Name: application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging of filamentous fungi
Uploaded: 2019-11-28T15:00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi at JoVE.com

Dank gaat uit naar het Tiroler wetenschaps Fonds (TWF) voor het verstrekken van subsidie #256524 aan AL, aan het Vienna Science and Technology Fund (WWTF) voor het verstrekken van subsidie #LS13-086 aan SZ, en aan het publicatie Fonds van de Universiteit van Innsbruck voor de ondersteuning van publicatie van Open Access. De auteurs bedanken ook de faculteit zoölogie van de Universiteit van Innsbruck voor het leveren van de Leica TCS SP5 II confocale laser scanning microscoop.

1. bereiding van schimmel monsters
<ol><li>Preculturen van schimmels<ol>
<li>Beënt de gewenste belasting op een geschikt vast agar-medium, zoals aardappel dextrose agar (PDA) voor Trichoderma atroviride of Vogel's minimal medium (VMM) voor Neurospora crassa. Voeg een geschikte selectiemarkering toe bij het werken met transformant stammen.</li>
		<li>Inbroed de pre-cultuur op de optimale temperatuur van het organisme. Bijvoorbeeld, T. atroviride bij 25 °C en N. crassa bij 30 °c, en 12 h/12 h licht/donker cycli totdat een sporulerend mycelium heeft ontwikkeld, maar nog niet bereikt de rand van de plaat. Op een standaard formaat Petri schaal (9,2 cm Ø), dit neemt de wild-type T. atroviride op 4 – 6 dagen gemiddelde, terwijl de N. crassa wild type bereikt dit stadium na 3 – 4 dagen gemiddeld.</li>
	</ol></li>
	<li>Teelt van schimmel kolonies<ol>
<li>Snijd met een steriel scalpel een klein agar-blok van 3 mm x 3 mm dat niet-sporulerend mycelium uit de kolonie rand van de pre-cultuur vervoert.</li>
		<li>Plaats het agar-blok in het midden van een verse vaste medium plaat om de experimentele cultuur te beënten.</li>
		<li>Inincuberen van de experimentele cultuur op basis van de ontwikkelingsfase bedoeld om te worden onderzocht. Bijvoorbeeld, de wild-type T. atroviride vereist 20 – 22 uur bij 25 °c in het donker om kolonies van ongeveer 2 cm diameter op PDA te ontwikkelen, terwijl de wild-type N. crassa kolonie diameters van ongeveer 4 cm bereikt na 14 – 16 h van incubatie bij 30 °c in het donker op VMM. Opmerking: incubatie in het donker voorkomt de vorming van pigmenten die een autofluorescentie kunnen introduceren. Om de gemiddelde achtergrond fluorescentie uit de experimentele cultuur te elimineren, vervangt u agar met 1,5% w/v van een transparante Stolp middel (Zie de tabel met materialen) en elk complex medium met een gedefinieerd minimaal medium.</li>
	</ol></li>
	<li>Teelt van massief germende culturen<ol>
<li>Gebruik 5 mL steriele fysiologische zoutoplossing (0,9% w/v NaCl) om naald sporen te oogsten uit de pre-cultuur plaat en verzamel de resulterende Spore suspensie in een 15 mL schroefdop buis.</li>
		<li>Meng de Spore suspensie goed door krachtige grondig en filtreer vervolgens over een strook van 1 cm x 5 cm steriele filter stof (Zie de tafel van de materialen) lichtjes gevuld in een 1 ml pipetpunt (zowel geassembleerd als vooraf geautoclaveerd) in een verse steriele buis.</li>
		<li>Bepaal de Spore dichtheid met een celtelkamer en bereid een 1 x 107 cellen/ml Spore suspensie met fysiologische zoutoplossing voor. Opmerking: de Spore suspensie kan gedurende maximaal twee weken bij 4 °C worden bewaard.</li>
		<li>Bereid een standaard formaat Petri schaal (9,2 cm Ø) met 20 mL vast medium en voeg 15 – 20 steriele glas parels (3 mm Ø) aan de bovenzijde toe.</li>
		<li>Pipetteer 200 μL van de Spore suspensie op de medium plaat en verdeel de cellen gelijkmatig over de hele plaat door zachtjes te schudden. Verzamel de glazen kralen in een bekerglas met 70% ethanol voor hergebruik.</li>
		<li>Inincuberen van de experimentele cultuur op basis van de ontwikkelingsfase bedoeld om te worden onderzocht. Het wild type T. atroviride vereist bijvoorbeeld 5 – 6 h bij 25 °c in het donker om naald GERMLINGS op PDA te ontwikkelen, terwijl de N. crassa wild type connaat van naaldhout ontwikkelt na 3 – 4 uur incubatie bij 30 °c in het donker op VMM. Opmerking: om een middellange achtergrond fluorescentie uit de experimentele cultuur te elimineren, moet u agar vervangen door 1,5% w/v van een transparant Stolp middel, en elk complex medium met een gedefinieerd minimaal medium.</li>
	</ol></li>
	<li>Teelt van vloeibare germling culturen<ol>
<li>Vul 190 μL vloeibaar kweekmedium in elke put van een 8-well Chambered micro-Slide.</li>
		<li>Voeg 10 μL van een 1 x 107 cellen/ml Spore oplossing (bereid in stappen 1.4.1 – 1.4.3) toe en meng door voorzichtig een paar keer omhoog en omlaag te pipetteren. Het resulterende totale aantal cellen is 1 x 105 per put.</li>
		<li>Inincuberen van de experimentele cultuur op basis van de ontwikkelingsfase bedoeld om te worden onderzocht. Het wild type T. atroviride vereist bijvoorbeeld 5 – 6 h bij 25 °c in het donker om coniferingen te ontwikkelen in aardappel dextrose-Bouillon (VOB), terwijl het wilde type N. crassa coniferingen ontwikkelt na 3 – 4 uur incubatie bij 30 °c in het donker in vloeibare VMM.</li>
	</ol></li>
</ol>2. bereiding van kleurstof werkoplossingen
<ol><li>Om de volledige oplosbaarheid van elke kleurstof te garanderen, dient u 2 mM stockoplossingen in Dimethylfumaraat sulfoxide (DMSO) te bereiden door de juiste hoeveelheid toe te voegen (Zie exacte gewichten in tabel 1) tot 1 ml 100% DMSO en meng goed door vortexing. Let op: Zorg ervoor dat u de DMSO nemen van een septum-verzegeld fles; het moet een duidelijke transparante vloeistof. Bij contact met de lucht wordt DMSO bruin-waarschijnlijk als gevolg van de oxidatie van sporen onzuiverheden-en kan het de celgroei of kleurstof kleuring negatief beïnvloeden.</li>
	<li>Filter steriliseren de stamoplossing door een 0,2 μm spuit membraanfilter in een verse steriele 1,5 mL reactie buis. Om kleurstof bleaching te minimaliseren, wikkel de buis in aluminiumfolie. Opmerking: de kleurstof voorraadoplossing kan worden uitgedrukt in kleinere volumes om te voorkomen dat ze ontdooien/vriezen en gedurende enkele maanden bij 4 °C worden bewaard.</li>
	<li>Bereid een werkoplossing met een waterige kleurstof van 20 μM door 2 μL kleurstof voorraadoplossing op te lossen in 198 μL steriel gedestilleerd water in een verse steriele 1,5 mL-reactie buis. Om kleurstof bleaching te minimaliseren, wikkel de buis in aluminiumfolie. Opmerking: de kleurstof werkoplossing moet vers worden bereid op de dag van het experiment.</li>
	<li>Tijdens de montage van het monster (zie rubriek 3) zal de kleurstof werkoplossing standaard worden verdund 1:10, resulterend in een uiteindelijke kleurstof concentratie van 2 μM en 0,1% w/v uiteindelijke DMSO-concentratie. Opmerking: het kiezen van verschillende verdunningsfactoren door simpelweg de volume verhouding tussen de kleurstof werkoplossing en de bevestigings vloeistof te veranderen, maakt het mogelijk om de gewenste eind kleurstof concentratie eenvoudig aan te passen. Let op: om ongewenste effecten te voorkomen als gevolg van kleurstof of DMSO-toxiciteit, mag de verdunningsfactor niet onder 1:4 vallen tot een resultaat maximale eindconcentratie van 5 μM kleurstof en 0,4% w/v DMSO. Hogere kleurstof concentraties zullen het systeem snel verzaaien en een betrouwbare signaal kwantificering voorkomen, terwijl meer dan 0,5% w/v (≥ 62,5 mM) DMSO de celontwikkeling38kan aantasten.</li>
</ol>3. monstervoorbereiding voor microscopie
<ol><li>Monteer monsters van schimmel kolonies (stap 1,2) of massieve germling culturen (stap 1,3) door de omgekeerde agar-blok methode.<ol>
<li>Houd een schone glazen afdekplaat van 24 mm x 60 mm (#1 = 0,13 – 0.16 mm dikte) klaar en voeg 18 μL vloeibare minimale medium (VMM of M9) of fysiologische zoutoplossing toe aan het midden.</li>
		<li>Voeg 2 μL van de 20 μM kleurstof werkoplossing toe aan de 18 μL vloeistof en meng goed door meerdere malen op en neer te pipetteren, terwijl de productie van luchtbellen wordt vermeden. Opmerking: bij het werken met verschillende monsters, is het raadzaam om een Master mix van vloeistof-Dye oplossing voor iedereen te bereiden om ervoor te zorgen gelijke kleurstof concentratie gedurende het experiment.</li>
		<li>Knip met een schoon scalpel een monster van 15 mm x 15 mm uit de omtrek van de kolonie of een stevige germling-cultuur en plaats deze verticaal naast de gemiddelde druppel op de Afdekstrook.</li>
		<li>Gebruik de scalpel om de bovenrand van het blok en een vinger te ondersteunen om de achterzijde van het blok op zijn plaats te houden, en verlaag langzaam de zijkant die het mycelium of de germlings op de vloeistof draagt. Het monster is nu klaar voor overdracht naar de Microscoop. Let op: het is essentieel om dit langzaam en zeer zorgvuldig te doen om de mechanische belasting op de cellen te minimaliseren en om te voorkomen dat er luchtbellen tussen monster en cover slip worden gevangen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monteer de vloeibare germling culturen van stap 1,4. Opmerking: de meest handige, vloeibare germling culturen in Chambered micro-well slides kunnen direct worden overgebracht en verder gemanipuleerd op de Microscoop fase.<ol>
<li>Voeg 22 μL kleurstof werkoplossing toe aan 200 μL vloeibaar medium, wat resulteert in een standaard eindconcentratie van 2 μM kleurstof en 0,1% w/v DMSO. Opmerking: vloeibare germling culturen hebben het grote voordeel dat fluorescerende kleurstoffen (of andere chemicaliën, zoals remmers) kunnen worden toegevoegd op elk gewenst tijdstip van het experiment, ook tijdens het opnemen. In dat geval moet er speciale aandacht worden besteed aan het zeer langzaam toedienen van de vloeistof druppels om de cellen niet te storen. Systeem trillingen en de Brownse beweging introduceren mogelijk al een celbeweging.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. live-cel microscopie
<ol><li>Pas de basisinstellingen voorbeeld verwerving aan. Met de volgende instellingen voorbeeld verwerving u de kleurings dynamiek in afzonderlijke schimmeldraden vastleggen en van toepassing zijn op beide volgende assays<ol>
<li>Breng 5 – 10% laser vermogen van 20% van het volledige uitgangsvermogen van het apparaat.</li>
		<li>Gebruik een plan APO 60x – 63x glycerol of water onderdompeling doel met een hoge numerieke diafragma ≥ 1,2.</li>
		<li>Beperk het afbeeldings verzamelings gebied tot de omtrek van de schimmeldraden door een afbeeldingsgrootte van 1024 x 256 pixels in te stellen en door een optische zoomfactor van 2 – 3 te gebruiken.</li>
		<li>Gebruik bidirectionele scanning met 400 Hz. Stel de pinhole grootte in op 1 luchtige eenheid.</li>
		<li>Stel de versterking van de gevoeligste detector in op 100%.</li>
		<li>Voor tijd ronden opnemen, Start Image Acquisition met één frame om de 15 s om redelijke temporele resolutie mogelijk te maken zonder kleurstof bleken of foto stress te produceren.</li>
		<li>Voor 3D-opnames stelt u de bovenste en onderste ruimtelijke grens in op de grens van de schimmeldraden en de ruimte optische secties 1 μm uit elkaar om een redelijke ruimtelijke resolutie mogelijk te maken. Opmerking: vanwege de snelle groei van hyphae is een hoge ruimtelijke resolutie in de Z-as vaak geofferd voor een hoge temporele resolutie in de X/Y-as of andersom. Alleen zeer moderne confocale laser scanning microscopen zijn snel genoeg om aan beide eisen te voldoen.</li>
	</ol></li>
	<li>Endocytose opname-assays<ol>
<li>Raadpleeg Figuur 1 en tabel 1 om de beste excitatie/emissie-instellingen voor FM 1-43 en/of FM 4-64 beschikbaar te stellen op het microscopie systeem en dienovereenkomstig aan te passen. Opmerking: met de aanbevolen concentratie van 2 μM is de opname van FM-kleurstof in het plasma membraan direct in normale gezonde cellen. Het hele proces van aanvankelijke plasmamembraan kleuring tot kleurstof verschijning in buisvormige vacuolen wordt meestal binnen 30 – 45 minuten bij kamertemperatuur voltooid. Het verhogen van de FM-kleurstof concentratie verhoogt de S/N-ratio en produceert zo sneller hogere contrast beelden. Echter, het versnelt ook het etiketteringsproces waardoor het moeilijker is om de chronologische opeenvolging van organel kleuring te differentiëren.</li>
		<li>Start Image Recording met de bovenstaande aanbevolen basisinstellingen voorbeeld verwerving en evalueer de resultaten.</li>
		<li>Optimaliseer instellingen voorbeeld verwerving in de ruimtelijke en temporele resolutie die nodig is om het aspect van het plasma membraan of endocytose dynamiek vast te leggen waar het experiment op gericht is.</li>
		<li>Om bijvoorbeeld zeer snelle dynamiek in X/Y vast te leggen, verlaagt u de totale Afbeeldingsgrootte, slechts één brandvlak en verhoogt u de scansnelheid tot 1 fps. Voor een hogere resolutie in de Z-as verlaagt u de resolutie in X/Y, verkleint u de beeldgrootte en verkleint u de afstand tussen optische secties tot 0,5 μm.</li>
	</ol></li>
	<li>Celwand dynamica<ol>
<li>Raadpleeg Figuur 4 en tabel 1 voor het identificeren van de beste excitatie/emissie-instellingen voor de toegepaste celwand kleurstof die beschikbaar is op het microscopie systeem en pas dienovereenkomstig aan. Opmerking: vanwege hun brede emissiespectra zijn CFW en SPF niet goed geschikt voor gelijktijdige co-Imaging met andere fluor Foren, overwegend GFP. Sommige beperkingen zijn zelfs van toepassing voor sequentiële beeldvormings benaderingen met deze kleurstoffen, en moeten dus individueel worden geoptimaliseerd.</li>
		<li>Start Image Recording met de bovenstaande aanbevolen basisinstellingen voorbeeld verwerving en evalueer de resultaten. Opmerking: bij de aanbevolen concentratie van 2 μM is de opname van de kleurstof in de celwand niet noodzakelijkerwijs direct maar redelijk snel. Het hele proces van septum vorming, bijvoorbeeld, duurt gemiddeld ongeveer 5 – 7 min bij kamertemperatuur20. Het verhogen van de celwand kleurstof concentratie verhoogt de S/N-ratio en produceert zo sneller hogere contrast beelden. Echter, het introduceert ook snel artefacten als gevolg van geïnduceerde celwand schade reparatie.</li>
		<li>Optimaliseer instellingen voorbeeld verwerving in de ruimtelijke en temporele resolutie die nodig is om het aspect van celwand morfogenese vast te leggen het experiment is gericht op, zoals uiteengezet in punt 4.2.3.</li>
	</ol></li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben en niets te onthullen.

Dit artikel gaat verder met het baanbrekende werk dat het gebruik van verschillende fluorescerende kleurstoffen als vitale organel markers voor filamenteuze schimmels in de vroege jaren 20002,4,43, en pogingen om de photophysical en cel biologische eigenschappen van FM-kleurstoffen en geselecteerde celwand kleurstoffen in meer detail dan voorheen te bespreken. Vooral met betrekking tot ongewenste cellulaire effecten, zoals membraan verzadiging of celwand schade, die boven bepaalde kleurstof concentraties optreden. Wat eerder is beschouwd als niet-toxisch op cellulair niveau wordt nu beschouwd als giftig op moleculair niveau. Hoewel deze effecten zeer subtiel kunnen zijn en niet direct zichtbaar zijn door duidelijke veranderingen in organel-of Celgedrag, moet elke mogelijke interferentie van de kleurstof toepassing dan visualisatie worden geminimaliseerd voor het onderzoek naar de inheemse moleculaire functie. Gelukkig vergemakkelijkt een verbeterde gevoeligheid en kwantum efficiëntie van moderne detectoren, zoals silicium lawine fotodiode detectoren (si-Apd's)44 of de Airyscan area detector45, het gebruik van nog lagere kleurstof bedragen dan voorheen. Een ander belangrijk doel van het artikel is het illustreren van de co-Imaging eigenschappen van deze kleurstoffen met andere fluor Foren, vooral, die van GFP als de meest gebruikte fluorescerende eiwitten in de biologie. Dit moet helpen bij het ontwerp van Imaging experimenten die gericht zijn op het correleren van de subcellulaire lokalisatie dynamiek van fluorescerende fusie eiwitten aan die van de schimmel celwand, het plasma membraan of de Endo-en exocytose pathway enz.
Beeldvorming onder natuurlijke en stressvrije omstandigheden is essentieel voor het verwerven van betrouwbare gegevens. Enkele praktische overwegingen met betrekking tot kweekmedium en monstervoorbereiding zijn gericht op het bieden van een uitgangspunt voor het vinden van de optimale omstandigheden die een artefact vrije, lange tijd observatie van gezonde, onbeklemtoonde cellen mogelijk maken met de hoogst mogelijke S/N-ratio voor elk gegeven monster. Er is geen universele manier om betrouwbare en zinvolle beeldvormende resultaten te behalen. Het is inherent aan de benadering dat biologische variatie van het monster, subjectiviteit en verwachtingen van de microscopist, evenals beeld nabewerking een aanzienlijke invloed hebben op de gegevensverwerving en-interpretatie, respectievelijk. Vandaar, de praktische ervaring van de microscopist, haar/zijn intieme kennis over de celbiologie van de schimmel onderzochte, evenals bekwame monstervoorbereiding om condities te creëren als ' natuurlijke ' en ongestoord mogelijk in een Lab setting, zijn van essentieel belang voor het verwerven en evalueren van Imaging data die waarheidsgetrouw weerspiegelt de bestudeerde cellulaire verschijnselen. Als vuistregel geldt dat het optreden van ongewenste neveneffecten van fluorescerende kleurstoffen, variërend van de subtiele en dus niet duidelijk zichtbare activering van een plasma membraan of celwand, het opnieuw modelleren van stressrespons trajecten op de rechtlijnige cytotoxische inductie van celautolyse, alleen veilig kan worden voorkomen door lage kleurstof concentraties ≤ 2 μM toe te passen.
De toepassing van fluorescerende kleurstoffen is eenvoudig, maar hun specifieke kenmerken zijn slecht gekarakteriseerd. Een belangrijke sterkte van het gebruik van fluorescerende kleurstoffen is de preparatieve eenvoud van de experimentele protocollen. Teelt en bemonstering van de schimmel, toevoeging van de kleurstof (fen), en montage op de Microscoop fase zijn (met de praktijk) ongecompliceerd. Aanpassing van de basis beeldvormings instellingen, inclusief excitatie en emissie golflengten, belichtingstijden, tijdsverloop instellingen enz., volgen eenvoudige biofysische regels van de Microscoop en biologische regels van de gebruikte fluorescerende kleurstoffen in de cellen. Tabel 1 beoogt de identificatie van de meest geschikte combinatie van kleurstof of kleurstof voor experimenten te ondersteunen. Bovendien zijn fluorescerende kleurstoffen redelijk geprijsd, gemakkelijk beschikbaar met betrouwbare hoge kwaliteit en dus zorgen voor een zeer reproduceerbare toepassing.
Twee belangrijke beperkingen van het gebruik van selectieve fluorescerende kleurstoffen van membraan of celwand zijn de (vaak) beperkte kennis van hun precieze kleurings eigenschappen, die in de meeste gevallen niet-specifiek zijn op het organel-en moleculair niveau, en hun concentratieafhankelijke ongewenste neveneffecten. FM-kleurstoffen zijn specifiek voor lipide-bilayers die deelnemen aan Endo-en exocytose. Echter, precies welke subcellulaire organellen worden achtereenvolgens gelabeld onder de geteste omstandigheden is niet onmiddellijk duidelijk en vereist vergelijking van verschillende FM kleurstof varianten, en co-labeling met aanvullende organelle-specifieke markers. De voorkeur van FM 1-43 voor mitochondriale membranen, in vergelijking met FM 4-64, is een voorbeeld. Cell Wall selectieve kleurstoffen vertonen een variërende specificiteit voor de drie belangrijkste polymeren van de schimmel celwand. CFW wordt beschouwd als een niet-specifieke vlek voor β-glucanen en chitine, SPF wordt verondersteld het meest selectief te zijn voor β-1, 4-glucanen, en CR wordt verondersteld zeer selectief te zijn voor α-en β-chitinen. Informatie over de bindende specificiteit van PFS aan schimmel celwand polysacchariden is momenteel niet beschikbaar. Welke verhouding welke schimmel celwand polymeer het meest effectief wordt geëtiketteerd bij een bepaalde kleurstof concentratie bij de onderzochte schimmelsoorten is niet gemakkelijk te beantwoorden, en de toepassing van gedetailleerde metingen die in vitro of in vivo in andere organismen of andere schimmelsoorten zijn verworven, moeten zeer zorgvuldig worden overwogen. Helaas, deze informatie is schaars en sterk verspreid in de literatuur35,42,46. Meer recente records die zouden volgen op eerdere studies33 om nieuwe inzichten te bieden in de precieze kleurings eigenschappen van de aanbevolen kleurstoffen specifiek in schimmels zijn momenteel niet beschikbaar.
Imaging-besturingselementen zijn essentieel om kleurings patronen en mobiele reacties nauwkeurig te evalueren. Waarschijnlijk de meest uitdagende deel, echter, is om te weten de celbiologie van de schimmel zo goed dat de opgenomen veranderingen in de subcellulaire lokalisatie van membraan en celwand selectieve fluorescerende kleurstoffen, veranderingen in cellulaire architectuur of hyphal groeipatroon kan uitsluitend en vol vertrouwen worden gerelateerd aan de beoogde effecten van de experimentele behandeling. Hiervoor is het cruciaal om goede controles te hebben naast een nieuw Live-celbeeldvormings experiment. Deze omvatten het onbehandelde wild type als negatieve beeldvormings regeling om achtergrond autofluorescentie en detector ruis uit het verworven beeld uit te sluiten, en om een morfologische comparator te hebben bij het werken met mutanten. Bovendien is een positieve beeldvormings controle, bijvoorbeeld een stam die GFP of RFP in het cytoplasma of een ander bekend fluorescerende marker eiwit uitdrukt, essentieel om de excitatie lichtintensiteit in te stellen op het vereiste minimum en een Cell Vitality Control te hebben. Zodra deze controles zijn ingesteld, is het gebruik van fluorescerende kleurstoffen niet beperkt tot visualisatie taken alleen, maar hun concentratie-afhankelijke kleuring dynamiek, evenals concentratie-afhankelijke bijwerkingen kunnen analytisch worden uitgebuit; bijvoorbeeld, voor het kwantitatief controleren van de celwand biosynthese in real time of voor de identificatie van mutant-specifieke fenotypes in gevoeligheidstesten47.
Verbeterde toekomstige toepassingen zijn afhankelijk van een gedetailleerde functionele analyse van kleurstof kleurings eigenschappen. Een belangrijke voortdurende uitdaging is het verder verbeteren en automatiseren van kwantitatieve beeld analyses om de functionele evaluatie van de subcellulaire dynamiek van selectieve fluorescerende kleurstoffen van membraan-en celwand in filamenteuze schimmels te voorkomen. Hiervoor zijn uitgebreide, kwantitatieve co-lokalisatie studies van deze kleurstoffen met bekende organel-en celwand polymeer markers in combinatie met Mutante stammen met een tekort aan specifieke transporttrajecten of die geen specifieke structurele componenten hebben, eerst vereist. Verschillende endocytose markers voor vergelijkende analyses met FM kleurstoffen zijn beschikbaar48,49, en met betrekking tot de nog slecht gekenmerkte bindende specificiteiten van celwand kleurstoffen in schimmels, kan de toepassing van fluorescently-gelabelde glucan-specifieke antilichamen50 een mogelijkheid bieden om dit probleem aan te pakken.

Twintig jaar geleden werd de manier waarop hyphal morfogenese en de onderliggende moleculaire celbiologie konden worden gevisualiseerd in filamenteeuze schimmels geregiseerd door de toepassing van het membraan selectieve fluorescerende Fei Mao Dye FM 4-641. Later, het voordeel van de chitin-bindende kleurstof Calcofluor wit als vitale fluorescerende marker van schimmel celwand dynamiek werd gerealiseerd2. Sindsdien zijn zowel kleurstoffen als varianten daarvan een inherent onderdeel geworden van Live-celbeeldvormings analyses van organel dynamiek in schimmels en blijven ze ongekende inzichten bieden in de filamenteuze schimmel levensstijl. Dit papier Details de toepassing van gevestigde en minder bekende fluorescerende kleurstoffen voor het volgen van plasma membraan dynamiek, Endo-en exocytose en celwand morfogenese in filamenteuze schimmels. Endocytose tracking assays kunnen verschillende cel biologische vragen met betrekking tot de algemene studie van endocytose worden aangepakt3. Hiervoor wordt de lokalisatie, snelheid en opeenvolging van bevlekte compartimenten bij toevoeging van FM-kleurstof opgenomen door tijdsverloop microscopie en kwantitatief vergeleken tussen de geteste schimmel stammen4. Celwand kleurstoffen afbakenen de buitenste grens van de cel en laten het volgen van morfogenetische gebeurtenissen toe, waaronder gepolariseerde hyphal Tip groei2, hyphal vertakkingen5, hyphal Fusion6,7 en septum formatie8. Bovendien vergemakkelijken ze de kwantificering van gelokaliseerde celwand depositie en de identificatie van defecten tijdens celwand biogenese9. Omdat gedetailleerde kennis van de biochemische en biofysische eigenschappen van een fluorescerende marker een fundamentele voorwaarde is voor de succesvolle in vivo toepassing, worden deze kenmerken voor het eerst samengevat voor de zes kleurstoffen die in dit artikel worden vermeld.
Membraan selectieve kleurstoffen FM (Fei Mao) styryl kleurstoffen zijn kleine amfifiele moleculen die niet kunnen passeren maar omkeerbaar associëren met de buitenste bijsluiter van de lipide dubbellaagse van biologische membranen10. Ze zijn vrijwel niet-tl-licht in waterige oplossing, maar worden intens fluorescerend bij de integratie van plasma membraan, waardoor uitstekende signaal-ruis (S/N)-verhoudingen11worden gegenereerd. Deze eigenschappen maken ze bij uitstek geschikt voor het visualiseren van plasma membraan en intracellulaire organel dynamiek, inclusief het volgen van Endo-en exocytose12. De groen-fluorescerende FM 1-43 en de rood-fluorescerende FM 4-64 zijn voor deze doeleinden de twee meest gebruikte fluorescerende membraan markers. SynaptoGreen C4 en SynaptoRed C2 zijn generieke moleculen van alternatieve leveranciers die onderling verwisselbaar kunnen worden gebruikt in plaats van FM 1-43 en FM 4-64, respectievelijk.
Styryl kleurstoffen bestaan uit drie belangrijke structurele gebieden: (1) de lipofiele staart die het inbrengen van de kleurstof in de lipide dubbellaag vergemakkelijkt, (2) de de-kern die de spectrale eigenschappen van de kleurstof bepaalt en wordt gevormd door twee aromatische ringen die met één tot drie dubbele bindingen zijn verbonden, en (3) de positief geladen hydrofiele kop die volledige inbrenging en permeatie van de kleurstof door het membraan voorkomt (Figuur 1a).
Hoe langer de lipofiele staart, hoe hoger de hydrofobiciteit van de kleurstof en dus een bindende affiniteit met het membraan, maar hoe lager de oplosbaarheid in water en de membraan ontkleurings graad. Daardoor produceren verschillende FM-kleurstof varianten verschillende kleurings dynamiek en-patronen. De hogere hydrofobiciteit van de C4-tailed FM 1-43 zorgt voor een sterker en stabieler fluorescentie signaal bij plasma membranen en inwendige organellen sneller dan de kortere C2-tailed FM 4-64, wanneer toegepast bij equimolaire concentraties (Figuur 2).
Belangrijk is dat de constante en hoge associatie/dissociatie percentages van beide FM-kleurstoffen11 met gemiddelde retentietijden van 1 – 6 s per individuele kleurstof molecuul13 de kans op gelokaliseerde verstoring van de membraan functie verminderen, bijvoorbeeld door de modificatie van membraan vloeibaarheid of geforceerde permanente interactie van membraan eiwitten. Dit is waarschijnlijk de belangrijkste reden waarom deze moleculen kunnen worden gebruikt als vitale kleurstoffen. Niettemin, FM-kleurstof concentraties boven 50 μM zijn giftig voor de schimmel-en plantencellen2,14, en bewijs van de door-2 tabak protoplasten geeft aan dat meer dan 20 μM FM-kleurstof leidt tot verzadiging van het plasma membraan14. Daarom is het raadzaam om deze limiet niet te overschrijden, vooral gezien het feit dat uitstekende beeldvorming is bereikt met slechts 2 – 5 μM15,16.
Met name de spectrale eigenschappen van FM-kleurstoffen variëren sterk afhankelijk van de specifieke membraan-micro omgeving (beoordeeld14). Over het algemeen verschillen excitatie-en emissiespectra van FM-kleurstoffen in oplossingen van zuiver oplosmiddel (zoals gewoonlijk vermeld in de productinformatie) significant van die in cellulaire omgevingen en kunnen ze in de meeste gevallen niet direct worden geraadpleegd voor het selecteren van instellingen voor Live-celbeeldvorming. De excitatie/emissiemaxima van FM 1-43 en FM 4-64 worden bijvoorbeeld blauw-verschoven met respectievelijk 37/46 nm en 43/64 nm, wanneer gebonden aan schimmel membranen in vergelijking met hun oplossingen in methanol (tabel 1).
De baanbrekende Fundamentals voor het gebruik van FM 4-64 en FM 1-43 voor het volgen van plasma membraan, Endo-/exocytose en organel dynamiek, waaronder de spitzenkörper en mitochondriën, zijn al uitvoerig gedocumenteerd voor een breed scala aan filamenteuze schimmelsoorten eerder2,4,17,18,19. Aanbevolen beeldvormings instellingen voor beide FM-kleurstoffen die in verschillende filamenteuze schimmelsoorten werken, worden afgebeeld in Figuur 1b. Technische beperkingen van de beschikbare apparatuur of specifieke cellulaire en experimentele omstandigheden, zoals kweekmedium, pH of temperatuur, kunnen echter enkele aanpassingen vergen. Gelukkig werken FM-kleurstoffen over een breed spectrum bereik, en zeer goede beeldvormende resultaten worden bereikt door spannende FM 1-43 met 514 nm of FM 4-64 met 488 nm. Bijgevolg moeten de optimale beeldvormings instellingen voor elk type monster en de beoogde toepassing afzonderlijk worden bepaald.
De aanzienlijke verschuiving van het Stoke-over van meer dan 135 nm van FM 4-64 zorgt voor uitstekende gelijktijdige co-Imaging met fluoroforen die groen licht uitstralen; Dit wordt vaak benut om de intracellulaire lokalisatie dynamiek van groene fluorescerende eiwitten (GFP)-gelabelde fusie-eiwitten ten opzichte van het plasma membraan en de endocytische pathway9,20te evalueren.
Celwand-selectieve kleurstoffen Calcofluor White M2R-(CFW), ook op de markt gebracht als fluorescerende Brightener 28, is waarschijnlijk de bekendste fluorescerende kleurstof die wordt gebruikt om de celwanden van bacteriën, schimmels, algen, hogere planten en insecten te vlekken. Aanvankelijk gebruikt als optische bleken agent in de papier-, textiel-en detergentenindustrie, de voordelen voor de klinische diagnose van schimmelinfecties werd vroeg gerealiseerd op21,22. Omdat CFW onherroepelijk in de ontluikende chitine-keten intercalates, verstoort het normale chitine microfibril assemblage tijdens celwand biogenese waardoor celwand stress23wordt gegenereerd. Dit activeert op zijn beurt een celwand schade herstelmechanisme dat leidt tot lokaal verhoogde celwand depositie als het resultaat van glucan en chitine synthase activatie24,25. Dit fenomeen kan voorkomen bij elke kleurstof die werkt door stabiel te binden aan celwand polymeren, is concentratie-afhankelijk en is het meest merkbaar bij hyphal-tips die de meest productieve groei en dus de meest gevoelige delen van het mycelium vertegenwoordigen (Figuur 3). Een uitgebreide samenvatting van de moleculaire machine die reageert op celwand schade is onlangs verstrekt26.
Overdosed Dye in combinatie met fototoxiciteit kan leiden tot snelle cellyse van hyphal compartimenten (film 1). Niettemin, verhoogde gevoeligheid voor kleurstof concentraties die "vitale" in het wild type zijn kunnen worden benut om gebreken in celwand biosynthese van gen verlies-van-functie mutanten9identificeren. Voor CFW en Congo rood (CR), een andere textiel kleurstof ook bekend als direct Red 28 en gebruikt als α-en β-chitine-specifieke celwand vlek voor schimmels eninsecten 27,28, drempelconcentraties die sterk induceren chitine synthases zijn vastgesteld met > 60 μm CFW en > 70 μM CR, terwijl concentraties <15 μm van beide kleurstof niet veranderen of schimmelgroei remmen29,30,31. Hickey et al. plaatste deze drempel concentratie voor CFW bij 25 μM2. Daarom is het raadzaam om kleurstof concentraties ≤ 5 μM te gebruiken om stressgerelateerde artefacten uit te sluiten en ervoor te zorgen dat deze moleculen als echt "vitale fluorescerende kleurstoffen"2,32worden gebruikt. Dit geldt evenzeer voor Solophenyl flavine 7GFE 500 (SPF) en Pontamine Fast Scarlet 4B (PFS), synoniem aan directe gele 86 en direct Red 23, respectievelijk twee andere nuttige celwand kleurstoffen waarvan de toepassing voor schimmels is gemeld voor de eerste keer meer dan een decennium geleden33. Maar ondanks hun opmerkelijke spectrale eigenschappen34,35, is het gebruik van beide kleurstoffen sindsdien zeer beperkt36,37. Zoals eerder getoond voor 1,5 μM CFW2, 2 μm SPF volstaan om de celwand dynamiek onder inheemse omstandigheden op te lossen met een zeer hoge temporele resolutie (film 2). Dezelfde resultaten kunnen worden verkregen met 2 μM CR of PFS.
Samen vormen deze vier kleurstoffen, CFW, SPF, PFS en CR, een set celwand-selectieve fluorescentie markers die bijna het volledige zichtbare emissie Lichtspectrum (400 – 700 nm) beslaan dat wordt gebruikt op moderne fluorescerende microscopen (Figuur 4). De significante toename van de intensiteit van de fluorescentie bij binding aan celwand polymeren is inherent aan alle vier en genereert uitstekende S/N-verhoudingen. Dit op zijn beurt toelaat om kleurstof concentraties en excitatie lichtintensiteit zeer laag te houden en maakt het mogelijk om celwand kleuring als "lage dosis" Live-Cell Imaging techniek2uit te voeren. Omdat deze celwand kleurstoffen plasma membraan ondoorbaar zijn, functioneren ze tegelijkertijd als levende/dode vlekken. Met name vanwege hun extreem brede emissie lichtspectra, moeten sommige beperkingen met betrekking tot de co-Imaging eigenschappen van CFW en SPF met andere fluor Foren zorgvuldig worden overwogen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BRAND cell counting chamber</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR718005</td>
			<td>Thoma format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White M2R</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3543</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td>water immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td>water immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo Red</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6277</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>8,36,73,230</td>
			<td>organic solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 1-43</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6814</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6689</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>Rettberg</td>
			<td>1340691030</td>
			<td>3 mm glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BB02400600A113MNT0</td>
			<td>24 x 60 # 1 glass cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506353</td>
			<td>glycerol immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 Meta</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Minimal Medium</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td>generic fungal growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-slide 8-well</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>ibiTreat #1.5 polymer coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>polyester filtration material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>8,21,472</td>
			<td>92 x 16 mm culture dish w/o cams</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td>transparent gelling agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440762-9904-000</td>
			<td>oil immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pontamine Fast Scarlet 4B</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>212490</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>213400</td>
			<td>fungal growth medium for T. atroviride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Broth (PDB)</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>254920</td>
			<td>fungal growth medium for T. atroviride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706</td>
			<td>1.5 mL SafeSeal tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>5518016</td>
			<td>Cutfix sterile scalpel #23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>6,25,54,502</td>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solophenyl Flavine 7GFE 500</td>
			<td>CIBA</td>
			<td>1485385V6</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynaptoGreen C4</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>70020</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynaptoRed C2</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>70021</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe membrane filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>723-9945</td>
			<td>0.45 &#181;m SFCA syringe filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td>Leica</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vogel&#39;s Minimal Medium (VMM)</td>
			<td>FGSC</td>
			<td>Fungal Genetics Stock Centre</td>
			<td>fungal growth medium for N. crassa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging of filamentous fungi

De toepassing van selectieve fluorescerende kleurstoffen voor membraan-en celwand voor Live-celbeeldanalysen van organel dynamiek in schimmelcellen begon twee decennia geleden en blijft sindsdien sterk bijdragen aan ons begrip van de filamenteuze schimmel Levensstijl. Dit papier biedt een praktische gids voor het gebruik van de twee membraan kleurstoffen FM 1-43 en FM 4-64 en de vier celwand vlekken Calcofluor wit M2R-, Solophenyl flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 en Congo rood. De focus ligt op hun lage-dosis toepassing om artefact vrije kleuring, hun co-beeldvormings eigenschappen en hun kwantitatieve evaluatie vast te stellen. De gepresenteerde methoden zijn van toepassing op alle filamenteuze schimmel monsters die op de beschreven manieren kunnen worden bereid. De fundamentele kleurings benaderingen kunnen dienen als uitgangspunt voor aanpassingen aan soorten die mogelijk verschillende teeltomstandigheden vereisen. Ten eerste worden biofysische en biochemische eigenschappen beoordeeld omdat hun begrip essentieel is voor het gebruik van deze kleurstoffen als echt vitale fluorescerende vlekken. Ten tweede worden stapsgewijze protocollen gepresenteerd die de voorbereiding van verschillende soorten schimmel monsters voor fluorescerende Live-celbeeldvorming gedetailleerd weergeven. Ten slotte illustreren voorbeeld experimenten verschillende benaderingen voor: (1) identificeren van gebreken in de spatio-temporele organisatie van endocytose in genetische mutanten, (2) relatief karakteriseren gedeelde en duidelijke co-lokalisatie van GFP-gelabelde doel eiwitten in het endocytische traject (3) identificeren morfogenetische celwand defecten in een genetische Mutant, en (4) monitor Cell Wall biogenese in real time.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi at JoVE.com

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

Vitale fluorescerende kleurstoffen zijn essentiële hulpmiddelen voor Live-celbeeldvormings analyses in moderne schimmel celbiologie. Dit papier Details de toepassing van gevestigde en minder bekende fluorescerende kleurstoffen voor het volgen van plasma membraan dynamiek, Endo-/exocytose en celwand morfogenese in filamenteuze schimmels.

Toepassing van selectieve fluorescerende kleurstoffen voor membraan-en celwand voor het beeldvorming van filamenteuze schimmels in levende cellen

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

Membraan en celwand selectieve fluorescerende kleurstoffen zijn belangrijke instrumenten voor de analyse van organelle dynamiek en levende schimmelcellen. Onze protocollen bieden essentiële theoretische achtergrond en praktische richtlijnen voor de toepassing van een selectie van deze kleurstoffen als echt vitale vlekken. Het belangrijkste punt hiervoor is het gebruik van zeer lage kleurstof concentraties die niet leiden tot cellulaire artefacten in verband met verzadiging of kleurstof toxiciteit, terwijl nog steeds het verstrekken van goede signaal-ruisverhoudingen voor hoge kwaliteit, op lange termijn live cel beeldvorming.Met collega's van de afdeling Nucleaire Geneeskunde van de medische universiteit hebben we onlangs deze kleurtechnieken gebruikt om een nieuwe aanpak te ontwikkelen voor beeldgestuurde diagnose van aapergillose. De mogelijkheid om membraan- en celwandstructuren in realtime te monitoren, was cruciaal voor het bepalen van de opnamedynamiek van de experimentele geneesmiddelenverbinding. Om deze procedure te beginnen, eerst een voorbereide precultuur verkrijgen.Gebruik een steriele scalpel om een klein agarblok te snijden dat niet-sporulerend mycelium van de kolonierand van de precultuur draagt. Plaats het agarblok in het midden van een verse, stevige middelgrote plaat om de experimentele cultuur in te enten. Broed de experimentele cultuur volgens de ontwikkelingsfase bedoeld om te worden geïncubeerd.Voorbeeldvoorbereiding is enigszins delicaat en optimalisatie van de instellingen voor het verkrijgen van afbeeldingen is vrij complex. Visuele demonstratie van beide procedures vergezeld van verbale uitleg vergemakkelijkt de repliceerbaarheid. Om de monsters te monteren, houd een schone 24 bij 60 millimeter glazen deksel klaar en voeg 18 microliter van vloeibare minimale medium of fysiologische zout oplossing op het centrum.Voeg twee microliters van de voorbereide 20 micromolar kleurstof werkoplossing aan de vloeistof in het midden van de cover slip en meng goed door pipet op en neer meerdere malen, terwijl het vermijden van de productie van luchtbellen. Met behulp van een schone scalpel, knip een monster van 15 bij 15 millimeter uit de periferie van de kolonie en plaats deze verticaal naast de medium drop op de cover slip. Gebruik de scalpel om de bovenste rand van het blok en een vinger te ondersteunen om de achterkant van het blok op zijn plaats te houden.Laat vervolgens langzaam de zijkant met het mycelium op de vloeistof zakken. Zet het voorbereide monster op het microscooppodium. Pas eerst de basisinstellingen voor het verkrijgen van afbeeldingen aan om de permanente dynamiek vast te leggen in individuele hyphae zoals beschreven in het tekstprotocol.Raadpleeg voor de endocytose-opnametesten figuur één en tabel één van het tekstprotocol om de beste excitatie- en emissie-instellingen voor FM 143 of FM 464 te identificeren die beschikbaar zijn op het microscopiesysteem en deze instellingen in het systeem dienovereenkomstig aan te passen. Start het opnemen van afbeeldingen met behulp van de eerder aangepaste instellingen en evalueer de resultaten. Optimaliseer vervolgens de instellingen voor het verkrijgen van afbeeldingen tot de ruimtelijke en temporele resolutie die nodig is om het aspect van plasmamembraan of endocytosedynamiek vast te leggen waarop het experiment is gericht.Raadpleeg voor de dynamiek van de celwand figuur vier en tabel één van het tekstprotocol om de beste excitatie- en emissie-instellingen voor de toegepaste celwandkleurstof te identificeren en pas de instellingen op het microscopiesysteem dienovereenkomstig aan. Start het opnemen van afbeeldingen met behulp van de eerder aangepaste instellingen en evalueer de resultaten. Optimaliseer vervolgens de instellingen voor het verkrijgen van afbeeldingen tot de ruimtelijke en temporele resolutie die nodig is om het aspect van de morfogenese van de celwand vast te leggen waarop het experiment is gericht.Naast het enkel visualiseren van cellulaire processen, maakt live celbeeldvorming extractie van kwantitatieve informatie uit de opgenomen gegevens mogelijk. In een voorbeeld van de FM 464 opnametesten, schimmel monsters worden gekweekt als kolonies en gemonteerd door de omgekeerde agar blok methode. De tests identificeerden gebreken in de spatio-temporele organisatie van endocytose in gende verwijdering en gen dat mutanten van het schimmelspecifieke eiwit SFP 2 van trichoderma atroviride over-uitdrukt.Voorbeelden van FM 464 co-kleuring van fluorescerende fusie-eiwitten gericht op endocytische compartimenten worden hier getoond. Deze co-kleuring wordt gebruikt om de subcellulaire verdeling van de twee verbeterde groene fluorescerende eiwit gelabeld transmembrane eiwitten, SFP 2 en GPR 1, betrekking hebben op de endocytische route in trichoderma atroviride. Een voorbeeld van FM 464 co-kleuring voor de identificatie van morfogenetische verschillen blijkt dat deze co-kleuring maakt verdere relatie van de subcellulaire lokalisatie dynamiek van flourescently gelabeld BUD-6 polarisme complex eiwit aan het einde van een aantal handel-afhankelijke processen zoals de vorming van septa en gepolariseerde hyphal tip groei.Het kenmerkt ook verschillen in de subcellulaire organisatie en hyphal architectuur tussen wilde type en mutant stammen van neurospora crassa. Representatieve celwandvlekken tonen aan dat de verschillende interactie-eigenschappen van calcofluorwit, solofenyl flavine en congorood met celwandpolymeren morfogenetische verschillen tussen de delta SFP 2 mutant en de wilde soort stam van trichoderma atroviride benadrukken. Het verhogen van de celwand stress toegebracht door verhoogde kleurstof concentraties gebeurt sneller en is meer uitgesproken in de mutant in vergelijking met het wilde type.Bovendien zorgen dezelfde beelden voor de kwantificering van morfogenetische verschillen met betrekking tot hyphal diameter en septale afstand tussen beide stammen. Representatieve realtime monitoring van de biosynthese van de celwand geeft aan dat de zeer lage calcofluorwitte concentratie verzadiging van de celwand met kleurstofmoleculen voorkomt en kwantitatieve realtime monitoring van de biosynthese van de celwand mogelijk maakt. Dit toont aan dat de afzetting van nieuw celwandmateriaal niet uniform is, maar zeer snel reageert op gelokaliseerde fysieke spanningen als gevolg van de relatieve verplaatsing van één cel op cel-naar-celbevestiging voorafgaand aan dermalinfusie in neurospora crassa.Minder is meer. Gebruik zo weinig mogelijk kleurstof om interferentie van de fluorescerende marker met cellulaire processen uit te sluiten. Na deze procedure kan het herstel van de bloemescentie na fotobleekexperimenten worden uitgevoerd om transport en biogenese kinetiek te kwantificeren.De baanbrekende introductie van membraan- en celwandvlekken in filamenteuze schimmels aan het begin van het millennium heeft letterlijk een revolutie teweeggebracht in de manier waarop we naar schimmels kijken. Calcofluor wit kan oogirritaties veroorzaken en is een geclassificeerde cancerigen. Congo rood is cancerigenic en teratogenic, dus draag oog- en huidbescherming bij het hanteren van deze kleurstoffen.

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Labeling stamcellen met fluorescente kleurstoffen voor niet-invasieve detectie met optische beeldvorming

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Selectieve Etikettering van Cell-oppervlakte-eiwitten met behulp van CyDye DIGE Fluor Minimal Kleurstoffen

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Live cell imaging van de F-actine Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Fluorescerende Labeling van COS-7 tot expressie SNAP-tag fusieproteïnen voor live cell imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Live cell imaging van Vroege Autophagy Evenementen: Omegasomes en Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravitale Microscopy for Imaging Subcellulaire Structuren in Levende muizen die fluorescerende eiwitten

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G Protein-selectieve GPCR Conformaties gemeten met behulp van FRET sensoren in een Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Het bestuderen van de Protein Quality Control System van<em&gt; D. discoideum</em&gt; Met behulp van Temperatuur gecontroleerde live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Live-cel beeldvorming van bloedplaatjes Degranulatie en afscheiding onder stroming

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Superresolutie live celbeeldvorming van subcellulaire structuren

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...