Name: hemocompatibility testing of blood-contacting implants in a flow loop model mimicking human blood flow
Uploaded: 2020-03-05T14:00:00
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주사 전자 현미경의 성능을 위해, 우리는 대학 병원 Tuebingen의 의료 재료 과학 기술의 섹션에서 Ernst 슈바이저 감사합니다. 이 연구는 국가 지속 가능성 프로그램 II (프로젝트 BIOCEV-FAR LQ1604) 및 체코 과학 재단 프로젝트 No. 18-01163S 내에서 CR의 교육, 청소년 및 스포츠 부처에 의해 지원되었습니다.

혈액 샘플링 절차는 Tuebingen 대학의 의학 교수의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (프로젝트 식별 코드 : 270/2010BO1). 모든 과목은 참여 하기 전에 포함에 대 한 서면, 통보 된 동의를 제공.
1. 헤파린로드 모노베트의 준비
<ol><li>희석되지 않은 헤파린(5,000 IU/mL)과 염화나트륨(NaCl, 0.9%)을 섞는다. 헤파린의 15 IU / mL의 결과 농도와 용액을 준비합니다.</li>
	<li>희석된 헤파린 용액90...

<ol>
	<li>ISO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological evaluation of medical devices. , (2002).</li><li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Contacting+Biomaterials:+In+Vitro+Evaluation+of+the+Hemocompatibility.">Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).</li><li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+contamination:+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies.">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).</li><li>Cattaneo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigation+of+chemical+properties+and+biocompatibility+of+neurovascular+braided+implants.">In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).</li><li>Stang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocompatibility+testing+according+to+ISO+10993-4:+discrimination+between+pyrogen-+and+device-induced+hemostatic+activation.">Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation.</a> Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).</li><li>van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacles+in+haemocompatibility+testing.">Obstacles in haemocompatibility testing.</a> Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).</li><li>Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+blood+flow+model+with+physiological+wall+shear+stress+for+hemocompatibility+testing-An+example+of+coronary+stent+testing.">In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing.</a> Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).</li><li>Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hemocompatibility+testing:+The+importance+of+fresh+blood.">In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood.</a> Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).</li><li>Kaplan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-thrombogenic+fibrin-heparin+coating+promotes+in+vitro+endothelialization.">Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).</li><li>. SEM Imaging of Biological Samples Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples">https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples</a> (2019)</li><li>Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hemocompatibility+and+vascular+endothelial+cell+functionality+on+titania+nanostructures+under+static+and+dynamic+conditions+for+improved+coronary+stenting+applications.">In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications.</a> Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).</li><li>Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+evaluation+of+novel+blood+incubation+systems+for+in+vitro+hemocompatibility+assessment+of+planar+solid+surfaces.">Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces.</a> The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).</li><li>Sanak, M., Jakie&#322;a, B., W&#281;grzyn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+hemocompatibility+of+materials+with+arterial+blood+flow+by+platelet+functional+tests.">Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests.</a> Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).</li><li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocompatibility+evaluation+of+different+silver+nanoparticle+concentrations+employing+a+modified+Chandler-loop+in+vitro+assay+on+human+blood.">Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood.</a> Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).</li><li>Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+shear+rate+on+the+adhesion/activation+of+human+platelets+in+flow+through+a+closed-loop+polymeric+tubular+system.">The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).</li><li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers-a+practical+guide.">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide.</a> Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+vitro+hemocompatibility+testing-improving+the+signal+to+noise+ratio.">Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio.</a> Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, 549-552 (2012).</li><li>Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+diagnostic+value+of+leukocyte+and+platelet+accumulations+around+"air+bubbles"+in+blood+after+venous+air+embolism.">Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism.</a> International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).</li><li>Miller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+initial+period+of+protein+adsorption+by+dynamic+surface+tension+measurements+using+different+drop+techniques.">Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).</li><li>van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+modified+chandler,+roller+pump,+and+ball+valve+circulation+models+for+in+vitro+testing+in+high+blood+flow+conditions:+application+in+thrombogenicity+testing+of+different+materials+for+vascular+applications.">Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications.</a> International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).</li><li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+the+thrombogenicity+and+endothelialization+of+bare+metal+and+surface-coated+neurovascular+stents.">Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents.</a> AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).</li><li>Monnink, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon-carbide+coated+coronary+stents+have+low+platelet+and+leukocyte+adhesion+during+platelet+activation.">Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation.</a> Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).</li><li>Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilink+stent+promotes+less+platelet+and+leukocyte+adhesion+than+a+traditional+stainless+steel+stent:+an+in+vitro+experimental+study.">Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study.</a> Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).</li><li>Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+haemodialysis+membrane+biocompatibility+by+parallel+assessment+in+an+ex+vivo+model+in+healthy+volunteers.">Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).</li><li>Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+model+for+studying+the+interactions+between+human+whole+blood+and+endothelium.">A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).</li></ol>

제시된 프로토콜은 인간의 혈류를 모방하는 전단 흐름 모델에서 ISO 10993-4에 따라 혈액 접촉 임플란트의 혈중 호환성 테스트를 위한 포괄적이고 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 이 연구는 레이저 컷 신경 혈관 임플란트의 테스트를 기반으로하지만 다양한 샘플로 수행 할 수 있습니다. 이 방법은 혈액 세포 수, 여러 혈우적합성 마커의 보급, 혈액 접촉 후 장치 표면의 현미경 시각화와 같은 다양...

인간의 혈액과 상호 작용하는 임플란트 및 생체 재료의 생체 내 응용 프로그램은 지혈 시스템의 다양한 마커의 조사에 초점을 맞춘 강렬한 전임상 테스트가 필요합니다. 국제표준화기구(ISO 10993-4)는 혈액 접촉 장치(즉, 스텐트 및 혈관 이식편)의 평가를 위한 핵심 원칙을 명시하고 장치 설계, 임상 적 유용성 및 필요한 물질을 고려합니다1.
인간의 혈액은 백혈구(백혈구[WBC]), 적혈구(적혈구[RBC]) 및 혈소판을 포함하는 다양한 혈장 단백질 및 세포를 포함하는 유체이며, 이는 인체에서 복잡한 기능을 수행한다2. 혈액과 이물질의 직접적인 접촉은 면역 또는 응고 시스템의 활성화와 같은 부작용을 일으킬 수 있으며, 이는 이식 후 염증 또는 혈전 합병증 및 심각한 문제로 이어질 수 있습니다3,4,5. 따라서, 시험관내 혈적합성 검증은 이식 전에 외래 표면과의 혈액 접촉시 유도될 수 있는 임의의 혈액학적 합병증을 검출하고 배제할 수 있는 기회를 제공한다6.
제시된 플로우 루프 모델은 뇌유동 조건 및 동맥직경을모방하기 위해 튜브(직경 3.2 mm)에 150 mL/min의 유량을 적용하여 신경혈관 스텐트 및 유사한 장치의 혈적합성을 평가하기 위해 설립되었다2,7. 생체외 에서 최적 모형을 위한 필요 이외에, 혈액의 근원은 생체 재료의 혈적합성을 분석할 때 믿을 수 있고 변경되지 않은 결과를 얻기에 있는 중요한 요인8입니다. 수집 된 혈액은 장기간 저장으로 인한 변화를 방지하기 위해 샘플링 후 즉시 사용해야합니다. 일반적으로, 21 G 바늘을 사용하여 정지없이 혈액의 부드러운 수집은 혈액 드로잉 동안 혈소판 과 응고 캐스케이드의 사전 활성화를 최소화하기 위해 수행되어야한다. 또한, 기증자 배제 기준은 담배를 피우거나, 임신 중이거나, 건강상태가 좋지 않거나, 지난 14일 동안 경구 피임약이나 진통제를 복용한 사람들을 포함합니다.
본 연구는 유동 조건하에서 스텐트 임플란트의 광범위한 혈우병 성 테스트를 위한 시험관내 모델을 설명합니다. 피브린 헤파린 코팅 스텐트와 코팅되지 않은 스텐트를 비교할 때, 포괄적인 혈우적합성 테스트 결과는 피브린 헤파린 코팅 스텐트의 향상된 혈호환성을 반영합니다9. 대조적으로, 코팅되지 않은 스텐트는 혈소판이 스텐트 표면에 부착되기 때문에 톰빈-항트롬빈 III(TAT) 농도의 증가 및 혈소판 수의 손실에 의해 입증된 바와 같이 응고 캐스케이드의 활성화를 유도한다. 전반적으로, 전임상 시험으로 이 혈적합성 모형을 통합하는 것은 장치에 기인하는 지혈시스템에 어떤 불리한 효력든지 검출하기 위하여 추천됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>aqua ad iniectabilia</td>
			<td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany</td>
			<td>1088813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-TG ELISA</td>
			<td>Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany</td>
			<td>00950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotana 460 R</td>
			<td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrat monovettes (1.4 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>6,16,68,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAD monovettes (2.7 mL)</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>367562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA monovettes (1.2 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>6,16,62,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol p.A. (1000 mL)</td>
			<td>AppliChem, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1,31,08,61,611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25 % in water)</td>
			<td>SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany</td>
			<td>23114.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin coating for tubes</td>
			<td>Ension, Pittsburgh, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL)</td>
			<td>LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany</td>
			<td>PZN 15261203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate Reader Mithras LB 940</td>
			<td>Berthold, Bad Wildbad, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,9%</td>
			<td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany</td>
			<td>1312813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral monovettes (9 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>2,10,63,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump ISM444B</td>
			<td>Cole Parmer, Wertheim, Germany</td>
			<td>3475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3124000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic container (100 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>7,55,62,300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMN-Elastase ELISA</td>
			<td>Demeditec Diagnostics, Kiel Germany</td>
			<td>DEH3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride tube</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>30123328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neurovascular laser-cut implants</td>
			<td>Acandis GmbH, Pforzheim</td>
			<td>01-0011x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC5b-9 ELISA</td>
			<td>TECOmedical, Buende, Germany</td>
			<td>A029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>Cambridge Instruments, Cambridge, UK</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape (96 well plate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>15036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10/12 mL Norm-Ject</td>
			<td>Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>10080010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAT micro kit</td>
			<td>Siemens Healthcare, Marburg, Germany</td>
			<td>OWMG15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath Type 1083</td>
			<td>Gesellschaft f&#252;r Labortechnik, Burgwedel, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemocompatibility testing of blood-contacting implants in a flow loop model mimicking human blood flow

신체의 순환 계통에 남아 있는 일시적 또는 영구적 목적을 위해 의료 기기(예: 혈관 이식편, 스텐트 및 심장 카테터)의 사용이 증가함에 따라 이러한 장치(즉, 혈액 구성 요소의 활성화 및 파괴)로 인한 가능한 혈액학적 합병증을 평가하는 신뢰할 수 있고 다중파라메트릭 접근법이 필요합니다. 혈액 접촉 임플란트의 포괄적인 체외 혈우적합성 검사는 생체 내 성공적인 구현을 향한 첫 번째 단계입니다. 따라서 국제표준화기구(ISO 10993-4)에 따른 광범위한 분석은 임상 적용 전에 필수적이다. 제시된 흐름 루프는 스텐트의 지혈 성능을 분석하고(이 경우 신경혈관) 부작용을 드러내는 민감한 모델을 설명합니다. 신선한 인간의 전혈과 부드러운 혈액 샘플링의 사용은 혈액의 사전 활성화를 피하기 위해 필수적이다. 혈액은 60 분 동안 37 °C에서 150 mL / min의 속도로 연동 펌프를 사용하여 시험편을 포함하는 헤파린화 튜브를 통해 관류된다. 관류 전후, 혈액학적 마커(즉, 혈액 세포 수, 헤모글로빈, 헤마토크리트 및 혈장 마커)의 활성화를 나타내는 백혈구(다형성핵[PMN]-엘라스타제), 혈소판(β-트롬보글로불린[β-TG]), 응고 시스템(톰빈-항트롬빈 III [TAT]), 및 상보(SCb)의 상호작용(SCb)이 분석된다. 결론적으로, 우리는 임상 적용 전에 스텐트 및 기타 혈액 접촉 장치의 광범위한 혈우적합성 테스트를 위한 필수적이고 신뢰할 수 있는 모델을 제시합니다.

간략하게 요약하면, 인간의 전혈은 헤파린로드 모노벳에서 수집된 다음 풀링하고 혈장 혈전성 마커뿐만 아니라 세포 수의 기준선 수준을 평가하는 데 사용되었습니다.
이어서, 신경혈관 임플란트 샘플을 함유하는 튜브를 채우고, 연동 펌프를 사용하여 150 mL/min 및 37°C에서 60분 동안 혈액을 관류하였다. 다시, 모든 그룹에서 세포 수를 분석하고, 혈장 샘플을 ELISA 분석을 위해 ?...

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Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow

이 프로토콜은 레이저 컷 신경 혈관 임플란트를 사용하여 혈액 접촉 장치의 포괄적 인 혈전 성 평가를 설명합니다. 신선한, 헤파린화 인간의 혈액과 흐름 루프 모델은 혈류를 모방하기 위해 적용됩니다. 관류 후, 다양한 혈액학적 마커를 분석하고 시험된 장치의 혈적합성 평가를 위해 혈액 수집 직후 얻은 값과 비교한다.

인간의 혈류를 모방하는 흐름 루프 모델에서 혈액 접촉 임플란트의 혈적합성 테스트

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the ...

이 프로토콜은 국제 표준 기구 지침에 따라 혈액 접촉 장치의 혈중 호환성 조사를위한 모델을 제시합니다. 이 모델은 혈전 증시에 대한 낮은 배경과 항응고제의 낮은 농도가 혈액 파라미터의 광범위한 분석을 가능하게 하기 때문에 임플란트에 대응하는 생리적 조건을 모방하는 데 이상적입니다. 이 방법은 혈전 호환성을 평가하는 간단한 방법을 제공하기 때문에 생체 재료 연구에 이상적입니다.또한, 그것은 전임상 연구에 사용할 수 있습니다. 헤파린 로딩의 경우, 최초 혼합 5, 000 국제 단위의 희석되지 않은 헤파린과 0.9% 염화 나트륨을 사용하여 헤파린 농도의 밀리리터당 15개의 국제 유닛을 획득한다. 다음으로, 희석된 헤파린 용액의 마이크로리터 900을 기증자 당 3개의 중성 모노베트에 추가하고 헤파린로드 모노벳을 섭씨 4도에 보관합니다.혈액 샘플 수집 30분 전에 모노벳을 실온에 놓습니다. 모노베트가 따뜻해지자 기증자 당 3개의 모노벳에 9밀리리터의 혈액을 모아 각 기증자의 27밀리리터를 모두 단일 플라스틱 용기에 넣습니다. 흐름 루프를 준비하려면 신경혈관 레이저 절단 임플란트와 조건당 적어도 하나의 튜브를 적재하고 각 튜브의 한쪽 끝을 0.9%의 염화나트륨으로 채워진 저수지에 놓습니다.언로드된 튜브를 저수지에 넣고 모든 튜브를 펌프 헤드에 연결합니다. 그런 다음 각 튜브의 다른 끝을 측정 실린더에 삽입하고 연막 펌프의 설정을 측정 실린더의 채우기 레벨을 확인하는 동안 타이머를 사용하여 분당 150 밀리리터의 유속으로 조정합니다. 혈우호환성 테스트를 위해 12밀리리터 주사기를 사용하여 각 튜브에 6밀리리터의 혈액을 채웁니다.회로를 형성한 후 튜브를 연결하는 실리콘 길이0.5센티미터를 사용하여 튜브를 단단히 닫고 튜브를 섭씨 37도의 수조에 놓습니다. 그런 다음 60 분 튜브를 시작합니다. 전체 혈액 수 분석을 위해, EDTA를 포함하는 개별 monovettes에 관류 후에 각 관성 에서 1.2 밀리리터 또는 1.2 밀리리터의 혈액을 추가합니다.모노벳을 5번 조심스럽게 반전시키고 각 샘플의 혈액 수 분석을 위해 바이알을 혈액 분석기로 로드합니다. 분석이 끝나면 단색을 얼음 위에 15-60분 간 놓습니다. 구연산 플라즈마 수집의 경우, 구연산염 함유 모노벳을 1.4 밀리리터의 무응응또는 퍼퓨즈 혈액으로 채우고 각 모노벳을 5번 조심스럽게 반전시다.플라즈마를 원심분리하여 분리하고 혈장 분획의 3개의 250 마이크로리터 알리쿼트를 개별 1.5 밀리리터 반응 튜브로 옮긴다. 그런 다음 플라즈마 샘플을 액체 질소로 동결하고 분석 할 때까지 섭씨 영하 20도에 보관하십시오. EDTA 플라즈마 수집의 경우, 혈액 카운트 측정 후 섭씨 4도 의 배양 후, 원심분리로 플라즈마를 분리하고 혈장 분획의 3 개의 250 마이크로 리터 알리쿼트를 개별 1.5 밀리리터 반응 튜브로 옮긴다.그런 다음 액체 질소로 플라즈마 샘플을 영하 20도 저장합니다. CTAD 플라즈마 수집의 경우 CTAD 함유 모노벳을 2.7 밀리리터의 갓 뽑거나 침투한 혈액으로 채우고 튜브를 5번 조심스럽게 반전시십시오. 원심분리로 플라즈마를 수집하기 전에 15-60분 동안 단검을 얼음 위에 놓습니다.각 중간 플라즈마 분획의 700마이크로리터를 개별 1.5 밀리리터 반응 튜브로 옮기고 충전된 반응 튜브를 원심분리합니다. 그런 다음 중간 분획의 100 마이크로리터 알리쿼트 2개를 개별 1.5 밀리리터 반응 튜브로 옮기고 액체 질소로 튜브를 영하 20도에서 보관할 수 있도록 동결합니다. 구연산 플라즈마 샘플의 TAT 수준을 측정하려면 96웰 의 평평한 바닥 플레이트와 50 마이크로리터의 혈장 표준, 플라즈마 제어 및 희석되지 않은 플라즈마 샘플의 각 웰에 50 마이크로리터를 플레이트의 적절한 우물에 중복하여 추가합니다.접시를 밀봉 한 후, 부드러운 흔들림으로 15 분 동안 섭씨 37도에서 샘플을 배양하십시오. 인큐베이션이 끝나면, 각 웰에 100 마이크로리터의 퍼록시다아제 공액을 첨가하기 전에 잘 세척용 300 마이크로리터로 플레이트를 세 번 세척한다. 섭씨 37도에서 15분 간 배양한 후, 300마이크로리터의 신선한 세척용액으로 접시를 세 번 씻습니다.마지막 세척 후, 실온에서 30 분 배양에 대한 잘 당 갓 준비 된 염색체 용액 100 마이크로 리터를 추가합니다. 인큐베이션의 끝에서, 각 우물에 100 마이크로리터의 정지 용액을 추가하고 각 샘플의 TAT 농도를 계산하기 위한 추세선으로 표준 곡선 데이터를 사용하여 490 내지 500 나노미터의 광미터에 광학 밀도를 판독한다. 전자 현미경 검사용 임플란트를 준비하려면 집게를 사용하여 튜브에서 임플란트를 제거하고 세척당 0.9 % 염화 나트륨으로 각 임플란트를 세 번 간략하게 헹구십시오.마지막 세척 후, 칼슘과 마그네슘없이 PBS에 2 % 글루타랄데히드의 개별 용기에 임플란트를 저장 4 섭씨. 다음 아침, PBS의 개별 용기에 임플란트를 10분 동안 배양한 후 에탄올 농도에서 임플란트를 농도당 10분 동안 탈수합니다. 혈액 수집 및 관류 직후, 백색 또는 적혈구의 수 또는 헤마토크염 값에서 아무 변화도 검출되지 않습니다.그러나, 헤모글로빈 수준의 감소는 흐름 루프 시스템 내의 관류 후 검출된다. 혈소판 수의 감소도 관찰되며, 이는 튜브 내에 코팅되지 않은 스텐트가 존재할 때 증가합니다. 특히, 혈액이 피브린 헤파린 코팅 스텐트로 배양 될 때이 손실은 감소된다.TAT 복합 농도는 관류에 반응하여 약간 증가한다. 그러나 베어 메탈 스텐트가 추가되면 TAT가 크게 증가하여 응고 시스템의 심오한 활성화를 나타냅니다. 피브린 헤파린 코팅 스텐트를 사용하면 이러한 활성화가 방지됩니다.관류는 코팅되지 않은 또는 피브린 헤파린 코팅 스텐트의 존재에 의해 영향을받지 않는 칭찬 폭포의 증가 활성화로 이어집니다. 유사하게, 호중구 과립구는 다형성 핵 호중구 엘라스테아제 수준의 정량화에 의해 입증된 바와 같이 활성화된다. 전자 현미경 검사를 스캔하여 시각화는 피브린 헤파린 코팅 스텐트에서 관찰되지 않는 관류 후 코팅되지 않은 스텐트의 표면에 혈액 세포와 단백질의 조밀 한 네트워크의 존재를 밝혀.혈액이 샘플을 얻기위한 포함 기준을 충족하고 가능한 한 빨리 갓 그린 혈액을 사용하는 것이 가장 중요합니다. 인간의 혈액은 혈액 바이러스 및 그밖 에이전트를 포함할 수 있고 감염의 리스크를 전송할 수 있습니다 그래서 견본을 취급할 때 항상 적당한 PPE를 착용하십시오.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

급성 간염 모델 신청 : 시각화와 간장 Microcirculation의 혈류와 산소 소비 분석

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

연구

의학

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

인간 혈청에있는 N-메틸-D-아스파 라진 산염 수용체 또는 도파민 2 수용체에 대한 항체를 검출하는 높은 처리량 유동 세포 계측법 세포 기반 분석

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

쥐의 폐 전이의 미세 혈류 속도의 자동 측정

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

컬렉션, 격리, 인간 자궁 경부 샘플의 유세포 분석

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

마우스의 압력 과부하 모델을 사용하여 관상 동맥 흐름 및 관상 동맥 흐름 준비 제도 이사회의 초음파를 바탕으로 평가

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Cytometry 사용 하 여 인간 지방 조직에서 면역 세포의 특성

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

다른 균질화 방법을 통해 마우스 뇌 / 척수에서 검색 된 여러 세포 유형의 동시 유량 세포 측정 특성 분석

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

레이저 도플러 흐름 측정을 사용하여 쥐에 대뇌 혈액 흐름 자동 조절의 평가

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

A Rabbit Venous Interposition Model Mimicking Revascularization Surgery using Vein Grafts to Assess Intimal Hyperplasia under Arterial Blood Pressure

정맥 이식편을 사용하여 동맥 혈압하에서 인티맥 증식을 평가하는 재혈관 외과를 모방한 토끼 정맥 중개 모델

Although vein grafts have been commonly used as autologous grafts in revascularization surgeries for ischemic diseases, the long-term patency remains poor ...