Name: application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging of filamentous fungi
Uploaded: 2019-11-28T15:00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi at JoVE.com

Der er grund til at takke den tyrolske videnskabs fond (TWF) for at yde Grant #256524 til AL, til Wiens videnskabs-og teknologi fond (WWTF) for at yde Grant #LS13-086 til SZ, og til publikations fonden på universitetet i Innsbruck for at understøtte åben adgang publikation. Forfatterne takker også Department of Zoology of The University of Innsbruck for at levere Leica TCS SP5 II confokal laser scannings mikroskop.

1. fremstilling af svampe prøver
<ol><li>Svampe-præ-kulturer<ol>
<li>Inokulere den ønskede stamme på et passende solidt agar medium, såsom kartoffeldextrose agar (PDA) for Trichoderma atrovirid eller Vogels minimale medium (VMM) for neurospora crassa. Tilføj et passende markerings mærke, når du arbejder med transformant-stammer.</li>
		<li>Inkuber forkulturen ved organismens optimale temperatur. For eksempel, T. atrovirid ved 25 °C og N. crassa ved 30 °c og 12 timer/12 timer lys/mørke cyklusser, indtil en sporulerende mycelium har udviklet sig, men endnu ikke nået kanten af pladen. På en standard størrelse Petri skål (9,2 cm Ø), dette tager Wild-type T. atrovirid på 4 – 6 dage gennemsnit, mens N. crassa Wild type når dette stadie efter 3 – 4 dage i gennemsnit.</li>
	</ol></li>
	<li>Dyrkning af svampe kolonier<ol>
<li>Ved hjælp af en steril skalpel skæres en lille 3 mm x 3 mm agar blok transporterer ikke-sporulerende mycelium fra koloni kanten af præ-kultur.</li>
		<li>Agar blokken placeres i midten af en frisk solid medium plade for at inokulere forsøgs kulturen.</li>
		<li>Forsøgs kulturen skal inkubateres efter den udviklingsfase, der skal undersøges. For eksempel, den vild-type T. atrovirid kræver 20 – 22 timer ved 25 °c i mørket til at udvikle kolonier på omkring 2 cm diameter på PDA, mens den vilde-type N. crassa når koloni diametre på omkring 4 cm efter 14 – 16 h inkubation ved 30 °C i mørke på VMM. Bemærk: inkubation i mørket forhindrer dannelsen af pigmenter, der kan indføre Auto luorescens. For at eliminere medium baggrunds fluorescens fra den eksperimentelle kultur, Udskift agar med 1,5% w/v af en transparent solidifying agent (Se tabellen over materialer), og ethvert komplekst medium med en defineret minimal medium.</li>
	</ol></li>
	<li>Dyrkning af solide spire kulturer<ol>
<li>Brug 5 mL steril fysiologisk saltopløsning (0,9% w/v NaCl) til at høste nålens sporer fra præ-kultur pladen og Saml den resulterende spore suspension i en 15 mL skruelåg.</li>
		<li>Bland sporesuspensionen godt ved kraftig vortexning og derefter filtrere den over en 1 cm x 5 cm strimmel af sterilt filter stof (Se tabellen af materialer) let fyldt ind i en 1 ml pipettespids (både samlet og autoklave på forhånd) i et frisk sterilt rør.</li>
		<li>Find spore tætheden med et celle tælle kammer og Forbered en 1 x 107 celler/ml spore suspension med fysiologisk saltopløsning. Bemærk: spore affjedringen kan opbevares ved 4 °C i op til to uger.</li>
		<li>Forbered en Petri skål i standard størrelse (9,2 cm Ø) med 20 mL fast medium, og tilsæt 15 – 20 sterile glasperler (3 mm Ø) på toppen.</li>
		<li>Pipetten 200 μL af spore ophænget på medium pladen, og Distribuer cellerne jævnt over hele pladen ved at ryste forsigtigt. Saml glasperler i et bæger med 70% ethanol til genbrug.</li>
		<li>Forsøgs kulturen skal inkubateres efter den udviklingsfase, der skal undersøges. For eksempel, T. atroviride vildtype kræver 5 – 6 h ved 25 ° c i mørket for at udvikle nåle-urskive GERMLINGS på PDA, mens N. crassa Wild type udvikler nåle dial germlings efter 3 – 4 h inkubation ved 30 °C i mørke på VMM. Bemærk: for at eliminere medium baggrunds fluorescens fra forsøgs kulturen erstattes agar med 1,5% w/v af et gennemsigtigt solidifying middel og ethvert komplekst medium med et defineret minimalt medium.</li>
	</ol></li>
	<li>Dyrkning af flydende spirings kulturer<ol>
<li>Fyld 190 μL flydende kulturmedium ind i hver brønd af en 8-brønd Chambered mikro-slide.</li>
		<li>Der tilsættes 10 μL af en 1 x 107 celler/ml spore opløsning (tilberedt i trin 1.4.1 – 1.4.3) og blandes ved forsigtigt at pipettere op og ned et par gange. Det resulterende samlede antal celler er 1 x 105 pr. brønd.</li>
		<li>Forsøgs kulturen skal inkubateres efter den udviklingsfase, der skal undersøges. For eksempel, den vilde type T. atrovirid kræver 5 – 6 h ved 25 ° c i mørket for at udvikle nåldial germlings i kartoffel dextrose BOUILLON (FBF), mens Wild type N. crassa udvikler nåle-og kimplanter efter 3 – 4 h inkubation ved 30 °c i mørke i flydende VMM.</li>
	</ol></li>
</ol>2. klargøring af farvestof arbejdsløsninger
<ol><li>For at sikre fuld Opløselighed af hvert farvestof, Forbered 2 mM stamopløsninger i dimethylsulfoxid (DMSO) ved at tilføje det passende beløb (Se nøjagtige vægte i tabel 1) til 1 ml 100% DMSO og bland godt ved vortexing. Forsigtig: Sørg for at tage DMSO fra en septum-forseglet flaske; Det bør være en klar transparent væske. Ved kontakt med luft bliver DMSO brun – sandsynligvis på grund af oxidering af spor urenheder – og kan påvirke cellevæksten eller farve farvning negativt.</li>
	<li>Filter Steriliser stamopløsningen gennem et 0,2 μm sprøjte membranfilter i et frisk, sterilt 1,5 mL reaktions slange. For at minimere farvestof blegning, wrap røret i aluminiumsfolie. Bemærk: farvestof stamopløsningen kan aliciteres i mindre volumener for at undgå optønings-/fryse cyklusser og opbevares ved 4 °C i flere måneder.</li>
	<li>Tilbered en 20 μM vandig farvningsopløsning ved at opløse 2 μL Dye stamopløsning i 198 μL sterilt destilleret vand i et frisk, sterilt 1,5 mL reaktions slange. For at minimere farvestof blegning, wrap røret i aluminiumsfolie. Bemærk: farveprøve opløsningen skal tilberedes frisk på forsøgs dagen.</li>
	<li>Under prøve montering (se punkt 3), vil den farverige arbejdsopløsning være standardligt fortyndet 1:10, hvilket resulterer i en endelig farve koncentration på 2 μM og 0,1% w/v endelig DMSO-koncentration. Bemærk: valg af forskellige fortyndingsfaktorer ved blot at ændre volumen forholdet mellem farvestof arbejdsopløsning og monterings væske, gør det nemt at tilpasse den ønskede endelige farvestof koncentration. Forsigtig: for at undgå uønskede virkninger som følge af farve-eller DMSO-toksicitet bør fortyndingsfaktoren ikke falde til under 1:4 for at resultere i maksimale endelige koncentrationer af 5 μM farvestof og 0,4% w/v DMSO. Højere farvestof koncentrationer vil hurtigt mægle systemet og forhindre pålidelig signal kvantificering, hvorimod mere end 0,5% w/v (≥ 62,5 mM) DMSO kan forringe celle udviklingen38.</li>
</ol>3. prøveforberedelse til mikroskopi
<ol><li>Stikprøver fra svampe kolonier (trin 1,2) eller fast germling kulturer (trin 1,3) ved den inverterede agar blok metode.<ol>
<li>Hold en ren 24 mm x 60 mm glas Cover slip (#1 = 0,13 – 0,16 mm tykkelse) klar og tilsæt 18 μL flydende minimal medium (VMM eller M9) eller fysiologisk saltopløsning på midten.</li>
		<li>Tilsæt 2 μL af 20 μM-arbejdsopløsningen til 18 μL væske, og bland godt ved pipettering op og ned flere gange, samtidig med at produktionen af luftbobler undgås. Bemærk: når man arbejder med flere prøver, er det tilrådeligt at tilberede en masterblanding af væske-farvestof opløsning for alle for at sikre lige farve koncentration i hele eksperimentet.</li>
		<li>Med en ren skalpel skæres en 15 mm x 15 mm prøve fra periferien af kolonien eller fast germling kultur og placerer den lodret ved siden af medium drop på Cover sedlen.</li>
		<li>Ved hjælp af skalpel til at understøtte den øverste kant af blokken og en finger til at holde bagsiden af blokken på plads, langsomt sænke siden transporterer mycelium eller germlings på væsken. Prøven er nu klar til overførsel til mikroskop stadiet. Forsigtig: det er vigtigt at gøre dette langsomt og meget omhyggeligt for at minimere mekanisk belastning af cellerne og for at undgå luftbobler, der er fanget mellem prøve og følgeseddel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monter de flydende germling kulturer fra trin 1,4. Bemærk: de fleste bekvemt, flydende germling kulturer i Chambered mikro-brønd slides kan direkte overføres og yderligere manipuleret på mikroskop scenen.<ol>
<li>Tilsæt 22 μL farvestof-arbejdsopløsning til 200 μL flydende medium for at resultere i standard endelige koncentrationer af 2 μM farvestof og 0,1% w/v DMSO. Bemærk: flydende germling kulturer har den store fordel, at fluorescerende farvestoffer (eller andre kemikalier, såsom hæmmere) kan tilsættes på ethvert ønsket tidspunkt af eksperimentet, også under optagelsen. I så fald skal der udvises særlig omhu for at administrere væskedråber meget langsomt for ikke at forstyrre cellerne. System vibrationer og brownian motion måske allerede indføre nogle celle bevægelse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. mikroskopi af levende celler
<ol><li>Juster de grundlæggende indstillinger for billed anskaffelse. Følgende indstillinger for billed anskaffelse gør det muligt at fange farvnings dynamik i individuelle hyphaer og gælder for begge af følgende assays<ol>
<li>Anvend 5 – 10% laser effekt på 20% af enhedens fulde udgangseffekt.</li>
		<li>Brug en plan APO 60x – 63x glycerol eller vand nedsænkning mål med en høj numerisk blænde ≥ 1,2.</li>
		<li>Begræns billedområdet til omridset af hyfer ved at angive en billedstørrelse på 1024 x 256 pixels og ved hjælp af en optisk zoomfaktor på 2 – 3.</li>
		<li>Brug tovejs scanning med 400 Hz. Juster størrelsen på pinhullet til 1 luftig enhed.</li>
		<li>Indstil Gain af den mest følsomme detektor til 100%.</li>
		<li>For time omgange optagelse, start billed erhvervelse med en ramme hver 15 s for at tillade en rimelig tidsmæssig opløsning uden at producere farve blegning eller fotostress.</li>
		<li>For 3D-optagelse skal du indstille den øvre og nedre rumgrænse til kanten af hyfer-og Space Optical-afsnittene 1 μm for at tillade en fornuftig rumlig opløsning. Bemærk: på grund af den hurtige vækst af hyphae, høj rumlig opløsning i Z-aksen er ofte blevet ofret for høj tidsmæssig opløsning i X/Y-aksen eller den anden vej rundt. Kun meget moderne confokal Laserscanning mikroskoper er hurtig nok til at opfylde begge krav.</li>
	</ol></li>
	<li>Endocytosis optagelses assays<ol>
<li>Se figur 1 og tabel 1 for at finde de bedste indstillinger for excitation/emission for FM 1-43 og/eller FM 4-64, der er tilgængelige på mikroskopi systemet, og Juster i overensstemmelse hermed. Bemærk: med den anbefalede 2 μM-koncentration er inkorporering af FM-farvestof i plasma membranen øjeblikkelig i normale raske celler. Hele processen fra indledende plasma membranfarvning til farvestof udseende i rørformede vakuoler er normalt afsluttet inden for 30-45 minutter ved stuetemperatur. Forøgelse af FM-farve koncentrationen øger S/N-forholdet og giver dermed højere kontrast billeder hurtigere. Men det fremskynder også mærkningsprocessen, hvilket gør det vanskeligere at differentiere den kronologiske rækkefølge af organelle farvning.</li>
		<li>Start billede optagelse ved hjælp af ovenstående anbefalede grundlæggende billede erhvervelse indstillinger og evaluere resultaterne.</li>
		<li>Optimer billed erhvervelse indstillinger til den rumlige og tidsmæssige opløsning, der kræves for at fange det aspekt af plasma membran eller endokytose dynamik eksperimentet er fokuseret på.</li>
		<li>For eksempel, for at fange meget hurtig dynamik i X/Y, formindske den samlede billedstørrelse, billede kun et brændfly og øge scanningshastigheden til 1 fps. Hvis du ønsker en højere opløsning i Z-aksen, skal du formindske opløsningen i X/Y, formindske billedstørrelsen og formindske afstanden mellem optiske sektioner og 0,5 μm.</li>
	</ol></li>
	<li>Cellevæg dynamik<ol>
<li>Se figur 4 og tabel 1 for at identificere de bedste excitation/emission indstillinger for den anvendte cellevæg farvestof til rådighed på mikroskopi system og justere i overensstemmelse hermed. Bemærk: på grund af deres brede emissions spektre er CFW og SPF ikke velegnede til samtidige Co-Imaging med andre fluorophorer, overvejende GFP. Nogle restriktioner gælder endda for sekventielle Imaging tilgange med disse farvestoffer, og derfor skal optimeres individuelt.</li>
		<li>Start billede optagelse ved hjælp af ovenstående anbefalede grundlæggende billede erhvervelse indstillinger og evaluere resultaterne. Bemærk: med den anbefalede 2 μM koncentration, inkorporering af farvestof i cellen væggen er ikke nødvendigvis instant, men rimeligt hurtigt. Hele processen med septum dannelse, for eksempel, tager i gennemsnit omkring 5 – 7 min ved stuetemperatur20. Forøgelse af cellevæggen farvestof koncentration øger S/N-forholdet og dermed producerer højere kontrast billeder hurtigere. Men, det også hurtigt introducerer artefakter på grund af induceret cellevæg skade reparation.</li>
		<li>Optimer indstillinger for billed anskaffelse til den rumlige og tidsmæssige opløsning, der kræves for at fange det aspekt af cellevæg morfogenesis eksperimentet er fokuseret på, som skitseret i afsnit 4.2.3.</li>
	</ol></li>
</ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser og intet at afsløre.

Denne artikel fortsætter det banebrydende arbejde, der etablerede brugen af forskellige fluorescerende farvestoffer som vitale organelle markører for filamentøse svampe i begyndelsen af 2000 ' erne2,4,43, og forsøg på at diskutere de fotopysiske og celle biologiske egenskaber af FM-farvestoffer og udvalgte cellevæg farvestoffer i større detaljer end før. Især med hensyn til uønskede cellulære virkninger, såsom membran mætning eller cellevæg skader, der forekommer over visse farvestof koncentrationer. Hvad der tidligere er blevet betragtet som ikke-giftige på cellulært niveau er nu betragtes giftige på det molekylære niveau. Selv om disse virkninger kan være meget subtile og ikke direkte indlysende ved indlysende ændringer i organelle eller celle adfærd, enhver mulig interferens af farvestof ansøgning andet end visualisering skal minimeres for undersøgelsen af indfødte molekylære funktion. Heldigvis, forbedret følsomhed og Quantum effektivitet af moderne detektorer, såsom silicium lavine fotodiode detektorer (si-apd'er)44 eller airyscan område detektor45, lette brugen af endnu lavere farvestof mængder end før. Et andet centralt mål i artiklen er at eksemplificere Co-Imaging egenskaber af disse farvestoffer med andre fluorophorer, vigtigst af alt, de af GFP som den hyppigst anvendte fluorescerende protein i biologi. Dette bør støtte udformningen af billeddiagnostiske eksperimenter, der har til formål at korrelere den subcellulære lokalisering dynamik af fluorescerende fusions proteiner til dem af svampe cellevæggen, plasma membranen eller endo-og exocytose pathway osv.
Billeddannelse under naturlige og stressfri forhold er nøglen til erhvervelse af pålidelige data. Nogle praktiske overvejelser vedrørende kulturmedium og prøveforberedelse har til formål at give et udgangspunkt for at finde de optimale betingelser, der muliggør artefakt-fri, lang tids observation af sunde, ustressede celler med det højeste S/N-forhold muligt for en given prøve. Der er ingen universel måde at opnå pålidelige og meningsfulde Imaging resultater. Det er uløseligt forbundet med den tilgang, at biologisk variation af prøven, subjektivitet og forventninger i mikroskopist, samt billede efter behandling har betydelig indflydelse på data erhvervelse og tolkning, hhv. Derfor er den praktiske oplevelse af microscopist, hendes/hans intime viden om cellebiologi af svampen under undersøgelse, samt dygtige prøveforberedelse til at skabe betingelser som ' naturlig ' og uforstyrret som muligt i en lab indstilling, er altafgørende for at erhverve og evaluere billeddata, der sandfærdigt afspejler de undersøgte cellulære fænomener. Som en tommelfingerregel, forekomsten af uønskede bivirkninger af fluorescerende farvestoffer, der spænder fra den subtile og dermed ikke åbenbart synlig aktivering af plasma membran eller cellevæg re-modellering stress respons veje til den ligetil cytotoksiske induktion af celle autolyse, kan kun forebygges sikkert ved at anvende lave farvestoffer koncentrationer ≤ 2 μM.
Anvendelsen af fluorescerende farvestoffer er enkel, men deres særpræg er dårligt karakteriseret. En vigtig styrke ved at bruge fluorescerende farvestoffer er den forberedende enkelhed af forsøgsprotokoller. Dyrkning og prøveudtagning af svampen, tilsætning af farvestof (r), og montering på mikroskop scenen er (med praksis) ligetil. Justering af de grundlæggende billedbehandlings indstillinger, herunder excitation og emission bølgelængder, eksponeringstider, tidsforløb indstillinger osv., Følg simple biofysiske regler af mikroskopet og biologiske regler af de anvendte fluorescerende farvestoffer inde i cellerne. Tabel 1 har til formål at støtte identifikationen af den mest egnede farvestof eller farvekombination til forsøg. Desuden er fluorescerende farvestoffer rimeligt prissat, let tilgængelige med pålidelig høj kvalitet og dermed sikre meget reproducerbar anvendelse.
To store begrænsninger ved brug af membran eller cellevæg selektive fluorescerende farvestoffer er (ofte) begrænset kendskab til deres præcise farvnings egenskaber, som i de fleste tilfælde er ikke-specifikke på organelle og molekylært niveau, og deres koncentrationsafhængige uønskede bivirkninger. FM-farvestoffer er specifikke for lipidbilayers, der deltager i endo-og exocytose. Men netop hvilke subcellulære organeller bliver successivt mærket under de testede betingelser er ikke umiddelbart indlysende og kræver sammenligning af forskellige FM farvevarianter, og co-mærkning med yderligere organelle-specifikke markører. Præference for FM 1-43 for mitokondrie membraner, i forhold til FM 4-64, er et eksempel. Cell Wall selektive farvestoffer viser varierende specificitet for de tre store polymerer af svampe cellevæggen. CFW menes at være en ikke-specifik plet for β-glucaner og chitin, SPF menes at være mest selektive for β-1, 4-glucaner, og CR menes at være yderst selektiv for α-og β-chitiner. Oplysninger om den bindende specificitet af PFS til svampe cellevæg polysaccharider er i øjeblikket ikke tilgængelig. Det forhold, som svampe celle vægpolymer mest effektivt mærkes med i en given farve koncentration hos de svampearter, der undersøges, er ikke let at besvare, og anvendelsen af detaljerede målinger, som er erhvervet in vitro eller in vivo i andre organismer eller andre svampearter, skal overvejes meget nøje. Desværre, disse oplysninger er sparsomme og meget spredt i litteraturen35,42,46. Nyere optegnelser, der ville følge på tidligere undersøgelser33 for at give ny indsigt i de præcise farvning egenskaber af featured farvestoffer specifikt i svampe er i øjeblikket ikke tilgængelige.
Billedbehandlings kontrol er afgørende for at evaluere farvnings mønstre og cellulær respons nøjagtigt. Sandsynligvis den mest udfordrende del, dog, er at kende cellebiologi af svampen så godt, at de registrerede ændringer i den subcellulære lokalisering af membran og cellevæg selektive fluorescerende farvestoffer, ændringer i cellulære arkitektur eller hyphal vækstmønster kan udelukkende og trygt være relateret til de tilsigtede virkninger af den eksperimentelle behandling. Til dette er det afgørende at have gode Kontroller sammen med alle nye Live-Cell Imaging eksperiment. Disse omfatter ubehandlet vildtype som negativ billedbehandlings kontrol for at udelukke baggrunds autofluorescens og detektor støj fra det erhvervede billede og for at have en morfologisk Komparator, når du arbejder med mutanter. Endvidere, en positiv billeddannelse kontrol, for eksempel en stamme, der udtrykker GFP eller RFP i cytoplasmaet eller et andet velkendt fluorescerende markør protein, er afgørende for at indstille excitation lysintensiteten til det krævede minimum og har en celle vitalitet kontrol. Når disse kontroller er indstillet, er brugen af fluorescerende farvestoffer ikke begrænset til visualiseringsopgaver, men deres koncentrationsafhængige farvnings dynamik samt koncentrationsafhængige bivirkninger kan udnyttes analytisk; for eksempel, for kvantitativt overvågning cellevæg biosyntese i realtid eller for identifikation af mutant-specifikke fænotyper i modtagelighed assays47.
Forbedrede fremtidige applikationer afhænger af en detaljeret funktionel analyse af farvestof farvnings egenskaber. En stor vedvarende udfordring er at forbedre og automatisere kvantitative billedanalyser for at fremme funktionel evaluering af den subcellulære dynamik i membran-og cellevæg selektive fluorescerende farvestoffer i filamentøse svampe. Til dette, omfattende, kvantitative samlokaliserings undersøgelser af disse farvestoffer med kendte organelle og cellevæg polymer markører i kombination med mutant stammer mangelfuld i bestemte transportveje eller der mangler specifikke strukturelle komponenter er først påkrævet. Flere endokytose markører til komparative analyser med FM-farvestoffer er tilgængelige48,49, og med hensyn til de stadig dårligt karakteriseret bindende karakteristika af cellevæg farvestoffer i svampe, anvendelse af fluorescently-mærkede glucan-specifikke antistoffer50 kan give en mulighed for at løse dette problem.

For tyve år siden blev den måde, hvorpå hyphal morfogenese og den underliggende molekylære cellebiologi kunne visualiseres i filamentøse svampe, revolutioneret ved anvendelse af membranen selektiv fluorescerende Fei Mao Dye FM 4-641. Senere, fordelen ved chitin-bindende farvestof Calcofluor hvid som vital fluorescerende markør for svampe cellevæg dynamik blev realiseret2. Siden da er både farvestoffer og varianter heraf blevet en iboende del af analyser af organisk dynamik i levende celle billeder i svampe og fortsætter med at give hidtil uset indsigt i den filamentøse svampe livsstil. Dette papir beskriver anvendelsen af etablerede og mindre kendte fluorescerende farvestoffer til sporing af plasma membran dynamik, endo-og exocytose og cellevæg morfogenesis i filamentøse svampe. Endocytose tracking assays tillade forskellige celle biologiske spørgsmål i forbindelse med den generelle undersøgelse af endokytose, der skal behandles3. Til dette, lokalisering, hastighed og rækkefølge af farvede rum ved FM farve tilsætning registreres ved timelapse mikroskopi og kvantitativt sammenlignet mellem de testede svampe stammer4. Cellevæg farvestoffer afgrænse den ydre grænse af cellen og tillade sporing af morfogenetiske hændelser, herunder polariseret hyphal tip vækst2, hyphal forgrening5, hyphal fusion6,7 og septum formation8. Endvidere, de letter kvantificeringen af lokaliserede cellevæg deposition og identifikation af defekter under cellevæg Biogenese9. Fordi detaljeret viden om de biokemiske og biofysiske egenskaber af enhver fluorescerende markør er en grundlæggende forudsætning for sin vellykkede in vivo ansøgning, disse egenskaber er først opsummeret for de seks farvestoffer featured i denne artikel.
Membran selektive farvestoffer FM (Fei Mao) styryl farvestoffer er små amfifilic molekyler, der ikke kan passere igennem, men reversibelt associere med den ydre folder af lipid-lænden af biologiske membraner10. De er næsten ikke-fluorescerende i vandig opløsning, men bliver intenst fluorescerende ved plasma membran integration, genererer fremragende signal-til-støj (S/N)-nøgletal11. Disse egenskaber gør dem ideelle til visualisering af plasma membranen og intracellulær organelle dynamik, herunder sporing af endo-og exocytose12. Den grønne fluorescerende FM 1-43 og den røde fluorescerende FM 4-64 er de to mest udbredte fluorescerende membran markører til disse formål. SynaptoGreen C4 og SynaptoRed C2 er generiske molekyler fra alternative leverandører, der kan bruges synonymt i stedet for FM 1-43 og FM 4-64 hhv.
Styryl farvestoffer består af tre centrale strukturelle regioner: (1) den lipofile hale, der letter indsættelse af farvestoffet i lipid-billaget, (2) fluoroforet kernen, der bestemmer farvestoffets spektrale egenskaber og udgøres af to aromatiske ringe forbundet med en til tre dobbeltbindinger, og (3) det positivt ladede hydrofile hoved, der forhindrer fuldstændig indsættelse og gennemtrængning af farvestoffet via membranen (figur 1a).
Jo længere den lipofile hale, jo højere er farvestoffet hydrofobicitet og dermed bindende affinitet til membranen, men den nedre er dens vandopløselighed og membran de-farvning sats. Som følge heraf producerer forskellige FM-farvevarianter forskellige farvnings dynamik og mønstre. Den højere hydrofobiby af den C4-tailed FM 1-43 giver et stærkere og mere stabilt fluorescens signal ved plasma membraner og interne organeller hurtigere end den kortere C2-tailed FM 4-64, når det anvendes ved ækvimolære koncentrationer (figur 2).
Vigtigere, den konstante og høje Association/dissociation satser for begge FM-farvestoffer11 med gennemsnitlige retentionstider på 1 – 6 s pr individuelle farvestof molekyle13 reducere chancerne for lokaliseret forstyrrelse af membran funktion, for eksempel gennem ændring af membran fluiditet eller tvungen permanent interaktion af membran proteiner. Dette er formentlig den vigtigste grund til, at disse molekyler kan bruges som vitale farvestoffer. Ikke desto mindre er FM-farve koncentrationer over 50 μM giftige for svampe-og planteceller2,14, og evidens fra af-2-tobaks protoplaster indikerer, at mere end 20 μm FM-farvestof fører til plasma membran mætning14. Derfor er det tilrådeligt ikke at overskride denne grænse, især i betragtning af, at fremragende billeddannelse er opnået med så lidt som 2 – 5 μM15,16.
Især de spektral egenskaber af FM-farvestoffer varierer meget afhængigt af den særlige membran mikromiljø (anmeldt14). Generelt adskiller excitation og emissions spektre af FM-farvestoffer i rene opløsningsmidler (som normalt er angivet i produktinformationen) sig markant fra det i cellulære miljøer og kan i de fleste tilfælde ikke høres direkte ved valg af indstillinger for billedbehandling med levende celler. Excitation/emission Maxima af FM 1-43 og FM 4-64, for eksempel, bliver blå-forskudt med 37/46 nm og 43/64 nm, henholdsvis når de bindes til svampe membraner i forhold til deres opløsninger i methanol (tabel 1).
De banebrydende fundamentale for brugen af FM 4-64 og FM 1-43 til sporing af plasma membran, endo-/exocytose og organelle dynamik, herunder spitzenkörper og mitokondrier, er allerede blevet udførligt dokumenteret for en bred vifte af filamentøse svampearter tidligere2,4,17,18,19. Anbefalede billedbehandlings indstillinger for begge FM-farvestoffer, der virker i forskellige filamentøse svampearter, er afbildet i figur 1b. Tekniske begrænsninger af det tilgængelige udstyr eller særlige cellulære og eksperimentelle betingelser, såsom kulturmedium, pH eller temperatur, kan dog kræve nogle tilpasninger. Heldigvis opererer FM-farvestoffer over et bredt spektralområde, og meget gode billedbehandlings resultater opnås ved spændende FM 1-43 med 514 nm eller FM 4-64 med 488 nm. Derfor skal de optimale billedbehandlings indstillinger bestemmes individuelt for hver prøvetype og påtænkt anvendelse.
Den betydelige Stoke skift på mere end 135 nm FM 4-64 giver fremragende, samtidige Co-Imaging med fluorophores udsender grønt lys; Dette er ofte udnyttes til at evaluere intracellulære lokalisering dynamik af grønne fluorescerende protein (gfp)-mærket fusions proteiner i forhold til plasma membranen og endocytic pathway9,20.
Cellevæg-selektive farvestoffer Calcofluor White M2R (CFW), også markedsført som fluorescerende Brightener 28, er formentlig den bedst kendte fluorescerende farvestof, der anvendes til at plette cellevæggene af bakterier, svampe, alger, højere planter og insekter. Oprindeligt brugt som optisk blegning agent i papir, tekstil og vaskemiddel industri, dens fordele for den kliniske diagnose af svampeinfektioner blev realiseret tidligt på21,22. Fordi CFW intercalates uigenkaldeligt ind i den spirende chitin kæde det forstyrrer normal chitin microfibril forsamling under cellevæg Biogenese derved generere cellevæg stress23. Dette udløser igen en cellevæg skade reparation mekanisme, der fører til lokalt forhøjet cellevæg deposition som følge af glucan og chitin syntase aktivering24,25. Dette fænomen kan forekomme med ethvert farvestof, der opererer ved stabilt binding til cellevæg polymerer, er koncentrationsafhængig og er mest mærkbar på hyphal tips, der repræsenterer den mest produktive voksende og dermed mest følsomme dele af mycelium (figur 3). En omfattende oversigt over de molekylære maskiner, der reagerer på cellevæg skader er for nylig blevet givet26.
Overdoseret farvestof i kombination med fototoksicitet kan føre til hurtig cellelyse af hyphal rum (film 1). Ikke desto mindre, øget følsomhed over for farvestoffer koncentrationer, der er "Vital" i den vilde type kan udnyttes til at identificere defekter i cellevæg biosyntese af gentab-af-funktion mutanter9. For CFW og Congo Red (CR), en anden tekstil farvestof også kendt som Direct Red 28 og ansat som α-og β-chitin-specifik cellevægbejdsen for svampe og insekter27,28, tærskelkoncentrationer, der stærkt inducerer chitin synthaser er blevet bestemt med > 60 μm CFW og > 70 μM CR, mens koncentrationer <15 μM af begge farvestof ikke ændre eller hæmme svampevækst29,30,31. Hickey et al. placerede denne tærskelkoncentration for CFW ved 25 μM2. Derfor er det tilrådeligt at bruge farvestoffer koncentrationer ≤ 5 μM at udelukke stress-relaterede artefakter og sikre at bruge disse molekyler som virkelig "vitale fluorescerende farvestoffer"2,32. Dette gælder også for Solophenyl Flavine 7GFE 500 (SPF) og Pontamine fast Scarlet 4B (PFS), synonymt med direkte gul 86 og direkte rød 23, henholdsvis to andre nyttige cellevæg farvestoffer, hvis ansøgning om svampe er blevet rapporteret for første gang mere end et årti siden33. Men på trods af deres bemærkelsesværdige spektral egenskaber34,35, har brugen af begge farvestoffer siden da været meget begrænset36,37. Som tidligere vist for 1,5 μM CFW2, 2 μm SPF er tilstrækkelige til at løse cellevæg dynamik under indfødte forhold med meget høj tidsmæssig opløsning (film 2). De samme resultater kan opnås med 2 μM CR eller PFS.
Sammen, disse fire farvestoffer, CFW, SPF, PFS og CR, omfatter et sæt af cellevæg-selektive fluorescerende markører, der dækker næsten den komplette synlige emission lys spektrum (400 – 700 nm) udnyttes på moderne fluorescerende mikroskoper (figur 4). Den betydelige stigning i fluorescens intensitet ved binding til cellevæg polymerer er iboende til alle fire og genererer fremragende S/N-nøgletal. Dette igen tillader at holde farvestof koncentrationer og excitation lysintensitet meget lav og gør det muligt at udføre cellevæg farvning som "lav dosis" Live-Cell Imaging teknik2. Fordi disse cellevæg farvestoffer er plasma membran uigennemtrængelige, de samtidig fungerer som levende/døde pletter. Især på grund af deres ekstremt brede emissionslysspektre skal visse begrænsninger med hensyn til co-Imaging egenskaber af CFW og SPF med andre fluorophorer nøje overvejes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BRAND cell counting chamber</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR718005</td>
			<td>Thoma format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White M2R</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3543</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td>water immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td>water immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo Red</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6277</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>8,36,73,230</td>
			<td>organic solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 1-43</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6814</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6689</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>Rettberg</td>
			<td>1340691030</td>
			<td>3 mm glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BB02400600A113MNT0</td>
			<td>24 x 60 # 1 glass cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506353</td>
			<td>glycerol immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 Meta</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Minimal Medium</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td>generic fungal growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-slide 8-well</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>ibiTreat #1.5 polymer coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>polyester filtration material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>8,21,472</td>
			<td>92 x 16 mm culture dish w/o cams</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td>transparent gelling agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440762-9904-000</td>
			<td>oil immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pontamine Fast Scarlet 4B</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>212490</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>213400</td>
			<td>fungal growth medium for T. atroviride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Broth (PDB)</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>254920</td>
			<td>fungal growth medium for T. atroviride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706</td>
			<td>1.5 mL SafeSeal tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>5518016</td>
			<td>Cutfix sterile scalpel #23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>6,25,54,502</td>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solophenyl Flavine 7GFE 500</td>
			<td>CIBA</td>
			<td>1485385V6</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynaptoGreen C4</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>70020</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynaptoRed C2</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>70021</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe membrane filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>723-9945</td>
			<td>0.45 &#181;m SFCA syringe filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td>Leica</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vogel&#39;s Minimal Medium (VMM)</td>
			<td>FGSC</td>
			<td>Fungal Genetics Stock Centre</td>
			<td>fungal growth medium for N. crassa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging of filamentous fungi

Anvendelsen af membran og cellevæg selektive fluorescerende farvestoffer til levende celle billeddannelse analyser af organelle dynamik i svampeceller startede for to årtier siden, og siden da fortsætter med at bidrage meget til vores forståelse af de filamentøse svampe Livsstil. Dette papir giver en praktisk vejledning til udnyttelse af de to membran farvestoffer FM 1-43 og FM 4-64 og de fire cellevæg pletter Calcofluor hvid M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine hurtig Scarlet 48 og Congo rød. Fokus er på deres lavdosis applikation til at konstatere artefakt-fri farvning, deres Co-Imaging egenskaber, og deres kvantitative evaluering. De præsenterede metoder gælder for alle filamentøse svampe prøver, der kan tilberedes i de beskrevne måder. De grundlæggende farvnings tilgange kan tjene som udgangspunkt for tilpasninger af arter, der kan kræve forskellige dyrkningsbetingelser. Første, biofysiske og biokemiske egenskaber gennemgås som deres forståelse er afgørende for at bruge disse farvestoffer som virkelig vitale fluorescerende pletter. For det andet, trin-for-trin protokoller præsenteres, at detaljerne i forberedelsen af forskellige svampe prøvetyper for fluorescerende Live-Cell Imaging. Endelig illustrerer eksempler på eksperimenter forskellige tilgange til: (1) identificere defekter i den spatio-temporale organisering af endokytose i genetiske mutanter, (2) relativt karakterisere delt og distinkt samlokalisering af GFP-mærkede målproteiner i endocytic pathway, (3) identificere morfogenetiske cellevæg defekter i en genetisk mutant, og (4) overvåge cellevæg Biogenese i realtid.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi at JoVE.com

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

Vitale fluorescerende farvestoffer er essentielle værktøjer til analyser af levende celler i moderne svampe cellebiologi. Dette papir beskriver anvendelsen af etablerede og mindre kendte fluorescerende farvestoffer til sporing af plasma membran dynamik, endo-/exocytose og cellevæg morfogenesis i filamentøse svampe.

Anvendelse af membran og cellevæg selektive fluorescerende farvestoffer til levende celle billeder af filamentøse svampe

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

Membran og celle væg selektive fluorescerende farvestoffer er vigtige værktøjer til analyse af organelle dynamik og levende svampeceller. Vores protokoller giver væsentlige teoretiske baggrund og praktiske retningslinjer for anvendelsen af et udvalg af disse farvestoffer som virkelig vitale pletter. Det centrale punkt for dette er at bruge meget lave farvestof koncentrationer, der ikke forårsager cellulære artefakter relateret til mætning eller farvestof toksicitet og samtidig give gode signal til støj forhold til høj kvalitet, langsigtet levende celle billeddannelse.Med kolleger fra Institut for NuklearMedicin af det medicinske universitet, vi for nylig brugt disse farvning teknikker til at udvikle en ny tilgang til billed-guidet diagnose af aapergillosis. Evnen til at overvåge membran og cellevæg strukturer i realtid var afgørende for bestemmelse af optagelse dynamik af den eksperimentelle stofforbindelse. For at begynde denne procedure, først få en forberedt preculture.Brug en steril skalpel til at skære en lille agar blok, der bærer ikke-sporulerende mycelium fra kolonien kanten af preculture. Placer agarblokken i midten af en frisk, solid medium plade for at vaccinere den eksperimentelle kultur. Inkuber forsøgskulturen i henhold til den udviklingsfase, der skal inkuberes.Prøve forberedelse er noget delikat og optimering af billedet erhvervelse indstillinger er temmelig kompleks. Visuel demonstration af begge procedurer ledsaget af verbal forklaring i høj grad letter replicability. For at montere prøverne, holde en ren 24 af 60 millimeter glas dække slip klar og tilsæt 18 mikroliter af flydende minimal medium eller fysiologisk salt opløsning på midten.Tilføj to mikroliter af den forberedte 20 mikromolar farvestof arbejdsopløsning til væsken i midten af dækslet slip og bland godt ved pipettering op og ned flere gange og samtidig undgå produktion af luftbobler. Ved hjælp af en ren skalpel, skåret en 15 med 15 millimeter prøve fra periferien af kolonien og placere den lodret ved siden af medium dråbe på dækslet slip. Brug skalpel til at støtte den øverste kant af blokken og en finger til at holde bagsiden af blokken på plads.Sænk derefter langsomt den side, der bærer myceliet på væsken. Monter den forberedte prøve på mikroskopstadiet. Juster først de grundlæggende indstillinger for billederhvervelse for at registrere stående dynamik i individuelle hyfae som beskrevet i tekstprotokollen.For endocytose optagelse analyser, konsultere figur et og tabel en af tekstprotokollen til at identificere de bedste excitation og emission indstillinger for FM 143 eller FM 464, der er tilgængelige på mikroskopisystemet og justere disse indstillinger i systemet i overensstemmelse hermed. Start billedoptagelse ved hjælp af de tidligere justerede indstillinger, og vurder resultaterne. Derefter optimere billedet erhvervelse indstillinger til den rumlige og tidsmæssige opløsning, der kræves for at fange det aspekt af plasma membran eller endocytose dynamik eksperimentet er fokuseret på.For cellevægdynamik skal du se figur fire og tabel et af tekstprotokollen for at identificere de bedste excitations- og emissionsindstillinger for det anvendte cellevægfarvestof og justere indstillingerne på mikroskopisystemet i overensstemmelse hermed. Start billedoptagelse ved hjælp af de tidligere justerede indstillinger, og vurder resultaterne. Optimer derefter indstillingerne for billederhvervelse til den rumlige og tidsmæssige opløsning, der kræves for at fange det aspekt af cellevægsfedse, som eksperimentet fokuserer på.Ud over blot at visualisere cellulære processer, levende celle billeddannelse tillader udvinding af kvantitative oplysninger fra de registrerede data. I et eksempel på FM 464 optagelse analyser, svampeprøver dyrkes som kolonier og monteret ved den omvendte agar blok metode. Analyserne identificerede defekter i spatio-tidsmæssig organisering af endocytose i gensletning og genoverpresende mutanter af svampespecifikt protein SFP 2 af trichoderma atrovirid.Eksempler på FM 464 co-farvning af fluorescerende fusion proteiner målrettet til endocytiske rum er vist her. Denne co-farvning er ansat til at relatere den subcellulære fordeling af de to forbedrede grønne fluorescerende protein mærkede transmembrane proteiner, SFP 2 og GPR 1, til den endocytiske vej i trichoderma atroviride. Et eksempel på FM 464 co-farvning til identifikation af morfogenetiske forskelle viser, at denne co-farvning giver mulighed for yderligere relation af den subcellulære lokalisering dynamik flourescently mærket BUD-6 polarisme kompleks protein til at afslutte nogle menneskehandel-afhængige processer såsom dannelsen af septa og polariseret hyphal tip vækst.Det kendetegner også forskelle i den subcellulære organisation og hyphal arkitektur mellem vilde type og mutant stammer af neurospora crassa. Repræsentativ cellevægfarvning viser, at de forskellige interaktionsegenskaber af kalcofluorhvid, solophenyl flavine og congorød med cellevægpolymerer fremhæver morfogenetiske forskelle mellem deltaet SFP 2 mutant og den vilde typestamme af trichoderma atrovirid. Forøgelse af cellevæggen stress påført af forhøjede farvestof koncentrationer sker hurtigere og er mere udtalt i mutant i forhold til den vilde type.Desuden giver de samme billeder mulighed for kvantificering af morfogenetiske forskelle med hensyn til hyphaldiameter og septalafstand mellem begge stammer. Repræsentativ realtime overvågning af cellevæg biosyntese indikerer, at den meget lave calcofluor hvid koncentration forhindrer mætning af cellevæggen med farvestof molekyler og giver kvantitativ realtime overvågning af cellevæg biosyntese. Dette afslører, at aflejringen af nye cellevæg materiale ikke er ensartet, men reagerer meget hurtigt på lokaliserede fysiske belastninger som følge af den relative forskydning af en celle på celle-til-celle vedhæftet fil før dermalinfusion i neurospora crassa.Mindre er mere. Brug så lidt farvestof som muligt for at forhindre interferens af lysstofrørmarkøren med cellulære processer. Efter denne procedure, flourescence opsving efter foto-blegning eksperimenter kunne udføres for at kvantificere transport og biogenesekinetik.Den banebrydende indførelse af membran og cellevæg farvning i filamentøse svampe i begyndelsen af årtusindet gjorde bogstaveligt talt revolutionere den måde, vi ser på svampe. Calcofluor hvid kan forårsage øjenirritationer og er en klassificeret cancerigen. Congo rød er cancerigenic og teratogenic, så vær venlig at bære øjen-og hudbeskyttelse, når håndtering af disse farvestoffer.

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Levende Cell Imaging af Early Autophagy begivenheder: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravital mikroskopi af Imaging Subcellulære Strukturer Live mus, der udtrykker fluorescerende proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G Protein-selektive GPCR Konformationer målt med FRET sensorer i en Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Undersøgelse af Protein Kvalitetskontrol System af<em&gt; D. discoideum</em&gt; Brug Temperatur-kontrollerede Live-Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Levende cellebilleddannelse af blodpladegravulation og sekretion under strømning

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Dynamisk cellebilledbehandling i superopløsning af undercellulære strukturer

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...