>
			<td>TECOmedical, Buende, Germany</td>
			<td>A029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>Cambridge Instruments, Cambridge, UK</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape (96 well plate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>15036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10/12 mL Norm-Ject</td>
			<td>Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>10080010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAT micro kit</td>
			<td>Siemens Healthcare, Marburg, Germany</td>
			<td>OWMG15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath Type 1083</td>
			<td>Gesellschaft f&#252;r Labortechnik, Burgwedel, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemocompatibility testing of blood-contacting implants in a flow loop model mimicking human blood flow

L'uso crescente di dispositivi medici (ad esempio, innesti vascolari, stent e cateteri cardiaci) per scopi temporanei o permanenti che rimangono nel sistema circolatorio del corpo richiede un approccio affidabile e multiparametrico che valuti le possibili complicanze ematologiche causate da questi dispositivi (cioè, attivazione e distruzione di componenti ematici). Il primo passo verso un'implementazione in vivo di successo è il test completo di emocompatibilità in vitro degli impianti a contatto con il sangue. Pertanto, un'analisi approfondita secondo l'Organizzazione Internazionale per la Standardizzazione 10993-4 (ISO 10993-4) è obbligatoria prima dell'applicazione clinica. Il ciclo di flusso presentato descrive un modello sensibile per analizzare le prestazioni emostatiche degli stent (in questo caso, neurovascolare) e rivelare effetti negativi. L'uso di sangue fresco umano intero e di un leggero prelievo di sangue sono essenziali per evitare la preattivazione del sangue. Il sangue viene perfuso attraverso un tubo eparano contenente il campione di prova utilizzando una pompa peristaltica ad una velocità di 150 mL/min a 37 gradi centigradi per 60 min. Prima e dopo la perfusione, i marcatori ematologici (ad es. numero di cellule del sangue, emoglobulina, ematocrito e marcatori plasmatici) che indicano l'attivazione di leucociti (poliomorfonucleari [PMN]-elastassi), piastrine (tromrusbotina z -TG]), il sistema di coagulazione (thombin-antithrombin iii [TAT]), e la cascata superiore (SC5b-9) sono analizzati. In conclusione, presentiamo un modello essenziale e affidabile per test di emocompatibilità estesa di stent e altri dispositivi di contatto con il sangue prima dell'applicazione clinica.

Brevemente riassunto, il sangue umano intero è stato raccolto in monovette caricate in eparina poi raggruppate e utilizzate per valutare i livelli di base dei conteggi cellulari e dei marcatori di emocompatibilità plasmatica.
Successivamente, il tubo contenente i campioni di impianto neurovascolare è stato riempito, e il sangue è stato perfuso per 60 min a 150 mL/min e 37 gradi centigradi utilizzando una pompa peristaltica. Anche in questo caso, il numero di cellule è stato analizzato in ...

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Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow

Questo protocollo descrive una valutazione completa dell'emocompatibilità dei dispositivi di contatto con il sangue utilizzando impianti neurovascolari tagliati al laser. Un modello di ciclo di flusso con sangue umano fresco ed eparinizzato viene applicato per imitare il flusso sanguigno. Dopo la perfusione, vari marcatori ematologici vengono analizzati e confrontati con i valori ottenuti direttamente dopo la raccolta del sangue per la valutazione dell'emocompatibilità dei dispositivi testati.

Test di emocompatibilità degli impianti che si contattono con il sangue in un modello di flusso a ciclo continuo che imita il flusso sanguigno umano

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the ...

Questo protocollo presenta un modello per l'indagine sull'emocompatibilità dei dispositivi di contatto con il sangue secondo le linee guida dell'Organizzazione Standard Internazionale. Il modello è ideale per imitare le condizioni fisiologiche che corrispondono all'impianto poiché lo sfondo basso per eventi trombotici e la bassa concentrazione di anticoagulanti consentono un'ampia analisi del parametro del sangue. Questo metodo è ideale per la ricerca sui biomateriali poiché fornisce un modo semplice per valutare l'emocompatibilità.Inoltre, può essere utilizzato per studi preclinici. Per il carico di eparina, mescolare prima 5.000 unità internazionali di eparina non diluita con cloruro di sodio allo 0,9% per ottenere 15 unità internazionali per millilitro di concentrazione di eparina. Successivamente, aggiungere 900 microlitri della soluzione diluita di eparina a tre monovette neutre e tre monovette riservate per donatore e conservare le monovette caricate con eparina a quattro gradi Celsius.30 minuti prima della raccolta del campione di sangue, posizionare i monovette a temperatura ambiente. Quando le monovette si sono riscaldate, raccogliere nove millilitri di sangue in ciascuno dei tre monovetti per donatore prima di mettere in comune tutti i 27 millilitri di sangue di ogni donatore in un unico contenitore di plastica. Per preparare il ciclo di flusso, caricare almeno un tubo per condizione con l'impianto di interesse tagliato al laser neurovascolare e posizionare un'estremità di ogni tubo in un serbatoio pieno di cloruro di sodio allo 0,9%.Posizionare un tubo scaricato nel serbatoio e collegare tutti i tubi alla testa della pompa. Quindi inserire l'altra estremità di ogni tubo in un cilindro di misura e regolare le impostazioni della pompa peristaltica su una portata di 150 millilitri al minuto utilizzando un timer durante il controllo del livello di riempimento nel cilindro di misura. Per i test di emocompatibilità, utilizzare una siringa da 12 millilitri per riempire ogni tubo con sei millilitri di sangue.Dopo aver formato un circuito, utilizzare una lunghezza di 0,5 centimetri di tubi di collegamento in silicone per chiudere saldamente i tubi e posizionare i tubi in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Quindi avviare il tubo di 60 minuti. Per l'analisi dell'emocromo intero, aggiungere 1,2 millilitri di sangue non perfuso o 1,2 millilitri di sangue da ciascun tubo dopo la perfusione in singole monovette contenenti EDTA.Invertire con cura i monovette cinque volte e caricare le fiale in un analizzatore di sangue per un'analisi del numero di sangue di ogni campione. Al termine dell'analisi, posizionare le monovette sul ghiaccio per 15-60 minuti. Per la raccolta del plasma di citrato, riempire monovette contenenti citrato con 1,4 millilitri di sangue non perfuso o perfuso e invertire con cura ogni monovetta cinque volte.Separare il plasma per centrifugazione e trasferire tre aliquote da 250 microlitri della frazione plasmatica in singoli tubi di reazione da 1,5 millilitri. Quindi congelare i campioni di plasma in azoto liquido e conservarli a meno 20 gradi Celsius fino alla loro analisi. Per la raccolta del plasma EDTA, dopo l'incubazione di quattro gradi Celsius dopo la misurazione del conteggio del sangue, separare il plasma per centrifugazione e trasferire tre aliquote di 250 microlitri della frazione plasmatica in singoli tubi di reazione da 1,5 millilitri.Quindi congelare i campioni di plasma in azoto liquido per meno 20 gradi Celsius. Per la raccolta del plasma CTAD, riempire le monovette contenenti CTAD con 2,7 millilitri di sangue appena estratto o perfuso e invertire accuratamente i tubi cinque volte. Posizionare le monovette sul ghiaccio per 15-60 minuti prima di raccogliere il plasma mediante centrifugazione.Trasferire 700 microlitri di ogni frazione plasmatica centrale in singoli tubi di reazione da 1,5 millilitri e centrifugare nuovamente i tubi di reazione riempiti. Quindi trasferire due aliquote da 100 microlitri della frazione centrale in singoli tubi di reazione da 1,5 millilitri e congelare i tubi in azoto liquido per il loro stoccaggio a meno 20 gradi Celsius. Per misurare i livelli di TAT nei campioni di plasma citrato, aggiungere 50 microlitri di tampone campione ELISA in ogni pozzo di una piastra inferiore piatta da 96 po 'e 50 microlitri di standard plasmatico, controllo del plasma e campioni di plasma non diluiti in duplicati ai pozzi appropriati della piastra.Dopo aver sigillato la piastra, incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 15 minuti con un delicato scuotimento. Al termine dell'incubazione, lavare la piastra tre volte con 300 microlitri di soluzione di lavaggio per porcile prima di aggiungere 100 microlitri di anticorpo TAT coniugato contro l'uomo per ogni pozzo. Dopo un'incubazione di 15 minuti a 37 gradi Celsius con scuotimento, lavare il piatto tre volte con 300 microlitri di soluzione di lavaggio fresco per pozzo.Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 100 microlitri di soluzione di cromogeno appena preparata per pozzo per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aggiungere 100 microlitri di soluzione di arresto a ciascun pozzo e leggere la densità ottica su un fotometro a 490-500 nanometri utilizzando i dati della curva standard come linea di tendenza per calcolare la concentrazione tat di ciascun campione. Per preparare gli impianti per la microscopia elettronica a scansione, utilizzare le forcep per rimuovere gli impianti dai tubi e risciacquare brevemente ogni impianto tre volte in cloruro di sodio fresco allo 0,9% per lavaggio.Dopo l'ultimo lavaggio, conservare gli impianti in singoli contenitori di glutaraldeide al 2% in PBS senza calcio e magnesio durante la notte a quattro gradi Celsius. La mattina successiva, incubare gli impianti in singoli contenitori di PBS per 10 minuti prima di disidratare gli impianti in concentrazioni ascendenti di etanolo per 10 minuti per concentrazione come indicato. Direttamente dopo la raccolta del sangue e la perfusione, non vengono rilevati cambiamenti nel numero di globuli bianchi o rossi o nei valori dell'ematocrito.Tuttavia, una diminuzione dei livelli di emoglobina viene rilevata dopo la perfusione all'interno del sistema di loop di flusso. Si osserva anche una diminuzione del numero di piastrine, che aumenta quando uno stent non rivestito è presente all'interno del tubo. In particolare, questa perdita si riduce quando il sangue viene incubato con uno stent rivestito di fibrina-eparina.La concentrazione complessa tat è leggermente aumentata in risposta alla perfusione. Quando viene aggiunto uno stent a metallo nudo, tuttavia, viene rilevato un aumento significativo del TAT che indica una profonda attivazione del sistema di coagulazione. L'uso di uno stent rivestito di fibrina-eparina impedisce questa attivazione.La perfusione porta ad una maggiore attivazione della cascata di complimenti che non è influenzata dalla presenza di stent non rivestiti o rivestiti di fibrina-eparina. Allo stesso modo, i granulociti neutrofili sono attivati come evidenziato dalla quantificazione dei livelli di elastasi neutrofila polimorfonucleare. La visualizzazione mediante microscopia elettronica a scansione rivela che la presenza di una fitta rete di cellule del sangue e proteine sulla superficie dello stent non rivestito dopo la perfusione che non si osserva sugli stent rivestiti di fibrina-eparina.È della massima importanza confermare che il sangue soddisfa i criteri di inclusione per ottenere campioni e utilizzare sangue appena prelevato il più rapidamente possibile. Il sangue umano può contenere virus ematici e altri agenti e comporta il rischio di infezione, quindi assicurati di indossare sempre DPI appropriati durante la manipolazione dei campioni.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Visualizzazione e analisi del flusso ematico e consumo di ossigeno nella microcircolazione epatica: Applicazione di un modello di epatite acuta

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Ricerca

Medicina

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Citometria a Flusso test cellulare per individuare gli anticorpi per N-metil-D-aspartato Receptor o dopamina-2 recettore nel siero umano

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Microscopio video intravitale misurazioni della retina flusso sanguigno nei topi

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Automated Misura di microcircolatorio Portata in polmonare Metastasi di Ratti

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Raccolta, isolamento e analisi citofluorimetrica di campioni endocervicali umano

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Valutazione Ecografia base di coronaropatia Flow e flusso coronarico Reserve Utilizzando la pressione Sovraccarico modello nei topi

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Caratterizzazione di cellule immunitarie nel tessuto adiposo umano mediante citometria a flusso

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

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Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

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When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

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Un modello di interposizione venosa di coniglio che imita la chirurgia di rivascolarizzazione usando grafts di venina per valutare l'iperplasia intima sotto la pressione sanguigna arteriosa

Although vein grafts have been commonly used as autologous grafts in revascularization surgeries for ischemic diseases, the long-term patency remains poor ...