Name: hemocompatibility testing of blood-contacting implants in a flow loop model mimicking human blood flow
Uploaded: 2020-03-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow at JoVE.com

За выполнение сканирующей электронной микроскопии мы благодарим Эрнста Швайзера из секции медицинской материаловедения Университетской больницы Тубингена. Исследование было поддержано Министерством образования, молодежи и спорта ЧР в рамках Национальной программы устойчивого развития II (проект BIOCEV-FAR L-1604) и проектом Чешского научного фонда No 18-01163S.

Процедура отбора проб крови была одобрена Комитетом по этике медицинского факультета Университета Тюбингена (код идентификации проекта: 270/2010BO1). Все субъекты представили письменное, информированное согласие на включение до участия.
1. Подготовка гепаринов-загруженных мо...

<ol>
	<li>ISO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological evaluation of medical devices. , (2002).</li><li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Contacting+Biomaterials:+In+Vitro+Evaluation+of+the+Hemocompatibility.">Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).</li><li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+contamination:+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies.">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).</li><li>Cattaneo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+investigation+of+chemical+properties+and+biocompatibility+of+neurovascular+braided+implants.">In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).</li><li>Stang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocompatibility+testing+according+to+ISO+10993-4:+discrimination+between+pyrogen-+and+device-induced+hemostatic+activation.">Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation.</a> Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).</li><li>van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacles+in+haemocompatibility+testing.">Obstacles in haemocompatibility testing.</a> Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).</li><li>Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+blood+flow+model+with+physiological+wall+shear+stress+for+hemocompatibility+testing-An+example+of+coronary+stent+testing.">In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing.</a> Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).</li><li>Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hemocompatibility+testing:+The+importance+of+fresh+blood.">In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood.</a> Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).</li><li>Kaplan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-thrombogenic+fibrin-heparin+coating+promotes+in+vitro+endothelialization.">Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).</li><li>. SEM Imaging of Biological Samples Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples">https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples</a> (2019)</li><li>Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hemocompatibility+and+vascular+endothelial+cell+functionality+on+titania+nanostructures+under+static+and+dynamic+conditions+for+improved+coronary+stenting+applications.">In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications.</a> Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).</li><li>Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+evaluation+of+novel+blood+incubation+systems+for+in+vitro+hemocompatibility+assessment+of+planar+solid+surfaces.">Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces.</a> The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).</li><li>Sanak, M., Jakie&#322;a, B., W&#281;grzyn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+hemocompatibility+of+materials+with+arterial+blood+flow+by+platelet+functional+tests.">Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests.</a> Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).</li><li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocompatibility+evaluation+of+different+silver+nanoparticle+concentrations+employing+a+modified+Chandler-loop+in+vitro+assay+on+human+blood.">Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood.</a> Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).</li><li>Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+shear+rate+on+the+adhesion/activation+of+human+platelets+in+flow+through+a+closed-loop+polymeric+tubular+system.">The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).</li><li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers-a+practical+guide.">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide.</a> Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).</li><li>M&#252;ller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+vitro+hemocompatibility+testing-improving+the+signal+to+noise+ratio.">Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio.</a> Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, 549-552 (2012).</li><li>Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+diagnostic+value+of+leukocyte+and+platelet+accumulations+around+"air+bubbles"+in+blood+after+venous+air+embolism.">Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism.</a> International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).</li><li>Miller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+initial+period+of+protein+adsorption+by+dynamic+surface+tension+measurements+using+different+drop+techniques.">Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).</li><li>van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+modified+chandler,+roller+pump,+and+ball+valve+circulation+models+for+in+vitro+testing+in+high+blood+flow+conditions:+application+in+thrombogenicity+testing+of+different+materials+for+vascular+applications.">Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications.</a> International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).</li><li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+the+thrombogenicity+and+endothelialization+of+bare+metal+and+surface-coated+neurovascular+stents.">Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents.</a> AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).</li><li>Monnink, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon-carbide+coated+coronary+stents+have+low+platelet+and+leukocyte+adhesion+during+platelet+activation.">Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation.</a> Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).</li><li>Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilink+stent+promotes+less+platelet+and+leukocyte+adhesion+than+a+traditional+stainless+steel+stent:+an+in+vitro+experimental+study.">Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study.</a> Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).</li><li>Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+haemodialysis+membrane+biocompatibility+by+parallel+assessment+in+an+ex+vivo+model+in+healthy+volunteers.">Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).</li><li>Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+model+for+studying+the+interactions+between+human+whole+blood+and+endothelium.">A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).</li></ol>

Представленный протокол описывает всеобъемлющий и надежный метод для гемосовместимости тестирования кровоконтактных имплантатов в соответствии с ISO 10993-4 в модели потока сдвига, имитирующей поток крови человека. Это исследование основано на тестировании лазерной огранки нейрососуди...

Применение in vivo имплантатов и биоматериалов, которые взаимодействуют с человеческой кровью, требует интенсивного доклинического тестирования, фокусирующегося на исследовании различных маркеров гемостатической системы. Международная организация по стандартизации 10993-4 (ISO 10993-4) определяет основные принципы оценки кроветворных устройств (т.е. стентов и сосудистых трансплантатов) и рассматривает конструкцию устройства, клиническую полезность и необходимые материалы1.
Человеческая кровь представляет собой жидкость, которая содержит различные белки плазмы и клетки, в том числе лейкоциты (белые кровяные клетки), эритроциты (красные кровяные клетки) и тромбоциты, которые выполняют сложные функции в организме человека2. Прямой контакт инородных материалов с кровью может вызвать неблагоприятные последствия, такие как активация иммунной или свертывания системы, что может привести к воспалению или тромботические осложнения и серьезные проблемы после имплантации3,4,5. Такимобразом, in vitro гемосовместимость проверки предлагает возможность до имплантации, чтобы обнаружить и исключить любые гематологические осложнения, которые могут быть вызваны при контакте крови с инородной поверхности6.
Представленная модель цикла потока была создана для оценки гемосовместимости нервно-сосудистых стентов и аналогичных устройств путем применения скорости потока 150 мл/мин в трубах (диаметр 3,2 мм) для имитации условий мозгового потока и диаметров артерий2,7. Помимо необходимости оптимальной модели in vitro, источник крови является важным фактором при получении надежных и неизменных результатов при анализе гемосовместимости биоматериала8. Собранную кровь следует использовать сразу после взятия проб, чтобы предотвратить изменения, вызванные длительным хранением. В целом, нежный сбор крови без застоя с использованием 21 G иглы должны быть выполнены, чтобы свести к минимуму преактивации тромбоцитов и каскад коагуляции во время рисования крови. Кроме того, критерии исключения доноров включают тех, кто курит, беременна, находится в плохом состоянии здоровья или принимал оральные контрацептивы или обезболивающие в течение предыдущих 14 дней.
Это исследование описывает модель in vitro для обширного гемосовместимости тестирования стентных имплантатов в условиях потока. При сравнении с непокрытыми стентами с покрытием с фибрином-гепарином результаты комплексных тестов на гемосовместимость отражают улучшенную гемосовместимость стентов с покрытием фибрина-гепарина9. В отличие от этого, непокрытые стенты вызывают активацию каскада коагуляции, о чем свидетельствует увеличение концентраций томбин-антитромбина III (ТАТ) и потеря номеров тромбоцитов крови из-за привязки тромбоцитов к стентной поверхности. В целом, интеграция этой модели гемосовместимости в качестве доклинического теста рекомендуется для выявления любых побочных эффектов на гемостатической системе, которые вызваны устройством.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>aqua ad iniectabilia</td>
			<td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany</td>
			<td>1088813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-TG ELISA</td>
			<td>Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany</td>
			<td>00950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotana 460 R</td>
			<td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrat monovettes (1.4 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>6,16,68,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAD monovettes (2.7 mL)</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>367562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA monovettes (1.2 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>6,16,62,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol p.A. (1000 mL)</td>
			<td>AppliChem, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1,31,08,61,611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25 % in water)</td>
			<td>SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany</td>
			<td>23114.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin coating for tubes</td>
			<td>Ension, Pittsburgh, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL)</td>
			<td>LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany</td>
			<td>PZN 15261203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate Reader Mithras LB 940</td>
			<td>Berthold, Bad Wildbad, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,9%</td>
			<td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany</td>
			<td>1312813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral monovettes (9 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>2,10,63,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump ISM444B</td>
			<td>Cole Parmer, Wertheim, Germany</td>
			<td>3475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3124000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic container (100 mL)</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>7,55,62,300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMN-Elastase ELISA</td>
			<td>Demeditec Diagnostics, Kiel Germany</td>
			<td>DEH3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride tube</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td>
			<td>30123328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neurovascular laser-cut implants</td>
			<td>Acandis GmbH, Pforzheim</td>
			<td>01-0011x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC5b-9 ELISA</td>
			<td>TECOmedical, Buende, Germany</td>
			<td>A029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>Cambridge Instruments, Cambridge, UK</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape (96 well plate)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>15036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10/12 mL Norm-Ject</td>
			<td>Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>10080010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAT micro kit</td>
			<td>Siemens Healthcare, Marburg, Germany</td>
			<td>OWMG15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath Type 1083</td>
			<td>Gesellschaft f&#252;r Labortechnik, Burgwedel, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemocompatibility testing of blood-contacting implants in a flow loop model mimicking human blood flow

Растущее использование медицинских приборов (например, сосудистых трансплантатов, стентов и сердечных катетеров) для временных или постоянных целей, остающихся в системе кровообращения организма, требует надежного и многопараметрического подхода, который оценивает возможные гематологические осложнения, вызванные этими устройствами (т.е. активация и разрушение компонентов крови). Всеобъемлющее тестирование на гемосовместимость в пробирке имплантатов, контактирующих с кровью, является первым шагом на пути к успешной реализации in vivo. Поэтому обширный анализ в соответствии с Международной организацией по стандартизации 10993-4 (ISO 10993-4) является обязательным до клинического применения. Представленный цикл потока описывает чувствительную модель для анализа гемостатической производительности стентов (в данном случае, нервно-сосудистых) и выявления побочных эффектов. Использование свежей человеческой цельной крови и нежный отбор проб крови имеют важное значение, чтобы избежать преактивации крови. Кровь пронизана гепариной трубкой, содержащей испытательный образец, используя перистальтический насос со скоростью 150 мл/мин при 37 градусах По цельсию в течение 60 мин. До и после перфузии гематологические маркеры (т.е., количество клеток крови, гемоглобин, гематокрит и плазматические маркеры), указывающие на активацию лейкоцитов (полиморфоядерная «ПМН-эластаза»), тромбоцитов (з-тромболобулин, ц-ТГ), системы коагуляции (томбин-антитромбин III «Тат» и В заключение мы представляем важную и надежную модель для обширного гемосовместимости тестирования стентов и других кровоконтактных устройств до клинического применения.

Кратко обобщено, человеческая цельная кровь была собрана в гепарина загруженных моноветтах затем объединились и использовались для оценки базовых уровней клеточных отсчетов, а также плазматических маркеров гемосовместимости.
Впоследствии труба, содержащая образцы не...

Watch this Scientific Journal Video about Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow at JoVE.com

Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow

Этот протокол описывает комплексную оценку гемосовместимости кроветковых устройств с использованием нейрососудистых имплантатов с лазерной резкой. Модель петли потока со свежей, гепаринной человеческой кровью применяется для имитации кровотока. После перфузии анализируются различные гематологические маркеры и сравниваются с значениями, полученными сразу после сбора крови для оценки гемосовместимости исследуемых устройств.

Гемосовместимость Тестирование кровоконтактных имплантатов в модели петли потока, имитирующей поток крови человека

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the ...

Этот протокол представляет собой модель для исследования гемосовместимости устройств, контактных с кровью, в соответствии с руководящими принципами Международной стандартной организации. Модель идеально подходит для имитации физиологических условий, которые соответствуют имплантату, так как низкий фон для тромботических явлений и низкая концентрация антикоагулянтов позволяют провести широкий анализ параметра крови. Этот метод идеально подходит для исследования биоматериала, поскольку он обеспечивает простой способ оценки гемосовместимости.Кроме того, он может быть использован для доклинкологических исследований. Для загрузки гепарина, первая смесь 5000 международных единиц неразбавленного гепарина с 0,9% хлорида натрия, чтобы получить 15 международных единиц на миллилитр концентрации гепарина. Затем добавьте 900 микролитров разбавленного раствора гепарина в три нейтральных моноветта и три зарезервированных моноветта на одного донора и храните моноветы, загруженные гепарином, при четырех градусах Цельсия.За 30 минут до сбора образцов крови поместите моноветы при комнатной температуре. Когда моноветы прогрелись, собрать девять миллилитров крови в каждый из трех моноветов на одного донора, прежде чем объединить все 27 миллилитров крови от каждого донора в один пластиковый контейнер. Чтобы подготовить петлю потока, загрузите по крайней мере одну трубку на состояние с нейрососудистым лазерным имплантатом, представляющим интерес, и поместите один конец каждой трубки в резервуар, наполненный хлоридом натрия 0,9%.Поместите выгруженную трубку в резервуар и соедините все трубки с головой насоса. Затем вставьте другой конец каждой трубки в измерительный цилиндр и отрегулируйте настройки перистальтического насоса до скорости потока 150 миллилитров в минуту с помощью таймера при проверке уровня заполнения в измерительном цилиндре. Для тестирования на гемосовместимость используйте 12 миллилитровый шприц, чтобы заполнить каждую трубку шестью миллилитров крови.После формирования цепи, используйте 0,5 сантиметра длиной силикона подключения трубки, чтобы закрыть трубы плотно и поместить трубки в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Затем запустите 60-минутную трубку. Для анализа всего анализа крови добавьте 1,2 миллилитров непротесненной крови или 1,2 миллилитров крови из каждой трубки после перфузии в отдельные моноветы, содержащие ЭДТА.Тщательно инвертировать моноветы пять раз и загрузить флаконы в анализатор крови для анализа крови каждого образца. В конце анализа поместите моноветы на лед на 15-60 минут. Для сбора цитратной плазмы заполните цитратсодержащие моноветты 1,4 миллилитров непроверенной или пролитой крови и тщательно инвертировать каждый моноветт пять раз.Разделив плазму центрифугой и перенесите три 250 микролитровых алицитов плазменной фракции в отдельные 1,5 миллилитровые реакционные трубки. Затем заморозить образцы плазмы в жидком азоте и хранить их при температуре минус 20 градусов по Цельсию до их анализа. Для сбора плазмы ЭДТА, после четырех градусов по Цельсию инкубации после измерения количества крови, отделить плазму центрифугации и передачи трех 250 микролитр aliquots плазменной фракции в отдельных 1,5 миллилитров реакции труб.Затем заморозить образцы плазмы в жидком азоте для хранения минус 20 градусов по Цельсию. Для сбора плазмы CTAD заполните CTAD-содержащие моноветы 2,7 миллилитров свеженатянутой или пролитой крови и тщательно инвертировать трубки пять раз. Поместите моноветы на лед в течение 15-60 минут, прежде чем собирать плазму центрифугации.Передача 700 микролитров каждой средней плазменной фракции в отдельные 1,5 миллилитров реакционные трубки и центрифуга заполненные реакционные трубки снова. Затем перенесите две 100 микролитровых алицитов средней фракции в отдельные 1,5 миллилитровые реакционной трубки и заморозьте трубки в жидком азоте для их хранения при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Для измерения уровней TAT в образцах цитратной плазмы добавьте 50 микролитров буфера образца ELISA в каждую скважину из 96-хорошо ровной нижней пластины и 50 микролитров плазменного стандарта, плазменного контроля и неразбавленных образцов плазмы в дубликатах к соответствующим скважинам пластины.После уплотнения пластины, инкубировать образцы при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут с нежной тряски. В конце инкубации, мыть пластину три раза с 300 микролитров стирального раствора за задолго до добавления 100 микролитров пероксидаса спряженных анти-человеческих антител ТАТ к каждой хорошо. После 15-минутной инкубации при 37 градусах По Цельсию при встряхивании трижды вымойте тарелку 300 микролитров свежего раствора для мытья на колодец.После последней стирки добавьте 100 микролитров свежеприготовленного раствора хрома на колодец для 30-минутной инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации добавьте 100 микролитров стоп-раствора к каждой колодец и прочитайте оптическую плотность на фотометре на 490-500 нанометров, используя стандартные данные кривой в качестве линии тренда для расчета концентрации TAT каждого образца. Чтобы подготовить имплантаты для сканирования электронной микроскопии, используйте типсы, чтобы удалить имплантаты из труб и кратко промыть каждый имплантат три раза в свежем 0,9% хлорида натрия на стирку.После последней стирки храните имплантаты в отдельных контейнерах 2%glutaraldehyde в PBS без кальция и магния на ночь при четырех градусах по Цельсию. На следующее утро инкубировать имплантаты в отдельных контейнерах PBS в течение 10 минут, прежде чем обезвоживать имплантаты в восходящих концентрациях этанола в течение 10 минут на концентрацию, как указано. Непосредственно после сбора крови и перфузии, никаких изменений не обнаруживается в количестве белых или красных кровяных телец или в значениях гематокрита.Тем не менее, снижение уровня гемоглобина обнаруживается после перфузии в системе цикла потока. Наблюдается также уменьшение количества тромбоцитов, что увеличивается, когда в трубе присутствует неокрашенный стент. Примечательно, что эта потеря уменьшается, когда кровь инкубируется стентом с фибрином-гепарином.Комплексная концентрация ТАТ умеренно увеличивается в ответ на перфузию. Однако при добавлении голого металлического стента обнаруживается значительное увеличение ТАТ, что свидетельствует о глубокой активации системы коагуляции. Использование стента с покрытием фибрина-гепарина предотвращает эту активацию.Перфузия приводит к повышенной активации комплимент каскада, который не зависит от наличия без покрытия или фибрин-гепарин покрытием стентов. Аналогичным образом, нейтрофил гранулоциты активируются, о чем свидетельствует количественная оценка уровней полиморфонуклеариловой нейтрофиловой эластазы. Визуализация путем сканирования электронной микроскопии показывает, что наличие плотной сети клеток крови и белков на поверхности неокрашенного стента после перфузии, которое не наблюдается на стентах с фибрином-гепарином.Крайне важно подтвердить, что кровь соответствует критериям включения для получения образцов и использовать свеженатянутую кровь как можно быстрее. Человеческая кровь может содержать вирусы, передающихся через кровь и другие агенты и несет в себе риск заражения, поэтому не забудьте всегда носить соответствующие СИЗ при обработке образцов.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Визуализация и анализ потока крови и потребления кислорода в печеночной микроциркуляции: применение к модели острого гепатита

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Высокая пропускная проточной цитометрии Клеточная Анализ для выявления антител к N-метил-D-аспартат рецепторов или допамин-2 рецепторов в сыворотке человека

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Автоматическое измерение микроциркуляции крови скорость потока в легочных метастазов у ​​крыс

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Коллекция, Изоляция и проточной цитометрии анализа человеческой Endocervical образцов

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Ультразвук оценки на основе коронарной артерии потока и коронарного кровотока заповедника Использование перегрузки Модель давления у мышей

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Характеристика иммунных клеток в жировых тканях человека с помощью проточной цитометрии

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Одновременное циклометрическое использование потока нескольких типов клеток, извлеченных из мозга мыши / спинного мозга с помощью различных методов гомогенизации

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

Оценка саморегуляции мозгового кровного потока в Крысе с помощью лазерной доплеровской флоуметрии

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

A Rabbit Venous Interposition Model Mimicking Revascularization Surgery using Vein Grafts to Assess Intimal Hyperplasia under Arterial Blood Pressure

Кролик Венозное взаимодействие Модель имитация реваскуляризации хирургии с использованием вены трансплантатов для оценки интимальной гиперплазии под артериальным давлением крови

Although vein grafts have been commonly used as autologous grafts in revascularization surgeries for ischemic diseases, the long-term patency remains poor ...