Name: application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging of filamentous fungi
Uploaded: 2019-11-28T15:00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi at JoVE.com

ويرجع الفضل في ذلك إلى صندوق العلوم التيروليه (TWF) لتقديم المنح #256524 إلى صندوق فيينا للعلوم والتكنولوجيا (WWTF) لتقديم منحه #LS13-086 إلى SZ ، والي صندوق المطبوعات التابع لجامعه انسبروك لدعم نشر النفاذ المفتوح. ويشكر المؤلفون أيضا قسم علم العلم من جامعه انسبروك لتوفير المجهر لأيكا الخدمة SP5 الثانية لفحص الليزر كونبؤري.

1. اعداد العينات الفطرية
<ol><li>الفطرية قبل الثقافات<ol>
<li>تطعيم السلالة المطلوبة علي متوسط أجار الصلبة المناسبة ، مثل البطاطا سكر العنب أجار (المساعد الشخصي الرقمي) ل تريهوديرما تروفيرايد أو الحد الأدنى المتوسطة فوغل (VMM) ل عصيباء crassa. أضافه علامة تحديد مناسبه عند العمل مع سلالات التحويلية.</li>
		<li>احتضان ما قبل الثقافة في درجه الحرارة المثلي للكائن الحي. علي سبيل المثال ، t. ضفيرايد في 25 درجه مئوية و n. مبوغه سميكه في 30 درجه مئوية ، و 12 h/12 h الضوء/الظلام دورات حتى وقد وضعت ميسليوم الرياضية ولكن لم تصل بعد إلى حافه لوحه. علي معيار الحجم بيتري طبق (9.2 cm Ø) ، وهذا ياخذ البرية من نوع t. النمط في 4-6 أيام المتوسط ، في حين ان نوع n. مبوغه سميكه البرية تصل إلى هذه المرحلة بعد 3-4 أيام في المتوسط.</li>
	</ol></li>
	<li>زراعه المستعمرات الفطرية<ol>
<li>باستخدام مشرط معقمه ، وقطع صغيره 3 مم × 3 ملم كتله أجار تحمل غير الرياضية ميسليوم من حافه مستعمره من ما قبل الثقافة.</li>
		<li>ضع كتله أجار في مركز لوحه متوسطه صلبه جديده لتطعيم الثقافة التجريبية.</li>
		<li>احتضان الثقافة التجريبية وفقا للمرحلة التنموية المراد التحقيق فيها. علي سبيل المثال ، يتطلب النوع البرية t. ضموري 20-22 ساعة في 25 درجه مئوية في الظلام لتطوير مستعمرات من حوالي 2 سم قطرها علي المساعد الشخصي الرقمي ، في حين ان النوع البرية n. مبوغه سميكه تصل إلى أقطار مستعمره من حوالي 4 سم بعد 14-16 ح من الحضانة في 30 درجه مئوية في الظلام علي VMM. ملاحظه: الحضانة في الظلام يمنع تشكيل الاصباغ التي قد إدخال التلقائي. من أجل القضاء علي مضان الخلفية المتوسطة من الثقافة التجريبية ، استبدل أجار مع 1.5 ٪ ث/ف من عامل ترسيخ شفافة (انظر جدول المواد) ، وأي متوسطه معقده مع متوسط الحد الأدنى المحدد.</li>
	</ol></li>
	<li>زراعه الثقافات الصلبة الجرجم<ol>
<li>استخدام 5 مل من محلول الملح الفسيولوجية المعقمة (0.9 ٪ ث/الخامس كلوريد الصوديوم) لحصاد جراثيم كونديل من لوحه ما قبل الثقافة وجمع الناتجة التعليق بوغ في 15 مل المسمار أنبوب كاب.</li>
		<li>مزيج من التعليق بوغ بشكل جيد من قبل vortexing قويه وبعد ذلك تصفيته أكثر من 1 سم × 5 سم قطاع من النسيج فلتر معقمه (انظر جدول المواد) محشوه بخفه في 1 مل غيض ماصه (علي حد سواء تجميعها وتعقيمها مسبقا) في أنبوب معقمه جديده.</li>
		<li>تحديد كثافة بوغ مع غرفه عد خليه واعداد 1 × 107 خلايا/مل تعليق بوغ مع محلول الملح الفسيولوجية. ملاحظه: يمكن الاحتفاظ بتعليق بوغ في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى أسبوعين.</li>
		<li>اعداد طبق بيتري الحجم القياسي (9.2 سم Ø) مع 20 مل من المتوسطة الصلبة وأضافه 15-20 الخرز الزجاجي معقمه (3 مم Ø) علي القمه.</li>
		<li>ماصه 200 μL من تعليق بوغ علي صفيحه متوسطه وتوزيع الخلايا بالتساوي عبر لوحه كامله بواسطة اهتزاز لطيف. جمع الخرز الزجاجي في الكاس مع 70 ٪ الايثانول لأعاده استخدامها.</li>
		<li>احتضان الثقافة التجريبية وفقا للمرحلة التنموية المراد التحقيق فيها. علي سبيل المثال ، ونوع البرية t. يتطلب 5-6 ح في 25 درجه مئوية في الظلام لتطوير كونيديال germlings علي المساعد الشخصي الرقمي ، في حين ان نوع n. مبوغه سميكه البرية يتطور كونيديال germlings بعد 3-4 h من الحضانة في 30 درجه مئوية في الظلام علي VMM. ملاحظه: من أجل القضاء علي اي مضان الخلفية المتوسطة من الثقافة التجريبية ، استبدل أجار مع 1.5 ٪ ث/ف من عامل ترسيخ شفافة ، وأي متوسطه معقده مع متوسطه الحد الأدنى المحدد.</li>
	</ol></li>
	<li>زراعه من [غرملينغ] سائله ثقافات<ol>
<li>أملا 190 μL من وسط الثقافة السائلة في كل بئر من الشريحة الصغيرة التي تحتوي علي 8 ابار.</li>
		<li>أضافه 10 μL من 1 × 107 الخلايا/mL محلول بوغ (أعدت في الخطوات 1-4-1 – 1.4.3) وتخلط بلطف الأنابيب صعودا وهبوطا بضع مرات. العدد الإجمالي الناتج من الخلايا هو 1 × 105 لكل بئر.</li>
		<li>احتضان الثقافة التجريبية وفقا للمرحلة التنموية المراد التحقيق فيها. علي سبيل المثال ، يتطلب نوع البرية t. ضموري 5-6 ح في 25 درجه مئوية في الظلام لتطوير كونيديال germlings في مرق البطاطا سكر العنب (PDB) ، في حين ان نوع البرية n. مبوغه سميكه يتطور كونيديال germlings بعد 3-4 h من الحضانة في 30 درجه مئوية في الظلام في VMM السائل.</li>
	</ol></li>
</ol>2. اعداد حلول صبغ العمل
<ol><li>لضمان الذوبان الكامل لكل صبغه ، واعداد حلول الأوراق المالية 2 مم في سلفوكسيد ثنائي الميثيل (dmso) عن طريق أضافه المبلغ المناسب (انظر الأوزان الدقيقة في الجدول 1) إلى 1 مل من 100 ٪ dmso وتخلط جيدا من قبل vortexing. تحذير: تاكد من أخذ DMSO من زجاجه مختومه الحاجز. يجب ان يكون سائل شفاف واضح. عند ملامسه الهواء ، يتحول DMSO إلى اللون البني — ربما بسبب أكسده الشوائب النزره — وقد يؤثر سلبا علي نمو الخلايا أو تلطيخ الصبغة.</li>
	<li>تصفيه تعقيم الحل الأسهم من خلال فلتر غشاء حقنه 0.2 μm في أنبوب رد فعل معقمه جديده 1.5 mL. لتقليل صبغ التبييض ، التفاف الأنبوب في رقائق ألومنيوم. ملاحظه: الحل الأسهم صبغ يمكن ان اقتبس إلى احجام أصغر لتجنب ذوبان/تجميد دورات ، وابقي في 4 درجه مئوية لعده أشهر.</li>
	<li>اعداد 20 μM محلول مائي صبغ العمل عن طريق حل 2 μL من محلول الأسهم صبغ في 198 μL من الماء المقطر معقمه في أنبوب رد فعل معقمه جديده 1.5 mL. لتقليل صبغ التبييض ، التفاف الأنبوب في رقائق ألومنيوم. ملاحظه: يجب اعداد الحل صبغ العمل الطازج في يوم التجربة.</li>
	<li>اثناء تركيب العينة (انظر القسم 3) ، سيكون محلول صبغ العمل المخفف 1:10 ، مما ادي إلى تركيز الصبغة النهائية من 2 μM و 0.1 ٪ ث/ف تركيز DMSO النهائي. ملاحظه: اختيار عوامل التخفيف المختلفة ببساطه عن طريق تغيير نسبه حجم بين محلول صبغ العمل والسائل المتصاعد ، يسمح للتكيف بسهوله تركيز الصبغة النهائية المطلوبة. تحذير: لمنع الآثار غير المرغوب فيها بسبب الصبغة أو سميه DMSO ، يجب ان لا يقع عامل التخفيف تحت 1:4 لنتيجة التركيزات النهائية القصوى من صبغ 5 μM و 0.4 ٪ ث/ف DMSO. تركيزات الصبغة العليا سوف تشبع بسرعة النظام ومنع التحديد الكمي اشاره موثوق بها ، في حين ان أكثر من 0.5 ٪ ث/ف (≥ 62.5 mM) DMSO يمكن ان يضعف تطوير الخلايا38.</li>
</ol>3. اعداد عينه لمجهر
<ol><li>تحميل عينات من مستعمرات فطريه (الخطوة 1.2) أو الثقافات germling الصلبة (الخطوة 1.3) بواسطة طريقه كتله أجار المقلوب.<ol>
<li>الحفاظ علي نظيفه 24 مم × 60 مم الغطاء الزجاجي زلة (#1 = 0.13-0.16 مم سمك) جاهزه وأضافه 18 μL من متوسط السائل الحد الأدنى (VMM أو مسنومكس) أو محلول الملح الفسيولوجية علي المركز.</li>
		<li>أضافه 2 μL من 20 μM صبغ حل العمل إلى 18 μL من السائل وتخلط جيدا عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا عده مرات ، مع تجنب إنتاج فقاعات الهواء. ملاحظه: عند العمل مع عده عينات ، فانه من المستحسن لاعداد مزيج رئيسي من محلول صبغ السائل للجميع من أجل ضمان المساواة في تركيز صبغ طوال التجربة.</li>
		<li>مع مشرط نظيفه ، وقطع 15 ملم × 15 ملم عينه من محيط المستعمرة أو الثقافة الصلبة germling ووضعه عموديا بجانب قطره المتوسطة علي زلة الغطاء.</li>
		<li>باستخدام مشرط لدعم الحافة العلوية من كتله واصبع لعقد الجانب الخلفي من كتله في مكان ، وخفض ببطء الجانب تحمل ميسليوم أو germlings علي السائل. العينة جاهزه الآن للانتقال إلى مرحله المجهر. تنبيه: من الضروري القيام بذلك ببطء وبعناية فائقه من أجل تقليل الضغط الميكانيكي علي الخلايا وتجنب فقاعات الهواء المحاصرة بين العينة وزلة الغطاء.</li>
	</ol>
</li>
	<li>جبل الثقافات germling السائل من الخطوة 1.4. ملاحظه: الأكثر ملائمة ، والثقافات germling السائل في الشرائح الصغيرة البئر التي يمكن نقلها مباشره ومزيد من التلاعب في مرحله المجهر.<ol>
<li>أضافه 22 μL من صبغ حل العمل إلى 200 μL من السائل المتوسطة ليؤدي إلى تركيزات النهائية القياسية من 2 μM صبغ و 0.1 ٪ ث/v DMSO. ملاحظه: الثقافات germling السائل لديها ميزه كبيره ان الاصباغ الفلورية (أو غيرها من المواد الكيميائية ، مثل مثبطات) يمكن ان تضاف في اي نقطه الوقت المطلوب من التجربة ، وأيضا اثناء التسجيل. في هذه الحالة ، يجب توخي الحذر الخاص لأداره قطرات السائل ببطء شديد من أجل عدم إزعاج الخلايا. الاهتزازات النظام والحركة البراونية قد يعرض بالفعل بعض حركه الخلية.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. المجهرية الخلية الحية
<ol><li>اضبط إعدادات اكتساب الصور الاساسيه. إعدادات الحصول علي صوره التالية تسمح للتقاط ديناميات تلطيخ في الفردية هيبوهاي وتنطبق علي كل من المقايسات التالية<ol>
<li>تطبيق 5-10 ٪ قوه الليزر من 20 ٪ من قوه الإنتاج الكامل للجهاز.</li>
		<li>استخدام خطه Apo 60x-63x الجلسرين أو المياه الغمر الهدف مع فتحه رقميه عاليه ≥ 1.2.</li>
		<li>تقييد منطقه الحصول علي الصورة إلى الخطوط العريضة لل هيبهاي عن طريق تعيين حجم صوره 1024 x 256 بكسل وباستخدام عامل التكبير البصري من 2 – 3.</li>
		<li>استخدام المسح ثنائي الاتجاه مع 400 هرتز. ضبط حجم الثقب إلى وحده مهواه 1.</li>
		<li>تعيين كسب كاشف الأكثر حساسية إلى 100 ٪.</li>
		<li>لتسجيل لفات الوقت ، بدء اكتساب الصورة مع اطار واحد كل 15 ثانيه للسماح الدقة الزمنيه معقولة دون إنتاج صبغ التبييض أو الإجهاد الصورة.</li>
		<li>للتسجيل الثلاثي الابعاد ، اضبط الحد المكاني العلوي والسفلي علي حدود الأجزاء البصرية للمساحة والمساحة 1 ميكرومتر باستثناء السماح بالدقة المكانية المعقولة. ملاحظه: نظرا للنمو السريع لل "هيهاي" ، غالبا ما تم التضحية بالدقة المكانية العالية في المحور Z للحصول علي دقه زمنيه عاليه في محور X/Y أو العكس. فقط حديثه جدا المجهر الليزر المسح المجاهر سريعة بما يكفي لتلبيه كل المطالب.</li>
	</ol></li>
	<li>اختبارات امتصاص الندرة<ol>
<li>استشر الشكل 1 والجدول 1 لتحديد أفضل إعدادات الاثاره/الانبعاثات ل1-43 fm و/أو 4-64 fm المتاحة علي نظام المجهر وضبط وفقا لذلك. ملاحظه: مع تركيز 2 μM الموصي بها ، دمج صبغه FM في غشاء البلازما هو لحظه في الخلايا السليمة الطبيعية. عاده ما تكتمل العملية برمتها من تلطيخ غشاء البلازما الاولي لصبغ المظهر في فجوات أنبوبي في غضون 30 – 45 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. زيادة تركيز الصبغة FM يزيد S/N-نسبه التالي تنتج صور التباين اعلي أسرع. ومع ذلك ، فانه يسرع أيضا عمليه وضع العلامات مما يجعل من الصعب التفريق بين التعاقب الزمني لتلطيخ عضيه.</li>
		<li>بدء تسجيل الصورة باستخدام إعدادات الحصول علي الصورة الاساسيه الموصي بها أعلاه وتقييم النتائج.</li>
		<li>تحسين إعدادات الحصول علي الصورة إلى الدقة المكانية والزمانيه المطلوبة للتقاط الجانب من غشاء البلازما أو ديناميات الندرة التي تركز عليها التجربة.</li>
		<li>علي سبيل المثال ، من أجل التقاط ديناميات سريعة جدا في X/Y ، إنقاص حجم الصورة الإجمالي ، صوره واحده فقط المستوي البؤري وزيادة معدل المسح إلى 1 اطارا في الثانية. للحصول علي دقه اعلي في المحور Z ، قلل الدقة في X/Y ، وقلل حجم الصورة وقلل المسافة بين الأقسام البصرية إلى 0.5 ميكرومتر.</li>
	</ol></li>
	<li>ديناميات جدار الخلية<ol>
<li>استشر الشكل 4 والجدول 1 لتحديد أفضل إعدادات الاثاره/الانبعاثات لصبغه جدار الخلية التطبيقية المتاحة علي نظام المجهر والضبط وفقا لذلك. ملاحظه: نظرا لأطياف الانبعاثات الواسعة ، فان CFW و SPF ليست مناسبه تماما للتصوير المشترك المتزامن مع الفلوروبيورس الأخرى ، في الغالب GFP. بعض القيود حتى تنطبق علي نهج التصوير متتابعة مع هذه الاصباغ ، التالي يجب ان يكون الأمثل بشكل فردي.</li>
		<li>بدء تسجيل الصورة باستخدام إعدادات الحصول علي الصورة الاساسيه الموصي بها أعلاه وتقييم النتائج. ملاحظه: مع تركيز 2 μM الموصي بها ، وإدماج صبغه في جدار الخلية ليست بالضرورة لحظه ولكن بسرعة معقولة. العملية برمتها من تشكيل الحاجز ، علي سبيل المثال ، يستغرق في المتوسط حوالي 5-7 دقيقه في درجه حرارة الغرفة20. زيادة تركيز صبغ جدار الخلية يزيد S/N-نسبه التالي تنتج صور التباين اعلي أسرع. ومع ذلك ، فانه أيضا بسرعة يدخل التحف بسبب إصلاح الضرر جدار الخلية المستحثة.</li>
		<li>تحسين إعدادات الحصول علي الصورة إلى الدقة المكانية والزمانيه المطلوبة للتقاط الجانب من الجدار الخلوي الذي تركز التجربة عليه ، كما هو مبين في القسم 4-2.</li>
	</ol></li>
</ol>

ويعلن أصحاب البلاغ انه ليست لديهم مصالح مالية متنافسة ولا شيء يكشف عنه.

تواصل هذه المقالة العمل كسر الأرض التي إنشات استخدام الاصباغ الفلورية المختلفة كعلامات عضيه الحيوية للفطريات الفطرية في وقت مبكر 2000s2,4,43, ويحاول مناقشه الخصائص البيولوجية فوتوفيسيكال والخلية من الاصباغ FM والاصباغ خليه الجدار المختارة بمزيد من التفصيل من قبل. خاصه فيما يتعلق بالآثار الخلوية غير المرغوب فيها ، مثل التشبع غشاء أو تلف جدار الخلية ، التي تحدث فوق تركيزات صبغه معينه. ما كان يعتبر سابقا غير سامه علي المستوي الخلوي يعتبر الآن سامه علي المستوي الجزيئي. علي الرغم من ان هذه الآثار قد تكون خفيه جدا وغير واضحة مباشره من التغييرات الواضحة في السلوك العضوي أو الخلية, اي تدخل ممكن من تطبيق صبغ غير التصور يجب ان يكون الحد الأدنى للتحقيق في الوظيفة الجزيئية الاصليه. لحسن الحظ ، وتحسين الحساسية والكفاءة الكم من أجهزه الكشف الحديثة ، مثل كاشفات السليكون الانهيار الضوئي (Si-APDs)44 أو المنطقة Airyscan كاشف45، وتسهيل استخدام كميات اقل حتى من الصبغة من قبل. ومن الأهداف الرئيسية الأخرى لهذه المادة تجسيد خصائص التصوير المشترك لهذه الاصباغ مع الفلوروبيورس الأخرى ، والاهم من ذلك ، تلك التي من GFP باعتبارها البروتين الفلوري الأكثر استخداما في علم الاحياء. هذا ينبغي ان تساعد في تصميم التجارب التصويرية التي تهدف إلى ربط ديناميات التعريب تحت الخلوية من البروتينات الانصهار الفلورسنت إلى تلك التي من جدار الخلية الفطرية ، غشاء البلازما أو المسار اندو-والاكندره الخ.
التصوير تحت ظروف طبيعيه وخاليه من الإجهاد هو المفتاح للحصول علي بيانات موثوق بها. وتهدف بعض الاعتبارات العملية المتعلقة بالثقافة المتوسطة واعداد العينات إلى توفير نقطه انطلاق لإيجاد الظروف المثلي التي تسمح بالمراقبة الدقيقة للخلايا الصحية وغير المجهدة باعلي نسبه S/N الممكنة لأي عينه معينه. ولا توجد طريقه عالميه لتحقيق نتائج تصويريه موثوقه وذات مغزى. ومن المتاصل في النهج ان التنوع البيولوجي للعينه ، والذاتية وتوقعات الميكروسكوبيست ، فضلا عن تجهيز الصورة بعد التصوير ، لهما تاثير كبير علي اكتساب البيانات وتفسيرها ، علي التوالي. التالي ، فان الخبرة العملية لميكروسكوبيست ، لها/له المعرفة الحميمة حول بيولوجيا الخلية من الفطريات تحت التحقيق ، فضلا عن اعداد عينه ماهرا لخلق ظروف "طبيعيه" ودون عائق ممكن في اعداد المختبر ، هي الأهم للحصول علي وتقييم البيانات التصويرية التي تعكس بصدق الظواهر الخلوية درس. 
تطبيق الاصباغ الفلورية بسيط ، ولكن خصائصها تتسم بالضعف. القوه الرئيسية لاستخدام الاصباغ الفلورية هي البساطة الاعداديه للبروتوكولات التجريبية. زراعه وأخذ العينات من الفطريات ، أضافه صبغه (ق) ، والمتصاعدة علي مرحله المجهر هي (مع الممارسة) واضحة. تعديل إعدادات التصوير الاساسيه ، بما في ذلك الاثاره والانبعاثات الموجية ، وأوقات التعرض ، وإعدادات الدورة الزمنيه وما إلى ذلك ، اتبع القواعد البيوفيزيائية البسيطة من المجهر والقواعد البيولوجية لاصباغ الفلورسنت المستخدمة داخل الخلايا. ويهدف الجدول 1 إلى دعم تحديد انسب تركيبه صبغيه أو صبغيه لأغراض التجريب. وعلاوة علي ذلك ، يتم تسعير الاصباغ الفلورية بشكل معقول ، وتتوفر بسهوله مع جوده عاليه يمكن الاعتماد عليها ، التالي ضمان تطبيق استنساخه للغاية.
اثنين من القيود الرئيسية لاستخدام الغشاء أو جدار الخلية الاصباغ الفلورية الانتقائية هي (في كثير من الأحيان) معرفه محدوده من خصائصها تلطيخ دقيقه ، والتي في معظم الحالات غير محدده علي المستوي العضوي والجزيئي ، والآثار الجانبية غير المرغوب فيها تعتمد علي التركيز. الاصباغ FM هي محدده لبليرس الدهون المشاركة في اندو-وكثرة. ومع ذلك ، علي وجه التحديد التي العضوية سوبسيلولاره تصبح علي التوالي المسمية تحت ظروف اختبار ليست واضحة علي الفور ويتطلب المقارنة بين مختلف المتغيرات FM صبغ ، والمشاركة في وضع العلامات مع علامات العضيات اضافيه محدده. تفضيل FM 1-43 لاغشيه الميتوكوندريا ، بالمقارنة مع FM 4-64 ، هو مثال واحد. الاصباغ الانتقائية جدار الخلية عرض خصوصية مختلفه لثلاثه البوليمرات الرئيسية للجدار الخلية الفطرية. ويعتقد CFW ان تكون وصمه عار غير محدده ل β-جلوكان والتين ، ويعتقد SPF ان يكون الأكثر انتقائية ل β-1 ، 4-جلوكان ، ويعتقد CR ان تكون انتقائية للغاية ل α-و β-chitins. المعلومات المتعلقة بخصوصية الربط من PFS إلى السكريات الفطرية جدار الخلية غير متوفرة حاليا. إلى اي نسبه الفطرية جدار الخلية البوليمر هو الأكثر فعاليه المسمي في تركيز صبغه معينه في الأنواع الفطرية تحت التحقيق ليست بسهوله الاجابه ، وتطبيق القياسات المفصلة المكتسبة في المختبر أو في الجسم الحي في الكائنات الأخرى أو الأنواع الفطرية الأخرى يجب ان ينظر بعناية فائقه. للأسف ، هذه المعلومات متناثرة ومبعثرة للغاية في الأدب35،42،46. المزيد من السجلات الاخيره التي من شانها ان تتبع الدراسات السابقة33 لتوفير رؤى جديده في خصائص تلطيخ دقيقه من الاصباغ مميزه علي وجه التحديد في الفطريات غير متوفرة حاليا.
ضوابط التصوير ضرورية لتقييم أنماط تلطيخ والاستجابات الخلوية بدقه. لهذا ، من المهم ان يكون هناك ضوابط جيده إلى جانب اي تجربه جديده للتصوير بالخلايا الحية. وتشمل هذه الأنواع البرية غير المعالجة كعنصر تحكم التصوير السلبية لاستبعاد الفلورية الخلفية والضوضاء كاشف من الصورة المكتسبة ، ويكون للمقارنة المورفولوجية عند العمل مع المسوخ. وعلاوة علي ذلك ، ومراقبه التصوير ايجابيه ، علي سبيل المثال سلاله التي تعبر عن GFP أو طلب العروض في سيتوتوبلاسما أو غيرها من البروتين علامة الفلورسنت المعروفة ، أمر ضروري لضبط شده الضوء الاثاره إلى الحد الأدنى المطلوب ولها عنصر تحكم حيوية الخلية. وبمجرد تعيين عناصر التحكم هذه ، لا يقتصر استخدام الاصباغ الفلورية علي مهام التصور فقط ، ولكن ديناميات التلطيخ التي تعتمد علي التركيز ، فضلا عن الآثار الجانبية التي تعتمد علي التركيز يمكن استغلالها بشكل تحليلي ؛ علي سبيل المثال ، للرصد الكمي الحيوي جدار الخلية في الوقت الحقيقي أو لتحديد الظواهر الظاهرية المحددة في اختبارات الحساسية47.
تعتمد التطبيقات المستقبلية المحسنة علي تحليلات وظيفية مفصله لخصائص صبغ الصبغة. ويتمثل أحد التحديات الرئيسية المستمرة في زيادة تحسين وأتمته تحليلات الصور الكمية من أجل النهوض بالتقييم الوظيفي لديناميات الخلايا شبه الخلوية من الاغشيه والاصباغ الفلورية الانتقائية لجدار الخلية في الفطريات الخيطية. لهذا, واسعه, الكمية المشتركة التوطين الدراسات من هذه الاصباغ مع المعروفة عضيه والخلية الجدار علامات البوليمر في تركيبه مع سلالات متحولة ناقصه في مسارات النقل معينه أو التي تفتقر إلى مكونات هيكليه محدده مطلوبه أولا. العديد من علامات الكثرة للتحليلات المقارنة مع الاصباغ FM متاحه48،49، وفيما يتعلق بخصائص ملزمه لا تزال سيئه تتميز الاصباغ جدار الخلية في الفطريات ، وتطبيق الأجسام المضادة جلوكان المسمية فلوريسسينتلي50 يمكن ان توفر امكانيه واحده لمعالجه هذه المسالة.

قبل عشرين عاما ، كانت الطريقة التي خوطي فيها الفطريات الجزيئية الكامنة والبيولوجيا الاساسيه الخلية التي يمكن تصورها في الفطريات الخيطية ثوره من تطبيق الغشاء الفلوري الانتقائي فاي ماو صبغ FM 4-641. فيما بعد, الفائدة من ال [كيتين-كدينغ] صبغ [كلكوفلور] ابيض كعلامة حيوية فلورية من فطريه خليه جدار ديناميات كان حققت2. ومنذ ذلك الحين ، أصبحت كل من الاصباغ والمتغيرات منها جزءا لا يتجزا من التحليلات التصويرية للخلايا الحية في الفطريات ، والاستمرار في تقديم رؤى غير مسبوقة في نمط الحياة الفطرية الخيطية. هذه الورقة تفاصيل تطبيق الاصباغ الفلورية الثابتة والمعروفة لتتبع ديناميات غشاء البلازما ، اندو-وكثرة والخلايا الجدارية في الفطريات الخيطية. اختبارات تتبع الكثرة تسمح بتناول العديد من الاسئله البيولوجية المتعلقة بالدراسة العامة لندره الخلايا التي يجب معالجتها3. لهذا ، يتم تسجيل التعريب والسرعة والخلافة من المقصورات الملونة علي أضافه صبغه FM بواسطة المجهر الزمني الفاصل والكمية مقارنه بين سلالات الفطرية اختبار4. يرسم جدار الخلية الاصباغ الحدود الخارجية للخلية والسماح بتتبع الاحداث الموفوجينيه ، بما في ذلك الاستقطاب خوطي tip النمو2، خوطي المتفرعة5، خوطي فيوجن6،7 وتشكيل الحاجز8. وعلاوة علي ذلك ، فانها تسهل القياس الكمي لترسب الجدار الخلوي الموضعي وتحديد العيوب اثناء التكوين الحيوي لجدار الخلية9. لان المعرفة التفصيلية للخصائص البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية لأي علامة الفلورسنت هو شرط أساسي لنجاحها في تطبيق المجرية ، وتلخص هذه الخصائص لأول مره لصبغات سته وارده في هذه المقالة.
غشاء الاصباغ الانتقائية FM (فاي ماو) الاصباغ styryl هي جزيئات البرمائيات الصغيرة التي لا يمكن ان تمر من خلال المنتسبين ولكن بعكس النشرة الخارجية من الدهن الاغشيه البيولوجية10. فهي تقريبا غير فلورية في محلول مائي ، ولكن تصبح الفلورسنت بشكل مكثف علي التكامل غشاء البلازما ، وتوليد ممتازة اشاره إلى الضوضاء (S/N)-النسب11. هذه الخصائص تجعلها مناسبه بشكل مثالي لتصور غشاء البلازما وديناميكيات عضيه داخل الخلايا ، بما في ذلك تتبع اندو-وكثرة المحببات12. الأخضر-الفلورسنت FM 1-43 والأحمر-الفلورسنت FM 4-64 هي الأكثر استخداما علي نطاق واسع علامات غشاء الفلورسنت لهذه الأغراض. المشبكان C4 و سينابتوريد C2 هما جزيئات عامه من الموردين البديلة التي يمكن استخدامها بالتبادل بدلا من FM 1-43 و FM 4-64 ، علي التوالي.
الاصباغ styryl تتالف من ثلاثه المناطق الهيكلية الرئيسية: (1) الذيل محبه للدهون الذي يسهل إدخال الصبغة في الطبقة الدهنية ، (2) الاساسيه فلوكوفيري التي تحدد الخصائص الطيفية للصبغة وتتكون من حلقتين العطرية متصلة من قبل واحد إلى ثلاثه سندات مزدوجة ، و (3) رئيس هيدروفيلييك مشحونة إيجابيا يمنع الادراج الكامل وتخلل الصبغة من خلال الغشاء (الشكل 1a).
ويعد الذيل محبه للدهون ، واعلي هو هيدروفوبيسيتي صبغ التالي تقارب ملزمه لغشاء ، ولكن الأقل هو الذوبان في الماء والغشاء معدل دي تلطيخ. التالي ، مختلف المتغيرات FM صبغ تنتج ديناميات تلطيخ مختلفه وأنماط. هيدروفوبيسيتي اعلي من 1-43 FM الذيل C4 يوفر اشاره فلوري اقوي وأكثر استقرارا في اغشيه البلازما والعضوية الداخلية أسرع من أقصر C2-الذيل FM 4-64, عند تطبيقها في تركيزات متساوي (الشكل 2).
والاهم من ذلك ، فان معدلات الاقتران/التفكك الثابتة والعالية لكل من صبغات FM11 مع متوسط أوقات الاستبقاء من 1 إلى 6 ثانيه لكل جزيء صبغ فردي13 تقلل من فرص التعطيل الموضعي لوظيفة الغشاء ، علي سبيل المثال ، من خلال تعديل سيوله الغشاء أو التفاعل الدائم القسري للبروتينات. هذا هو علي الأرجح السبب الرئيسي لماذا يمكن استخدام هذه الجزيئات والاصباغ الحيوية. ومع ذلك, تركيزات صبغ fm أعلاه 50 μM هي سامه للفطريات والخلايا النباتية2,14, والادله من قبل-2 التبغ بروتوبليازيات يشير إلى ان أكثر من 20 ميكرومتر fm صبغ يؤدي إلى تشبع غشاء البلازما14. التالي ، فانه من المستحسن عدم تجاوز هذا الحد ، وخاصه نظرا لحقيقة ان التصوير الممتاز قد تحقق مع اقل من 2-5 μM15،16.
ومن الجدير بالاهتمام ان الخواص الطيفية لاصباغ FM تختلف اختلافا كبيرا تبعا للبيئة المجهرية الغشائية الخاصة (التي تم استعراضها14). عموما ، تختلف أطياف الاثاره والانبعاثات من الاصباغ FM في حلول المذيبات النقية (كما هو منصوص عليه عاده في معلومات المنتج) بشكل كبير من ذلك في البيئات الخلوية ويمكن ، في معظم الحالات ، لا يمكن استشارتها مباشره لاختيار إعدادات التصوير الخلية الحية. الاثاره/الانبعاثات ماكسيما من FM 1-43 و FM 4-64 ، علي سبيل المثال ، تصبح الأزرق-تحولت من قبل 37/46 nm و 43/64 nm ، علي التوالي ، عندما ملزمه إلى الاغشيه الفطرية بالمقارنة مع حلولها في الميثانول (الجدول 1).
أساسيات كسر الأرض لاستخدام fm 4-64 و fm 1-43 لتتبع غشاء البلازما, اندو-/الندرات وديناميكيات عضيه, بما في ذلك سبيزنكربر والميتوكوندريا, وقد تم بالفعل موثقه بشكل شامل لمجموعه واسعه من الأنواع الفطرية الخيطية سابقا2,4,17,18,19. ويصور إعدادات التصوير الموصي بها لكل من الاصباغ FM التي تعمل في مختلف الأنواع الفطرية الخيطية في الشكل 1B. غير ان القيود التقنية المفروضة علي المعدات المتاحة أو الظروف الخلوية والتجريبية الخاصة ، مثل متوسط الثقافة أو درجه الحموضة أو درجات الحرارة ، قد تتطلب بعض التعديلات. لحسن الحظ ، الاصباغ FM تعمل علي نطاق واسع الطيفية ، ويتم تحقيق نتائج جيده جدا التصوير عن طريق مثيره FM 1-43 مع 514 nm أو FM 4-64 مع 488 nm. التالي ، يجب تحديد إعدادات التصوير الأمثل بشكل فردي لكل نوع نموذج والتطبيق المقصود.
التحول الكبير في ستوك من أكثر من 135 nm من FM 4-64 يسمح ممتازة ، والتصوير المشترك في وقت واحد مع الفلوروبيورس ينبعث منها الضوء الأخضر. وكثيرا ما يتم استغلال هذا لتقييم ديناميات التعريب داخل الخلايا من البروتين الفلوري الأخضر (gfp)-المسمي البروتينات الانصهار بالنسبة لغشاء البلازما والمسار اندوسيتيك9,20.
خليه الاصباغ الانتقائي الجدار Calcofluor الأبيض M2R (CFW) ، وتسويقها أيضا باسم منير الفلورسنت 28 ، هو علي الأرجح الصبغة الفلورية الأكثر شهره المستخدمة لوصمه عار جدران الخلايا من البكتيريا والفطريات والطحالب والنباتات العالية والحشرات. تستخدم في البداية كعامل تبييض الضوئية في صناعه الورق والنسيج والمنظفات ، وقد تحققت فوائدها للتشخيص السريري للعدوى الفطرية في وقت مبكر في21،22. لان [كفو] [اينتركليتس] بشكل لا رجعه في ال [شتين] [تشتين] سلسله يزعج هو طبيعيه [تشتين] [ميكروفيريل] تجميع اثناء خليه جدار [بيوجينيسيس] بذلك يلد خليه جدار إجهاد23. هذا بدوره بتشغيل اليه إصلاح تلف جدار الخلية مما يؤدي إلى ارتفاع محليا ترسب جدار الخلية نتيجة غلوكان والتين synthase تفعيل24,25. هذه الظاهرة يمكن ان تحدث مع اي صبغه تعمل بواسطة ملزمه بشكل ثابت إلى البوليمرات جدار الخلية ، هو تركيز الاعتماد وهو الأكثر وضوحا في خوطي نصائح التي تمثل الأكثر غزارة في النمو التالي الأجزاء الأكثر حساسية من ميسليوم (الشكل 3). وقد تم مؤخرا تقديم ملخص شامل للآلات الجزيئية التي تستجيب للاضرار بجدار الخلية26.
يمكن ان يؤدي الصبغة الزائدة في تركيبه مع السمية الضوئية إلى تحلل الخلايا السريعة من مقصورات خوطي (فيلم 1). ومع ذلك, زيادة الحساسية لتركيزات صبغ التي هي "حيوية" في نوع البرية يمكن استغلالها لتحديد العيوب في التركيب الحيوي جدار الخلية من الجينات فقدان الوظيفة المسوخ9. ل cfw والكونغو الأحمر (CR) ، واخر تلوين المنسوجات المعروف أيضا باسم الأحمر المباشر 28 والعاملين بوصفها α-وبتا-كيتين-محدده جدار الخلية وصمه عار للفطريات والحشرات27،28، وقد تم تحديد تركيزات عتبه التي تحفز بقوة synthases مع > 60 μm cfw و > 70 μm CR ، علي التوالي ، في حين ان تركيزات <15 μM من صبغ اما لا يغير أو يمنع نمو الفطرية29،30،31. وضع هيكي وآخرون هذا التركيز عتبه CFW في 25 μM2. ولذلك ، فانه من المستحسن استخدام تركيزات صبغ ≤ 5 μM لاستبعاد الآثار المرتبطة بالإجهاد وضمان استخدام هذه الجزيئات كما حقا "الاصباغ الفلورية الحيوية"2،32. ينطبق هذا أيضا علي سولوفينيل فلافون 7GFE 500 (SPF) و Pontamine Fast القرمزي 4B (PFS) ، مرادفا ل86 الأصفر المباشر والأحمر المباشر 23 ، علي التوالي ، واثنين من الاصباغ الأخرى الخلية المفيدة الجدار الذي تم الإبلاغ عن تطبيق للفطريات للمرة الاولي أكثر من عقد من الزمان33. ولكن علي الرغم من خصائصها الطيفية ملحوظ34،35، واستخدام كل من الاصباغ منذ ذلك الحين كان محدودا جدا36،37. كما هو مبين سابقا ل 1.5 μM CFW2, 2 μm SPF كافيه لحل ديناميات جدار الخلية في ظل الظروف الاصليه مع دقه عاليه جدا الزمنيه (فيلم 2). يمكن الحصول علي نفس النتائج مع 2 μM CR أو PFS.
معا ، تتكون هذه الاصباغ الاربعه ، CFW ، SPF ، PFS و CR ، من مجموعه من علامات الفلورسنت المحددة بجدار الخلية والتي تغطي تقريبا الطيف الضوئي الكامل للانبعاثات المرئية (400 – 700 نانومتر) المستخدم في المجاهر الفلورية الحديثة (الشكل 4). الزيادة الكبيرة في كثافة مضان علي الربط إلى البوليمرات جدار الخلية المتاصله في كل أربعه ويولد ممتازة S/N-النسب. هذا بدوره يسمح للحفاظ علي تركيزات صبغ والاثاره كثافة الضوء منخفضه جدا ويسمح لأداء الخلية تلطيخ الجدار كما "جرعه منخفضه" الحية الخلية تقنيه التصوير2. لان هذه الاصباغ جدار الخلية هي غشاء البلازما غير منفذه ، فانها تعمل في وقت واحد كما البقع الحية/الميتة. وتجدر الاشاره إلى انه نظرا لأطيافها الضوئية الواسعة للغاية ، فان بعض القيود المتعلقة بخصائص التصوير المشترك لمركب CFW وعامل الوقاية من الشمس مع الفلوروبيورس الأخرى تحتاج إلى النظر فيها بعناية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BRAND cell counting chamber</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR718005</td>
			<td>Thoma format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White M2R</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3543</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td>water immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td>water immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo Red</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6277</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>8,36,73,230</td>
			<td>organic solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 1-43</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6814</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6689</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>Rettberg</td>
			<td>1340691030</td>
			<td>3 mm glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BB02400600A113MNT0</td>
			<td>24 x 60 # 1 glass cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506353</td>
			<td>glycerol immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 Meta</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Minimal Medium</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td>generic fungal growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-slide 8-well</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>ibiTreat #1.5 polymer coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>polyester filtration material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>8,21,472</td>
			<td>92 x 16 mm culture dish w/o cams</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td>transparent gelling agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440762-9904-000</td>
			<td>oil immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pontamine Fast Scarlet 4B</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>212490</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>213400</td>
			<td>fungal growth medium for T. atroviride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Broth (PDB)</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>254920</td>
			<td>fungal growth medium for T. atroviride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706</td>
			<td>1.5 mL SafeSeal tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>5518016</td>
			<td>Cutfix sterile scalpel #23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>6,25,54,502</td>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solophenyl Flavine 7GFE 500</td>
			<td>CIBA</td>
			<td>1485385V6</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynaptoGreen C4</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>70020</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynaptoRed C2</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>70021</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe membrane filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>723-9945</td>
			<td>0.45 &#181;m SFCA syringe filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td>Leica</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vogel&#39;s Minimal Medium (VMM)</td>
			<td>FGSC</td>
			<td>Fungal Genetics Stock Centre</td>
			<td>fungal growth medium for N. crassa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging of filamentous fungi

تطبيق الغشاء وجدار الخلية الاصباغ الفلورية الانتقائية لتحليلات التصوير الخلية الحية من ديناميات عضيه في الخلايا الفطرية بدات قبل عقدين من الزمن ، ومنذ ذلك الحين لا تزال تسهم إلى حد كبير في فهمنا للفطريات الفطرية نمط الحياه. تقدم هذه الورقة دليلا عمليا لاستخدام اثنين من الاصباغ الغشاء FM 1-43 fm 4-64 والبقع جدار الخلية الاربعه Calcofluor الأبيض M2R ، سولوفينيل فلافون 7GFE 500 ، Pontamine سريع القرمزي 48 والكونغو الأحمر. وينصب التركيز علي تطبيق الجرعات المنخفضة الخاصة بهم للتاكد من التلطيخ الخالي من الحرفية ، وخصائص التصوير المشترك ، وتقييمهم الكمي. الطرق المعروضة قابله للتطبيق علي جميع العينات الفطرية الخيطية التي يمكن اعدادها بالطرق الموصوفة. ويمكن ان تكون نهوج التلطيخ الاساسيه بمثابه نقاط انطلاق للتكيف مع الأنواع التي قد تتطلب ظروفا مختلفه للزراعة. أولا ، يتم استعراض الخصائص البيوفيزيائية والبيوكيميائية لان فهمها ضروري لاستخدام هذه الاصباغ كبقع فلورية حيوية حقا. ثانيا ، يتم عرض البروتوكولات خطوه بخطوه التي بالتفصيل اعداد مختلف أنواع العينات الفطرية للتصوير بالخلايا الحية الفلورسنت. وأخيرا ، توضح التجارب التي أجريت علي سبيل المثال النهج المختلفة لما يلي: (1) تحديد العيوب في التنظيم المكاني-الزماني لندره المحببات في المسوخ الجينية ، (2) تميز نسبيا المشتركة والمتميزة لتوطين البروتينات المستهدفة المسمية GFP في مسار الخلايا العصبية ، (3) تحديد العيوب جدار الخلية الخلقية في متحولة وراثيه ، و (4) رصد التكوين الحيوي جدار الخلية في الوقت الحقيقي.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi at JoVE.com

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

الاصباغ الفلورية الحيوية هي أدوات أساسيه لتحليلات التصوير بالخلايا الحية في بيولوجيا الخلايا الفطرية الحديثة. هذه الورقة تفاصيل تطبيق الاصباغ الفلورية الثابتة والمعروفة لتتبع ديناميات غشاء البلازما ، اندو-/الندرات والخلايا الجدارية تخلق في الفطريات الخيطية.

تطبيق غشاء وجدار الخلية الاصباغ الفلورية الانتقائية لتصوير الخلايا الحية من الفطريات الخيطية

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

غشاء وجدار الخلية الأصباغ الفلورية الانتقائية هي أدوات هامة لتحليل ديناميات العضية والخلايا الفطرية الحية. توفر بروتوكولاتنا الخلفية النظرية الأساسية والمبادئ التوجيهية العملية لتطبيق مجموعة مختارة من هذه الأصباغ كبقع حيوية حقًا. النقطة الرئيسية لهذا هو استخدام تركيزات صبغ منخفضة جدا التي لا تسبب التحف الخلوية المتعلقة التشبع أو سمية الصبغة في حين لا تزال توفر إشارة جيدة إلى نسب الضوضاء ل عالية الجودة، على المدى الطويل التصوير الخلية الحية.مع زملاء من قسم الطب النووي في الجامعة الطبية، استخدمنا مؤخرا هذه التقنيات تلطيخ لتطوير نهج جديد لتشخيص الصورة الموجهة من aapergillosis. كانت القدرة على مراقبة الأغشية والخلايا هياكل الجدار في الوقت الحقيقي حاسمة لتحديد ديناميات امتصاص مركب المخدرات التجريبية. لبدء هذا الإجراء، أولا الحصول على زراعة سابقة معدة.استخدام مشرط معقم لقطع كتلة أجار الصغيرة التي تحمل النخاع غير sporulating من حافة مستعمرة من قبل زراعة. ضع كتلة أجار في وسط لوحة متوسطة جديدة صلبة لتطعيم الثقافة التجريبية. احتضان الثقافة التجريبية وفقا للمرحلة التنموية المزمع احتضانها.إعداد العينة هو دقيق إلى حد ما والتحسين من إعدادات الحصول على الصور هو معقد نوعا ما. عرض مرئيّة من كلا إجراءات يصحب مع شرح لفظيّة إلى حدّ بعيد يسهّل قابلية تكرار. لتركيب العينات، والحفاظ على نظيفة 24 من 60 ملليمتر غطاء زجاجي زلة جاهزة وإضافة 18 ميكرولترات من السائل الحد الأدنى من حل الملح المتوسطة أو الفسيولوجية على المركز.إضافة اثنين microliters من 20 صبغة 20 صبغة صغيرة مستعدة حل العمل إلى السائل في وسط زلة الغطاء ومزيج جيد عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات مع تجنب إنتاج فقاعات الهواء. باستخدام مشرط نظيف ، قطع عينة 15 في 15 ملليمتر من محيط المستعمرة ووضعها عموديا بجانب قطرة المتوسطة على زلة الغطاء. استخدم المشرط لدعم الحافة العليا للكتلة وإصبعك ليمسك الجانب الخلفي للكتلة في مكانه.ثم، ببطء خفض الجانب تحمل الميسيليوم على السائل. جبل العينة المعدة على مرحلة المجهر. أولاً، ضبط إعدادات الحصول على الصور الأساسية لالتقاط الديناميات الدائمة في hyphae الفردية كما هو موضح في بروتوكول النص.للحصول على المقايسات امتصاص endocytosis، راجع الشكل الأول والجدول واحد من بروتوكول النص لتحديد أفضل الإثارة وإعدادات الانبعاثات لFM 143 أو FM 464 التي تتوفر على نظام المجهر وضبط هذه الإعدادات في النظام وفقا لذلك. ابدأ تسجيل الصور باستخدام الإعدادات المعدلة مسبقًا وقيّم النتائج. ثم، تحسين إعدادات الحصول على الصورة إلى الدقة المكانية والزمانية المطلوبة لالتقاط جانب من غشاء البلازما أو ديناميات بطانة الرحم تركز التجربة على.لديناميات جدار الخلية، والتشاور مع الشكل الرابع والجدول واحد من بروتوكول النص لتحديد أفضل الإثارة وإعدادات الانبعاثات لصبغ جدار الخلية التطبيقية وضبط الإعدادات على نظام المجهر وفقا لذلك. ابدأ تسجيل الصور باستخدام الإعدادات المعدلة مسبقًا وقيّم النتائج. ثم، تحسين إعدادات الحصول على الصورة إلى القرار المكاني والزماني المطلوب لالتقاط جانب من morphogenesis جدار الخلية تركز التجربة على.بالإضافة إلى مجرد تصور العمليات الخلوية ، والتصوير الخلية الحية يسمح استخراج المعلومات الكمية من البيانات المسجلة. في مثال على مقايسات 464 FM امتصاص، تزرع عينات الفطريات كمستعمرات والتي شنتها طريقة كتلة أجار المقلوبة. حددت الأقوال عيوبًا في التنظيم الزقاقي الزماني للاندوسيت في حذف الجينات والمتحولات المفرطة في التعبير عن المسوخ من البروتين الفطري المحدد SFP 2 من trichoderma atroviride.تظهر هنا أمثلة على 464 FM شارك في تلطيخ بروتينات الانصهار الفلورسنت التي تستهدف مقصورات endocytic. يتم استخدام هذا التلطيخ المشترك لربط التوزيع دون الخلوي لبروتيني الفلورسنت الأخضر المعززين الموسومين عبر السيمبران، SFP 2 و GPR 1، إلى المسار endocytic في trichoderma atroviride. مثال على FM 464 شارك في تلطيخ لتحديد الاختلافات المورفوجينيك يبين أن هذا التلطيخ المشترك يسمح بمزيد من العلاقة بين ديناميات التعريب دون الخلوية من البروتين المعقد BUD-6 القطبية المسمى بشكل كبير لإنهاء بعض العمليات المعتمدة على الاتجار مثل تشكيل سيبتا ونمو طرف الواصلة المستقطب.كما أنه يميز الاختلافات في التنظيم دون الخلوية والهندسة المعمارية الواصلة بين النوع البري وسلالات متحولة من الكريسا neurospora. ممثل خلية الجدار الملون يظهر أن خصائص التفاعل المختلفة من الكالفورو الأبيض، solophenyl فلافين، والكونغو الحمراء مع البوليمرات جدار الخلية تسليط الضوء على الاختلافات المورفونيكية بين دلتا SFP 2 متحولة وسلالة نوع البرية من trichoderma atroviride. زيادة ضغط جدار الخلية التي تسببها تركيزات صبغ مرتفعة يحدث بسرعة أكبر وأكثر وضوحا في متحولة بالمقارنة مع نوع البرية.وبالإضافة إلى ذلك، فإن نفس الصور تسمح بالتقويم الكمي للاختلافات المورفوجينية فيما يتعلق بقطر الواصلة والمسافة الحاجزية بين كل من السلالات. رصد تمثيلي في الوقت الحقيقي من الخلية الجدار البيولوجي يشير إلى أن تركيز منخفض جدا calcofluor الأبيض يمنع تشبع جدار الخلية مع جزيئات الصبغة ويسمح الرصد الحقيقي الكمي من التركيب الحيوي جدار الخلية. وهذا يكشف عن أن ترسب مادة جدار الخلية الجديدة ليست موحدة، ولكن يستجيب بسرعة كبيرة للضغوط الجسدية المترجمة الناتجة عن التشريد النسبي لخلية واحدة على مرفق خلية إلى خلية قبل أن الوهن في الاعصاب في البور.أقل هو أكثر. استخدام صبغة أقل قدر ممكن لمنع تدخل علامة الفلورسنت مع العمليات الخلوية. وبعد هذا الإجراء، يمكن إجراء عملية استعادة دقيق بعد تجارب تبييض الصور لتحديد مقدار حركة النقل والنشوء البيولوجي.إن الإدخال الرائد للغشاء وجدار الخلايا الذي يلطخ الفطريات الخيطية في بداية الألفية أحدث ثورة في الطريقة التي ننظر بها إلى الفطريات. يمكن أن يسبب الكالكوفلور الأبيض تهيج العين وهو سرطانية مصنفة. الكونغو الحمراء هو سرطاني ومسخ، لذا يرجى ارتداء العين وحماية الجلد عند التعامل مع هذه الأصباغ.

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

وسم الخلايا الجذعية مع الأصباغ نيون للمنظمات غير الغازية مع الكشف عن التصوير الضوئي

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

انتقائية وسمها بروتينات سطح الخلية باستخدام CyDye DIGE ملونات فلور الحد الأدنى

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

يعيش التصوير خلية من طراز F - أكتين حيوية عن طريق الميكروسكوب الرقطة نيون (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

الفلورسنت وصفها من COS - 7 تعرب عن البروتينات الانصهار SNAP - شعارا لتصوير الخلايا الحية

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

يعيش التصوير خلية من الأحداث الالتهام الذاتي المبكر: Omegasomes وما بعدها

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

موافقات لهذه العملية من G البروتين انتقائية تقاس باستخدام الحنق مجسات في لايف تعليق خلية التألق الفحص

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

دراسة نظام لمراقبة الجودة من البروتين<em&gt; D. discoideum</em&gt; عن طريق درجة الحرارة التي تسيطر التصوير الخلية الحية

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

تصوير الخلايا الحية من تحبيب الصفائح الدموية والإفراز تحت التدفق

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

فائقة الدقة تصوير الخلايا الحية من الهياكل دون الخلوية

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...