Name: hemocompatibility testing of blood-contacting implants in a flow loop model mimicking human blood flow
Uploaded: 2020-03-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow at JoVE.com

走査型電子顕微鏡の性能については、大学病院テュービンゲンの医学材料科学技術部門のエルンスト・シュヴァイツァーに感謝します。研究は、国家持続可能性プログラムII(プロジェクトBIOCEV-FAR LQ1604)内のCRの教育・青少年・スポーツ省とチェコ科学財団プロジェクト第18-01163Sによって支援されました。

血液採取手順は、火ビンゲン大学の医学部の倫理委員会によって承認されました (プロジェクト識別コード: 270/2010BO1).すべての被験者は、参加前に包含のための書面によるインフォームド・コンセントを提供しました。
1. ヘパリンを積んだモノベットの準備
<ol><li>希釈されていないヘパリン(5,000 IU/mL)と塩化ナトリウム(NaCl、0.9%)を混ぜる15 IU/mLのヘパリンの結果濃度の溶...

<ol>
	<li>ISO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological evaluation of medical devices. , (2002).</li><li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Contacting+Biomaterials:+In+Vitro+Evaluation+of+the+Hemocompatibility.">Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).</li><li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+contamination:+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies.">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).</li><li>Cattaneo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigation+of+chemical+properties+and+biocompatibility+of+neurovascular+braided+implants.">In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).</li><li>Stang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocompatibility+testing+according+to+ISO+10993-4:+discrimination+between+pyrogen-+and+device-induced+hemostatic+activation.">Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation.</a> Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).</li><li>van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacles+in+haemocompatibility+testing.">Obstacles in haemocompatibility testing.</a> Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).</li><li>Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+blood+flow+model+with+physiological+wall+shear+stress+for+hemocompatibility+testing-An+example+of+coronary+stent+testing.">In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing.</a> Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).</li><li>Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hemocompatibility+testing:+The+importance+of+fresh+blood.">In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood.</a> Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).</li><li>Kaplan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-thrombogenic+fibrin-heparin+coating+promotes+in+vitro+endothelialization.">Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).</li><li>. SEM Imaging of Biological Samples Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples">https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples</a> (2019)</li><li>Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hemocompatibility+and+vascular+endothelial+cell+functionality+on+titania+nanostructures+under+static+and+dynamic+conditions+for+improved+coronary+stenting+applications.">In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications.</a> Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).</li><li>Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+evaluation+of+novel+blood+incubation+systems+for+in+vitro+hemocompatibility+assessment+of+planar+solid+surfaces.">Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces.</a> The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).</li><li>Sanak, M., Jakie&#322;a, B., W&#281;grzyn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+hemocompatibility+of+materials+with+arterial+blood+flow+by+platelet+functional+tests.">Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests.</a> Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).</li><li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocompatibility+evaluation+of+different+silver+nanoparticle+concentrations+employing+a+modified+Chandler-loop+in+vitro+assay+on+human+blood.">Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood.</a> Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).</li><li>Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+shear+rate+on+the+adhesion/activation+of+human+platelets+in+flow+through+a+closed-loop+polymeric+tubular+system.">The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).</li><li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers-a+practical+guide.">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide.</a> Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+vitro+hemocompatibility+testing-improving+the+signal+to+noise+ratio.">Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio.</a> Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, 549-552 (2012).</li><li>Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+diagnostic+value+of+leukocyte+and+platelet+accumulations+around+"air+bubbles"+in+blood+after+venous+air+embolism.">Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism.</a> International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).</li><li>Miller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+initial+period+of+protein+adsorption+by+dynamic+surface+tension+measurements+using+different+drop+techniques.">Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).</li><li>van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+modified+chandler,+roller+pump,+and+ball+valve+circulation+models+for+in+vitro+testing+in+high+blood+flow+conditions:+application+in+thrombogenicity+testing+of+different+materials+for+vascular+applications.">Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications.</a> International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).</li><li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+the+thrombogenicity+and+endothelialization+of+bare+metal+and+surface-coated+neurovascular+stents.">Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents.</a> AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).</li><li>Monnink, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon-carbide+coated+coronary+stents+have+low+platelet+and+leukocyte+adhesion+during+platelet+activation.">Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation.</a> Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).</li><li>Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilink+stent+promotes+less+platelet+and+leukocyte+adhesion+than+a+traditional+stainless+steel+stent:+an+in+vitro+experimental+study.">Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study.</a> Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).</li><li>Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+haemodialysis+membrane+biocompatibility+by+parallel+assessment+in+an+ex+vivo+model+in+healthy+volunteers.">Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).</li><li>Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+model+for+studying+the+interactions+between+human+whole+blood+and+endothelium.">A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).</li></ol>

提示された議定書は人間の血流を模倣するせん断流モデルのISO 10993-4に従って血通しのインプラントのヘモ適合性テストのための包括的で信頼できる方法を記述する。この研究は、レーザーカット神経血管インプラントのテストに基づいていますが、様々なサンプルで行うことができます。この方法により、血球数、いくつかの血性適合マーカーの有病率、および血球接触後のデバイス表面?...

ヒトの血液と相互作用するインプラントや生体材料の生体内応用には、止血システムの様々なマーカーの調査に焦点を当てた強力な前臨床試験が必要です。国際標準化機構10993-4(ISO 10993-4)は、血液接触装置(すなわち、ステントおよび血管移植片)の評価の中心原則を規定し、デバイス設計、臨床有用性、および必要な材料を考慮する。
ヒト血液は、白血球(白血球[BPC])、赤血球(赤血球[RBC])、血小板など、さまざまな形質タンパク質や細胞を含む流体であり、人体2において複雑な機能を行う。血液との異物の直接接触は、炎症または血栓性合併症および移植後の深刻な問題を引き起こす可能性がある免疫または凝固系の活性化などの副作用を引き起こす可能性があります3,4,5.したがって、in vitroのヘモ適合性検証は、移植前に、異物表面6との血液の接触時に誘発される可能性のある血液学的合併症を検出および排除する機会を提供する。
提示されたフローループモデルは、脳の流れ条件と動脈径を模倣するためにチューブ(直径3.2mmの直径)に150 mL/minの流量を適用することによって神経血管ステントおよび類似の装置の血溶性を評価するために確立された2,7。最適なin vitroモデルの必要性に加えて、血液源は生体材料のヘモ適合性を分析する際に信頼性の高い、不変の結果を得るための重要な要因である8。採取した血液は、長期保存によって生じる変化を防ぐために、サンプリング直後に使用する必要があります。一般に、血液の採取中に血小板および凝固カスケードの事前活性化を最小限に抑えるために、21G針を使用して、スタシスのない血液の穏やかな収集を行う必要があります。さらに、ドナー排除基準には、喫煙、妊娠、健康状態が悪い、または過去14日間に経口避妊薬または鎮痛剤を服用した人が含まれる。
本研究では、フロー条件下でのステントインプラントの広範なヘモ適合性試験のためのインビトロモデルについて説明する。非コーティングとフィブリンヘパリンコーティングステントを比較した場合、包括的なヘモ適合性試験の結果は、フィブリンヘパリンコーティングステント9のヘモ適合性の改善を反映している。対照的に、コーティングされていないステントは、凝固カスケードの活性化を誘導し、トンビンアンチトロンビンIII(TAT)濃度の増加およびステント表面への血小板数の接着による血小板数の損失によって示される。全体的に、この血友適合モデルを前臨床試験として統合することは、装置によって引き起こされる止血システムに対するあらゆる悪影響を検出するために推奨される。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>aqua ad iniectabilia</td>
			<td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany</td>
			<td>1088813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-TG ELISA</td>
			<td>Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany</td>
			<td>00950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotana 460 R</td>
			<td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrat monovettes (1.4 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>6,16,68,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAD monovettes (2.7 mL)</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>367562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA monovettes (1.2 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>6,16,62,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol p.A. (1000 mL)</td>
			<td>AppliChem, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1,31,08,61,611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25 % in water)</td>
			<td>SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany</td>
			<td>23114.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin coating for tubes</td>
			<td>Ension, Pittsburgh, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL)</td>
			<td>LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany</td>
			<td>PZN 15261203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate Reader Mithras LB 940</td>
			<td>Berthold, Bad Wildbad, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,9%</td>
			<td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany</td>
			<td>1312813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral monovettes (9 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>2,10,63,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump ISM444B</td>
			<td>Cole Parmer, Wertheim, Germany</td>
			<td>3475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3124000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic container (100 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>7,55,62,300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMN-Elastase ELISA</td>
			<td>Demeditec Diagnostics, Kiel Germany</td>
			<td>DEH3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride tube</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>30123328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neurovascular laser-cut implants</td>
			<td>Acandis GmbH, Pforzheim</td>
			<td>01-0011x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC5b-9 ELISA</td>
			<td>TECOmedical, Buende, Germany</td>
			<td>A029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>Cambridge Instruments, Cambridge, UK</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape (96 well plate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>15036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10/12 mL Norm-Ject</td>
			<td>Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>10080010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAT micro kit</td>
			<td>Siemens Healthcare, Marburg, Germany</td>
			<td>OWMG15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath Type 1083</td>
			<td>Gesellschaft f&#252;r Labortechnik, Burgwedel, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemocompatibility testing of blood-contacting implants in a flow loop model mimicking human blood flow

体内の循環系に残る一時的または永続的な目的のために医療機器(例えば、血管移植片、ステント、心臓カテーテル)の使用が増えている場合、これらの装置によって引き起こされる可能性のある血液学的合併症(すなわち、血液成分の活性化および破壊)を評価する信頼性の高いマルチパラメトリックアプローチが必要である。血液接触インプラントの包括的なインビトロヘモ適合性試験は、生体内での実装に成功するための第一歩です。したがって、国際標準化機構10993-4(ISO 10993-4)による広範な分析は、臨床応用前に必須です。提示されたフローループは、ステント(この場合は神経血管)の止血性能を分析し、悪影響を明らかにする敏感なモデルを記述する。新鮮な人間の全血と穏やかな血液サンプリングの使用は、血液の事前活性化を避けるために不可欠です。血液は、試験検体を含むヘパリンチューブを通して、37°Cで150 mL/minの速度で60分間の蠕動ポンプを使用して浸透する。灌流の前後、血液学的マーカー(すなわち、 血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、および血漿マーカー)は、白血球(多形核[PMN]エラスターゼ)、血小板(β-トロンボグロブリン[β-TG])、凝固系(トンビンアンチトロンビンIII[TAT])、および補体カスケード(SC5b-9)の活性化を示す。結論として、我々は臨床応用前にステントおよび他の血と接触装置の広範なヘモ適合性テストのための必須で信頼できるモデルを提示する。

簡単に要約すると、ヒト全血をヘパリンを積んだモノベットで採取し、細胞数のベースラインレベルと血漿血漿血化適合マーカーを評価するために使用した。
続いて、神経血管インプラント試料を含むチューブを充填し、蠕動ポンプを用いて150mL/minで60分間、37°Cで血液を透過させた。再び、細胞数を全群で分析し、ELISA分析用に血漿サンプルを調製した(?...

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Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow

このプロトコルは、レーザーカット神経血管インプラントを用いた血液接触装置の包括的な血溶性評価について説明する。新鮮なヘパリン化されたヒト血液を有するフローループモデルは、血流を模倣するために適用される。灌流後、種々の血液学的マーカーを分析し、試験された装置の血相適合性評価のために採血後に直接得られた値と比較する。

ヒトの血流を模倣したフローループモデルにおける血液接触インプラントのヘモ適合性試験

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the ...

このプロトコルは、国際標準化機構のガイドラインに従って、血液接触装置のヘモ適合性調査のためのモデルを提示する。このモデルは、血栓性イベントの低バックグラウンドと低濃度の抗凝固剤が血液パラメータの広範な分析を可能にするので、インプラントに対応する生理学的条件を模倣するのに理想的です。この方法は、ヘモ適合性を評価する簡単な方法を提供するので、生体材料研究に最適です。また、前臨床試験に使用できます。ヘパリンローディングの場合、最初に0.9%塩化ナトリウムと希釈されていないヘパリンの国際単位を5,000に混合し、ヘパリン濃度のミリリットル当たり15の国際単位を得る。次に、希釈したヘパリン溶液900マイクロリットルをドナーあたり3つの中性モノベットと3つの予約モノベットに加え、ヘパリンを積んだモノベットを摂氏4度で貯蔵する。血液サンプル採取の30分前に、モノベットを室温に置く。モノベットが温まったら、ドナー1人あたり3つのモノベットのそれぞれに9ミリリットルの血液を採取してから、各ドナーから27ミリリットルの血液をすべて単一のプラスチック容器にプールします。フローループを準備するには、対象の神経血管レーザーカットインプラントで条件ごとに少なくとも1つのチューブをロードし、0.9%塩化ナトリウムを充填した貯水池に各チューブの一端を置きます。アンロードされたチューブを貯留槽に入れ、すべてのチューブをポンプヘッドに接続します。次に、各チューブの反対側を測定シリンダーに挿入し、測定シリンダーの充填レベルを確認しながらタイマーを使用して毎分150ミリリットルの流量に蠕動ポンプの設定を調整します。血溶性検査では、12ミリリットルの注射器を使用して、各チューブを6ミリリットルの血液で満たします。回路を形成した後、シリコン接続チューブの長さ0.5センチメートルを使用してチューブをしっかりと閉じ、チューブを37°Cの水浴に入れます。その後、60分のチューブを開始します。全血数分析のために、非浸透血液の1.2ミリリットルまたはEDTAを含む個々のモノベットに灌流した後、各チューブから1.2ミリリットルの血液を加える。慎重にモノベットを5回反転し、各サンプルの血球数分析のために血液分析装置にバイアルをロードします。分析の最後に、モノベットを氷の上に15〜60分間置きます。クエン酸血漿採取の場合、クエン酸含有モノベットを1.4ミリリットルのノンパーフューズまたは浸透血液で満たし、各モノベットを慎重に5回反転させます。遠心分離によってプラズマを分離し、個々の1.5ミリリットル反応管に血漿分率の3つの250マイクロリットルのアリコートを移す。その後、プラズマサンプルを液体窒素で凍結し、分析までマイナス20度で保存します。EDTA血漿採取の場合、血数測定後の摂氏4度のインキュベーションの後、遠心分離によって血漿を分離し、血漿分画の3つの250マイクロリットルアリコートを個々の1.5ミリリットル反応管に移す。その後、プラズマサンプルを液体窒素で凍結し、マイナス20°Cの貯蔵を行います。CTAD血漿採取の場合、CTAD含有モノベットに2.7ミリリットルの新鮮な血液または浸透した血液を充填し、チューブを慎重に5回反転させます。遠心分離によってプラズマを収集する前に、15〜60分間氷の上にモノベットを置きます。各中間プラズマ分率の700マイクロリットルを個々の1.5ミリリットル反応管に移し、再び充填された反応管を遠心分離します。その後、中間分画の2つの100マイクロリットルアリコートを個々の1.5ミリリットル反応管に移し、液体窒素中のチューブを液体窒素で凍結し、マイナス20°Cで貯蔵します。クエン酸プラズマサンプルのTATレベルを測定するには、ELISAサンプルバッファーの50マイクロリットルを96ウェルの平底プレートの各ウェルに加え、プラズマ標準、プラズマ制御、および希釈されていないプラズマサンプルをプレートの適切なウェルに複製します。プレートを密封した後、穏やかな揺れで15分間摂氏37度でサンプルをインキュベートします。インキュベーションの終わりに、ペルオキシダーゼを共役した抗ヒトTAT抗体を各ウェルに100マイクロリットル添加する前に、ウェルあたり300マイクロリットルの洗浄液でプレートを3回洗浄します。37°Cで15分間のインキュベーションを行い、1ウェルあたり300マイクロリットルの新鮮な洗浄液で3回洗浄します。最後の洗浄後、室温で30分間インキュベーションするために、井戸ごとに100マイクロリットルのクロモーゲン溶液を加えます。インキュベーションの最後に、各ウェルに100マイクロリットルのストップ溶液を加え、各サンプルのTAT濃度を計算するためのトレンドラインとして標準曲線データを使用して、490〜500ナノメートルの光度計の光学密度を読み取ります。走査型電子顕微鏡用のインプラントを準備するには、鉗子を使用してチューブからインプラントを取り除き、各インプラントを洗浄ごとに新鮮な0.9%塩化ナトリウムで3回簡単に洗い流します。最後の洗浄後、2%グルタルアルデヒドの個々の容器にインプラントを保管し、カルシウムとマグネシウムを一晩摂氏4度で使用せずに保管します。翌朝、PBSの個々の容器内のインプラントを10分間インキュベートしてから、示された濃度あたり10分間エタノールの上昇濃度でインプラントを脱水する。採血と灌流の直後に、白血球や赤血球の数、またはヘマトクリット値に変化は検出されない。しかし、フローループシステム内での灌流後にヘモグロビンレベルの低下が検出される。血小板数の減少も観察され、それは、チューブ内にコーティングされていないステントが存在する場合に増加する。特に、血液がフィブリンヘパリンコーティングステントでインキュベートされると、この損失は減少する。TAT複合体濃度は、灌流に応答して軽度に増加する。ベアメタルステントを添加すると、TATの有意な増加が検出され、凝固系の深い活性化を示す。フィブリンヘパリンコーティングステントを使用すると、この活性化を防ぐことができます。灌流は、コーティングされていないまたはフィブリンヘパリンコーティングされたステントの存在の影響を受けない賛辞カスケードの活性化の増加につながります。同様に、好中球顆粒球は、多形核中球エラスターゼレベルの定量化によって証明されるように活性化される。走査電子顕微鏡による可視化は、フィブリンヘパリンコーティングステントでは観察されない灌流後の未コーティングステントの表面に血液細胞とタンパク質の密なネットワークが存在することを明らかにする。血液がサンプルを得るための包含基準を満たしていることを確認し、できるだけ速く採取した新しい血液を使用することが最も重要です。ヒトの血液は血液中のウイルスやその他の薬剤を含み、感染のリスクを伴う可能性があるため、サンプルを取り扱う際には必ず適切なPPEを着用してください。

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

肝微小循環における血流と酸素消費量の可視化と分析：急性肝炎モデルへの応用

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイN-メチル-D-アスパラギン酸受容体またはヒト血清中のドーパ​​ミン-2受容体に対する抗体を検出する

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

ラットの肺転移における微小循環血流速度の自動測定

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

人間頸管サンプルの採取、単離、およびフローサイトメトリー分析

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

マウスの圧負荷モデルを用いた冠動脈の流れと冠血流準備の超音波ベースのアセスメント

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

フローサイトメトリーを用いたひと脂肪組織での免疫細胞のキャラクタリゼーション

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

異なる均質化法を通じてマウス脳/脊髄から取り出された複数の細胞型の同時フロー細胞特性評価

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

レーザードップラー流量測定を用いたラットにおける脳血流自動調節の評価

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

A Rabbit Venous Interposition Model Mimicking Revascularization Surgery using Vein Grafts to Assess Intimal Hyperplasia under Arterial Blood Pressure

静脈移植を用いた血管形成術を模したウサギ静脈間位置モデルによる動脈血圧下の内膜過形成の評価

Although vein grafts have been commonly used as autologous grafts in revascularization surgeries for ischemic diseases, the long-term patency remains poor ...