Name: hemocompatibility testing of blood-contacting implants in a flow loop model mimicking human blood flow
Uploaded: 2020-03-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow at JoVE.com

For utførelsen av skanning elektron mikroskopi, takker vi Ernst Schweizer fra den delen av Medical Materials Science and Technology ved Universitetssykehuset Tuebingen. Forskningen ble støttet av Departementet for utdanning, ungdom og sport i CR innenfor National Sustainability Program II (Project BIOCEV-FAR LQ1604) og av Czech Science Foundation prosjekt Nr. 18-01163S.

Blodprøvebehandlingen ble godkjent av etikkkomiteen til det medisinske fakultetet ved Universitetet i Tuebingen (prosjektidentifikasjonskode: 270/2010BO1). Alle gitt skriftlig, informert samtykke for inkludering før deltakelse.
1. Utarbeidelse av Heparin-lastet monovettes
<ol><li>Bland ufortynnet heparin (5000 IE/ml) med natriumklorid (NaCl, 0,9 %) løsning og klargjøre en løsning med en resulterende konsentrasjon på 15 IE/ml heparin.</li>
	<li>Tilsett 900 μL av den fortynnede heparino...

<ol>
	<li>ISO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological evaluation of medical devices. , (2002).</li><li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Contacting+Biomaterials:+In+Vitro+Evaluation+of+the+Hemocompatibility.">Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).</li><li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+contamination:+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies.">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).</li><li>Cattaneo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigation+of+chemical+properties+and+biocompatibility+of+neurovascular+braided+implants.">In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).</li><li>Stang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocompatibility+testing+according+to+ISO+10993-4:+discrimination+between+pyrogen-+and+device-induced+hemostatic+activation.">Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation.</a> Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).</li><li>van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacles+in+haemocompatibility+testing.">Obstacles in haemocompatibility testing.</a> Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).</li><li>Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+blood+flow+model+with+physiological+wall+shear+stress+for+hemocompatibility+testing-An+example+of+coronary+stent+testing.">In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing.</a> Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).</li><li>Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hemocompatibility+testing:+The+importance+of+fresh+blood.">In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood.</a> Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).</li><li>Kaplan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-thrombogenic+fibrin-heparin+coating+promotes+in+vitro+endothelialization.">Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).</li><li>. SEM Imaging of Biological Samples Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples">https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples</a> (2019)</li><li>Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hemocompatibility+and+vascular+endothelial+cell+functionality+on+titania+nanostructures+under+static+and+dynamic+conditions+for+improved+coronary+stenting+applications.">In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications.</a> Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).</li><li>Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+evaluation+of+novel+blood+incubation+systems+for+in+vitro+hemocompatibility+assessment+of+planar+solid+surfaces.">Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces.</a> The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).</li><li>Sanak, M., Jakie&#322;a, B., W&#281;grzyn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+hemocompatibility+of+materials+with+arterial+blood+flow+by+platelet+functional+tests.">Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests.</a> Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).</li><li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocompatibility+evaluation+of+different+silver+nanoparticle+concentrations+employing+a+modified+Chandler-loop+in+vitro+assay+on+human+blood.">Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood.</a> Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).</li><li>Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+shear+rate+on+the+adhesion/activation+of+human+platelets+in+flow+through+a+closed-loop+polymeric+tubular+system.">The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).</li><li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers-a+practical+guide.">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide.</a> Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+vitro+hemocompatibility+testing-improving+the+signal+to+noise+ratio.">Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio.</a> Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, 549-552 (2012).</li><li>Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+diagnostic+value+of+leukocyte+and+platelet+accumulations+around+"air+bubbles"+in+blood+after+venous+air+embolism.">Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism.</a> International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).</li><li>Miller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+initial+period+of+protein+adsorption+by+dynamic+surface+tension+measurements+using+different+drop+techniques.">Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).</li><li>van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+modified+chandler,+roller+pump,+and+ball+valve+circulation+models+for+in+vitro+testing+in+high+blood+flow+conditions:+application+in+thrombogenicity+testing+of+different+materials+for+vascular+applications.">Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications.</a> International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).</li><li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+the+thrombogenicity+and+endothelialization+of+bare+metal+and+surface-coated+neurovascular+stents.">Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents.</a> AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).</li><li>Monnink, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon-carbide+coated+coronary+stents+have+low+platelet+and+leukocyte+adhesion+during+platelet+activation.">Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation.</a> Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).</li><li>Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilink+stent+promotes+less+platelet+and+leukocyte+adhesion+than+a+traditional+stainless+steel+stent:+an+in+vitro+experimental+study.">Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study.</a> Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).</li><li>Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+haemodialysis+membrane+biocompatibility+by+parallel+assessment+in+an+ex+vivo+model+in+healthy+volunteers.">Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).</li><li>Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+model+for+studying+the+interactions+between+human+whole+blood+and+endothelium.">A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).</li></ol>

Den presenterte protokollen beskriver en omfattende og pålitelig metode for hemokompatibilitetstesting av blodkontaktimplantater i samsvar med ISO 10993-4 i en skjærstrømningsmodell som ettergir menneskelig blodstrøm. Denne studien er basert på testing av laserkuttede nevrovaskulære implantater, men kan utføres med en rekke prøver. Resultatene viser at denne metoden muliggjør bred analyse av ulike parametere som blodlegemer, utbredelsen av flere hemokompatibilitetsmarkører og mikroskopisk visualisering av enhet...

In vivo anvendelse av implantater og biomaterialer, som samhandler med menneskelig blod, krever intens preklinisk testing med fokus på undersøkelse av ulike markører i det hemostatiske systemet. Den internasjonale organisasjonen for standardisering 10993-4 (ISO 10993-4) spesifiserer de sentrale prinsippene for evaluering av blodkontaktenheter (dvs. stenter og vaskulære grafts) og vurderer enhetsdesign, klinisk verktøy og materialer som trengs1.
Humant blod er en væske som inneholder ulike plasmaproteiner og celler, inkludert leukocytter (hvite blodlegemer [WBCer]), erytrocytter (røde blodlegemer [RBC]), og blodplater, som utfører komplekse funksjoner i menneskekroppen2. Direkte kontakt av fremmedlegemer med blod kan forårsake bivirkninger, for eksempel aktivering av immun- eller koagulasjonssystemet, noe som kan føre til betennelse eller trombotiske komplikasjoner og alvorlige problemer etter implantasjon3,4,5. Derfor gir in vitro hemokompatibilitetsvalidering en mulighet før implantasjon for å oppdage og utelukke hematologiske komplikasjoner som kan induseres ved kontakt av blodet med en fremmed overflate6.
Den presenterte flow loop modellen ble etablert for å vurdere hemokompatibilitet av nevrovaskulære stenter og lignende enheter ved å bruke en strømningshastighet på 150 ml / min i rør (diameter på 3,2 mm) for å etterligne cerebralflyt forhold og arterie diametre2,7. Foruten behovet for en optimal in vitro modell, er blodkilden en viktig faktor for å få pålitelige og uendrede resultater når du analyserer hemokompatibilitet av et biomateriale8. Det oppsamlede blodet skal brukes umiddelbart etter prøvetaking for å forhindre endringer forårsaket av langvarig lagring. Generelt bør en mild oppsamling av blod uten stasis ved hjelp av en 21 G nål utføres for å minimere preaktivering av blodplater og koagulasjonskaskade under blodtegning. Videre inkluderer donorekskluderingskriterier de som røyker, er gravide, er i dårlig helsetilstand, eller har tatt p-piller eller smertestillende midler i løpet av de siste 14 dagene.
Denne studien beskriver en in vitro-modell for omfattende hemokompatibilitetstesting av stentimplantater under strømningsforhold. Når du sammenligner ubestrøket med fibrin-heparinbelagte stenter, gjenspeiler resultatene av de omfattende hemokompatibilitetstestene forbedret hemokompatibilitet av fibrin-heparinbelagte stenter9. I motsetning induserer de ubestrøkede stenter aktiveringen av koagulasjonskaskade, som demonstrert av en økning i trombin-antitrombin III (TAT) konsentrasjoner og tap av blodplatetall på grunn av vedheftet av blodplater til stentoverflate. Samlet sett anbefales det å integrere denne hemokompatibilitetsmodellen som en preklinisk test for å oppdage eventuelle bivirkninger på det hemostatiske systemet som er forårsaket av enheten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>aqua ad iniectabilia</td>
			<td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany</td>
			<td>1088813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-TG ELISA</td>
			<td>Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany</td>
			<td>00950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotana 460 R</td>
			<td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrat monovettes (1.4 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>6,16,68,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAD monovettes (2.7 mL)</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>367562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA monovettes (1.2 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>6,16,62,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol p.A. (1000 mL)</td>
			<td>AppliChem, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1,31,08,61,611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25 % in water)</td>
			<td>SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany</td>
			<td>23114.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin coating for tubes</td>
			<td>Ension, Pittsburgh, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL)</td>
			<td>LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany</td>
			<td>PZN 15261203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate Reader Mithras LB 940</td>
			<td>Berthold, Bad Wildbad, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,9%</td>
			<td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany</td>
			<td>1312813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral monovettes (9 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>2,10,63,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump ISM444B</td>
			<td>Cole Parmer, Wertheim, Germany</td>
			<td>3475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3124000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic container (100 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>7,55,62,300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMN-Elastase ELISA</td>
			<td>Demeditec Diagnostics, Kiel Germany</td>
			<td>DEH3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride tube</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>30123328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neurovascular laser-cut implants</td>
			<td>Acandis GmbH, Pforzheim</td>
			<td>01-0011x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC5b-9 ELISA</td>
			<td>TECOmedical, Buende, Germany</td>
			<td>A029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>Cambridge Instruments, Cambridge, UK</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape (96 well plate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>15036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10/12 mL Norm-Ject</td>
			<td>Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>10080010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAT micro kit</td>
			<td>Siemens Healthcare, Marburg, Germany</td>
			<td>OWMG15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath Type 1083</td>
			<td>Gesellschaft f&#252;r Labortechnik, Burgwedel, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemocompatibility testing of blood-contacting implants in a flow loop model mimicking human blood flow

Den økende bruken av medisinsk utstyr (f.eks. vaskulære transplantater, stenter og hjertekatetre) for midlertidige eller permanente formål som forblir i kroppens sirkulasjonssystem krever en pålitelig og multiparametrisk tilnærming som evaluerer mulige hematologiske komplikasjoner forårsaket av disse enhetene (dvs. aktivering og ødeleggelse av blodkomponenter). Omfattende in vitro hemokompatibilitetstesting av blod-kontakt implantater er det første skrittet mot vellykket i vivo implementering. Derfor er omfattende analyse i henhold til International Organization for Standardization 10993-4 (ISO 10993-4) obligatorisk før klinisk anvendelse. Den presenterte flytsløyfen beskriver en sensitiv modell for å analysere den hemostatiske ytelsen til stenter (i dette tilfellet nevrovaskulær) og avsløre bivirkninger. Bruk av friskt menneskelig blod og skånsom blodprøvetaking er avgjørende for å unngå preaktivering av blod. Blodet er gjennomsyret gjennom et heparinisert rør som inneholder testprøven ved hjelp av en peristaltisk pumpe med en hastighet på 150 ml /min ved 37 °C i 60 min. Før og etter perfusjon, hematologiske markører (dvs. blodceller, hemoglobin, hematokrit og plasmatiske markører) som indikerer aktivering av leukocytter (polymorfokleære [PMN]-elastase), blodplater (β-tromboglobulin [β-TG]), koagulasjonssystemet (trombin-antitrombin III [TAT]), og komplementkaskade (SC5b-9) analyseres. Til slutt presenterer vi en viktig og pålitelig modell for omfattende hemokompatibilitetstesting av stenter og andre blodkontaktenheter før klinisk bruk.

Kort oppsummert, menneskelig fullblod ble samlet i heparin-lastet monovettes deretter samlet og brukes til å evaluere baseline nivåer av celletall samt plasmatiske hemokompatibilitet markører.
Deretter ble slangen som inneholdt de nevrovaskulære implantatprøvene fylt, og blodet ble perfundert i 60 min ved 150 ml/min og 37 °C ved bruk av peristaltisk pumpe. Igjen ble antall celler analysert i alle grupper, og plasmaprøvene ble utarbeidet for ELISA-analyser (figur 1</...

Watch this Scientific Journal Video about Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow at JoVE.com

Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow

Denne protokollen beskriver en omfattende hemokompatibilitetevaluering av blodkontaktenheter ved hjelp av laserkuttede nevrovaskulære implantater. En flow loop modell med frisk, heparinisert menneskelig blod påføres for å etterligne blodstrømmen. Etter perfusjon analyseres ulike hematologiske markører og sammenlignes med verdiene som oppnås rett etter blodinnsamling for hemokompatibilitetsevaluering av de testede enhetene.

Hemokompatibilitet Testing av blod-kontakte implantater i en Flow Loop modell etterligne menneskelig blodstrøm

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the ...

Denne protokollen presenterer en modell for hemokompatibilitetsundersøkelsen av blodkontaktenheter i henhold til Internasjonale retningslinjer for standardorganisasjonen. Modellen er ideell for å etterligne de fysiologiske forholdene som tilsvarer implantatet siden den lave bakgrunnen for trombotiske hendelser og den lave konsentrasjonen av antikoagulantia muliggjør en bred analyse av blodparameteren. Denne metoden er ideell for biomateriale forskning siden det gir en enkel måte å evaluere hemokompatibilitet.Videre kan den brukes til prekliniske studier. For heparinlasting, første blanding 5, 000 internasjonale enheter av ufortynnet heparin med 0,9% natriumklorid for å få en 15 internasjonale enheter per milliliter heparinkonsentrasjon. Deretter legger du til 900 mikroliter av den fortynnede heparinløsningen til tre nøytrale monovetter og tre reserverte monovetter per donor og lagrer heparinbelastede monovetter ved fire grader Celsius.30 minutter før blodprøvesamlingen, plasser monovettene ved romtemperatur. Når monovettene har varmet opp, samle ni milliliter blod i hver av tre monovetter per donor før du samler alle 27 milliliter blod fra hver donor i en enkelt plastbeholder. For å forberede strømningssløyfen, last minst ett rør per tilstand med det nevrovaskulære laserkuttede implantatet av interesse og plasser den ene enden av hvert rør i et reservoar fylt med 0,9% natriumklorid.Plasser et losset rør i reservoaret og koble alle rørene til pumpehodet. Sett deretter den andre enden av hvert rør inn i en målesylinder og juster innstillingene for den peristaltiske pumpen til en strømningshastighet på 150 milliliter per minutt ved hjelp av en timer mens du kontrollerer fyllnivået i målesylinderen. For hemokompatibilitetstesting, bruk en 12 milliliter sprøyte til å fylle hvert rør med seks milliliter blod.Etter å ha dannet en krets, bruk en 0,5 centimeter lang silikon forbindelsesrør for å lukke rørene tett og plassere rørene i et 37 graders Celsius vannbad. Start deretter 60 minutters røret. For fullblodstellingsanalyse, tilsett 1,2 milliliter ikke-smeltet blod eller 1,2 milliliter blod fra hvert rør etter perfusjonen i individuelle monovetter som inneholder EDTA.Snu monovetene forsiktig fem ganger og legg hetteglassene i en blodanalysator for en blodprøveanalyse av hver prøve. På slutten av analysen, legg monovettene på is i 15-60 minutter. For citrate plasmasamling, fyll citratholdige monovetter med 1,4 milliliter ikke-smeltet eller perfundert blod og forsiktig inverter hver monovette fem ganger.Skill plasmaet ved sentrifugering og overfør tre 250 mikroliter aliquots av plasmafraksjonen til individuelle 1,5 milliliter reaksjonsrør. Deretter fryse plasmaprøver i flytende nitrogen og lagre dem på minus 20 grader Celsius til deres analyse. For EDTA plasmasamling, etter de fire grader Celsius inkubasjon etter blodtellingsmålingen, skille plasmaet ved sentrifugering og overføre tre 250 mikroliter aliquots av plasmafraksjonen til individuelle 1,5 milliliter reaksjonsrør.Deretter fryse plasmaprøver i flytende nitrogen for minus 20 grader Celsius lagring. For CTAD plasmasamling, fyll CTAD-inneholdende monovetter med 2,7 milliliter nytrukket eller perfundert blod og forsiktig inverter rørene fem ganger. Plasser monovettene på is i 15-60 minutter før du samler plasmaet ved sentrifugering.Overfør 700 mikroliter av hver midterste plasmafraksjon til individuelle 1,5 milliliter reaksjonsrør og sentrifuger de fylte reaksjonsrørene igjen. Deretter overføre to 100 mikroliter aliquots av den midterste fraksjonen til individuelle 1,5 milliliter reaksjonsrør og fryse rørene i flytende nitrogen for lagring på minus 20 grader Celsius. For å måle TAT-nivåene i plasmaprøvene, tilsett 50 mikroliter ELISA-prøvebuffer i hver brønn av en 96-brønns flat bunnplate og 50 mikroliter plasmastandard, plasmakontroll og ufortynnede plasmaprøver i duplikater til de riktige brønnene på platen.Etter å ha forseglet platen, inkuber prøvene ved 37 grader Celsius i 15 minutter med mild risting. På slutten av inkubasjonen, vask platen tre ganger med 300 mikroliter vaskeoppløsning per godt før du legger til 100 mikroliter peroksidase konjugert anti-menneskelig TAT antistoff til hver brønn. Etter en 15-minutters inkubasjon på 37 grader Celsius med risting, vask platen tre ganger med 300 mikroliter frisk vaskeløsning per brønn.Etter siste vask, tilsett 100 mikroliter nylaget kromogenløsning per brønn for en 30-minutters inkubasjon ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen legger du til 100 mikroliter stoppløsning til hver brønn og leser den optiske tettheten på et fotometer ved 490 til 500 nanometer ved hjelp av standard kurvedata som en trendlinje for beregning av TAT-konsentrasjonen av hver prøve. For å forberede implantatene for skanning av elektronmikroskopi, bruk tang til å fjerne implantatene fra rørene og skyll hvert implantat tre ganger i friskt 0,9 % natriumklorid per vask.Etter siste vask, oppbevar implantatene i individuelle beholdere med 2% glutaraldehyd i PBS uten kalsium og magnesium over natten ved fire grader Celsius. Neste morgen inkuber implantatene i individuelle beholdere med PBS i 10 minutter før dehydrering av implantatene i stigende konsentrasjoner av etanol i 10 minutter per konsentrasjon som angitt. Rett etter blodinnsamling og perfusjon oppdages ingen endringer i antall hvite eller røde blodlegemer eller i hematokritverdiene.Det oppdages imidlertid en reduksjon i hemoglobinnivåer etter perfusjon i strømningssløyfesystemet. En reduksjon i blodplatetall observeres også, som økes når en ubestrøket stent er tilstede i slangen. Spesielt reduseres dette tapet når blodet inkuberes med en fibrin-heparinbelagt stent.Tat-kompleksets konsentrasjon økes mildt som følge av perfusjonen. Når en bar metallstent tilsettes, oppdages imidlertid en betydelig økning i TAT som indikerer en dyp aktivering av koagulasjonssystemet. Bruken av en fibrin-heparinbelagt stent forhindrer denne aktiveringen.Perfusjon fører til økt aktivering av komplimentkaskade som ikke påvirkes av tilstedeværelsen av ubestrøket eller fibrin-heparinbelagte stenter. På samme måte aktiveres nøytrofile granulocytter som det fremgår av kvantifiseringen av polymorfeonukleære nøytrofile elasenivåer. Visualisering ved å skanne elektronmikroskopi avslører at tilstedeværelsen av et tett nettverk av blodceller og proteiner på overflaten av den ubestrøkede stenten etter perfusjon som ikke observeres på fibrin-heparinbelagte stenter.Det er av største betydning å bekrefte at blodet oppfyller inklusjonskriteriene for å skaffe prøver og bruke nytegnet blod så raskt som mulig. Humant blod kan inneholde blodbårne virus og andre midler og bærer risikoen for infeksjon, så sørg for å alltid ha riktig PPE når du håndterer prøvene.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Visualisering og analyse av Blood Flow og oksygenforbruk i Nedsatt mikrosirkulasjonen: Søknad til akutt hepatitt Model

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flow Cytometry cellebasert analyse for å påvise antistoffer mot N-metyl-D-aspartat-reseptoren, eller dopamin-2-reseptor i Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Automatisert Måling av microcirculatory Blood Flow Velocity i lungemetastaser av Rats

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Innsamling, Isolation, og flowcytometrisk analyse av menneskelige endocervikale prøver

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Ultralyd Basert Vurdering av Coronary Artery Flow og Coronary Flow Reserve Bruke Trykkload Model i Mus

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Karakteristikk av immunceller i menneskelig fettvev ved hjelp av flowcytometri

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Samtidige Flow analytiske karakterisering av flere celletyper Hentet fra mus Brain/ryggmarg gjennom ulike homogenisering metoder

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

Evaluering av cerebral Blood Flow Autoregulation i Rat bruke laser Doppler Flowmetry

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

A Rabbit Venous Interposition Model Mimicking Revascularization Surgery using Vein Grafts to Assess Intimal Hyperplasia under Arterial Blood Pressure

En kanin venøs interposition modell etterligne revaskularisering kirurgi ved hjelp av venen grafts å vurdere intimal hyperplasi under arteriell blodtrykk

Although vein grafts have been commonly used as autologous grafts in revascularization surgeries for ischemic diseases, the long-term patency remains poor ...