Name: application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging of filamentous fungi
Uploaded: 2019-11-28T15:00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi at JoVE.com

Merci au Fonds des sciences tyroliennes (TWF) d'avoir accordé des subventions #256524 à AL, au Fonds des sciences et de la technologie de Vienne (WWTF) pour avoir accordé une subvention #LS13-086 à SZ, et au Fonds de publication de l'Université d'Innsbruck pour soutenir la publication en libre accès. Les auteurs remercient également le Département de zoologie de l'Université d'Innsbruck d'avoir fourni le microscope à balayage laser confocal Leica TCS SP5 II.

1. Préparation d'échantillons fongiques
<ol><li>Pré-cultures fongiques<ol>
<li>Inoculer la souche désirée sur un milieu d'agar solide approprié, comme l'agar de dextrose de pomme de terre (PDA) pour l'atroviride de Trichoderma ou le milieu minimal de Vogel (VMM) pour Neurospora crassa. Ajoutez un marqueur de sélection approprié lorsque vous travaillez avec des souches de transformateur.</li>
		<li>Incuber la pré-culture à la température optimale de l'organisme. Par exemple, T. atroviride à 25 oC et N. crassa à 30 oC, et 12 h/12 h cycles de lumière/obscurité jusqu'à ce qu'un mycélium sporulating se soit développé mais n'a pas encore atteint le bord de la plaque. Sur un plat Petri de taille standard (9,2 cm), cela prend le type sauvage T. atroviride sur 4-6 jours en moyenne, tandis que le type sauvage N. crassa atteint ce stade après 3-4 jours en moyenne.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultivation de colonies fongiques<ol>
<li>À l'aide d'un scalpel stérile, couper un petit bloc d'agar de 3 mm x 3 mm transportant du mycélium non sporulation du bord de la colonie de la pré-culture.</li>
		<li>Placez le bloc d'agar au centre d'une plaque moyenne solide fraîche pour inoculer la culture expérimentale.</li>
		<li>Incuber la culture expérimentale selon le stade de développement destiné à être étudié. Par exemple, l'atroviride De type sauvage nécessite de 20 à 22 heures à 25 oC dans l'obscurité pour développer des colonies d'environ 2 cm de diamètre sur PDA, tandis que le N. crassa de type sauvage atteint des diamètres de colonie d'environ 4 cm après 14 à 16 h d'incubation à 30 oC dans l'obscurité sur VMM. REMARQUE : L'incubation dans l'obscurité empêche la formation de pigments qui pourraient introduire l'autofluorescence. Afin d'éliminer la fluorescence moyenne de fond de la culture expérimentale, remplacez l'agar par 1,5 % w/v d'un agent solidificateur transparent (voir la Table des Matériaux),et tout support complexe avec un milieu minimal défini.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultivation de cultures germinantes solides<ol>
<li>Utilisez 5 mL de solution de sel physiologique stérile (0,9 % w/v NaCl) pour récolter les spores coniques de la plaque pré-culture et recueillir la suspension des spores qui en résulte dans un tube à capuchon à vis de 15 ml.</li>
		<li>Bien mélanger la suspension des spores par un vortex vigoureux et la filtrer sur une bande de 1 cm x 5 cm de tissu filtre stérile (voir le tableau des matériaux)légèrement farci dans une pointe de pipette de 1 ml (à la fois assemblée et autoclaved à l'avance) dans un tube stérile frais.</li>
		<li>Déterminez la densité des spores à l'égard d'une chambre de comptage cellulaire et préparez une suspension de 1 x 107 cellules/mL avec solution physiologique de sel. REMARQUE : La suspension des spores peut être maintenue à 4 oC jusqu'à deux semaines.</li>
		<li>Préparer un plat Petri de taille standard (9,2 cm d'euros) avec 20 ml de milieu solide et ajouter 15 à 20 perles de verre stériles (3 mm) sur le dessus.</li>
		<li>Pipette 200 l de la suspension de spore sur la plaque moyenne et répartir uniformément les cellules sur toute la plaque par secousses douces. Recueillir les perles de verre dans un bécher avec 70% d'éthanol pour la réutilisation.</li>
		<li>Incuber la culture expérimentale selon le stade de développement destiné à être étudié. Par exemple, le type sauvage de T. atroviride nécessite de 5 à 6 h à 25 oC dans l'obscurité pour développer des germes coniques sur le PDA, tandis que le type sauvage de N. crassa développe des germes coniques après 3 à 4 h d'incubation à 30 oC dans l'obscurité sur VMM. REMARQUE : Afin d'éliminer toute fluorescence moyenne de fond de la culture expérimentale, remplacez l'agar par 1,5 % w/v d'un agent solidifiant transparent, et tout milieu complexe avec un milieu minimal défini.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultivation de cultures germinantes liquides<ol>
<li>Remplir 190 l de milieu de culture liquide dans chaque puits d'un micro-glissière à 8 biens.</li>
		<li>Ajouter 10 l d'une solution de sporre de 1 x 107 cellules/mL (préparée à l'étape 1.4.1-1.4.3) et mélanger en tapant doucement de haut en bas à quelques reprises. Le nombre total de cellules qui en résulte est de 1 x 105 par puits.</li>
		<li>Incuber la culture expérimentale selon le stade de développement destiné à être étudié. Par exemple, l'atroviride sauvage de type T. nécessite de 5 à 6 h à 25 oC dans l'obscurité pour développer des germes coniques dans le bouillon de dextrose de pomme de terre (PDB), tandis que le type sauvage N. crassa développe des germes conidial après 3 à 4 h d'incubation à 30 oC dans l'obscurité dans le VMM liquide.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Préparation de solutions de travail de teinture
<ol><li>Pour garantir la solubilité totale de chaque colorant, préparer des solutions de stock de 2 mM en sulfoxide de diméthyle (DMSO) en ajoutant la quantité appropriée (voir les poids exacts dans le tableau 1) à 1 ml de 100% DMSO et bien mélanger par vortexing. CAUTION: Assurez-vous de prendre le DMSO d'une bouteille septum scellée; il devrait s'agit d'un liquide transparent clair. Au contact de l'air, le DMSO brunit, probablement en raison de l'oxydation des impuretés des traces, et pourrait avoir une incidence négative sur la croissance cellulaire ou la coloration des colorants.</li>
	<li>Filtrer la stérilisation de la solution de stock à l'eau à l'eau à l'eau à l'eau dans un tube de réaction stérile de 1,5 ml. Pour minimiser le blanchiment des teintures, envelopper le tube dans du papier d'aluminium. REMARQUE : La solution de stock de colorant peut être aliquoted dans de plus petits volumes pour éviter des cycles de décongélation/congélation, et maintenue à 4 oC pendant plusieurs mois.</li>
	<li>Préparer une solution de travail de colorant aqueux de 20 MM en dissolvant 2 ll de solution de bouillon de colorant dans 198 l d'eau distillée stérile dans un tube de réaction stérile de 1,5 ml. Pour minimiser le blanchiment des teintures, envelopper le tube dans du papier d'aluminium. REMARQUE : La solution de travail de colorant doit être préparée fraîchement le jour de l'expérience.</li>
	<li>Pendant le montage de l'échantillon (voir la section 3), la solution de travail de colorant sera diluée de façon standard 1:10, ce qui se traduira par une concentration finale de colorant de 2 M et de 0,1 % avec une concentration finale de DMSO. REMARQUE : Le choix de différents facteurs de dilution en modifiant simplement le rapport de volume entre la solution de travail de colorant et le liquide de montage, permet d'adapter facilement la concentration finale désirée de colorant. CAUTION: Pour prévenir les effets indésirables dus à la teinture ou à la toxicité DMSO, le facteur de dilution ne doit pas tomber en dessous de 1:4 pour entraîner des concentrations finales maximales de colorant de 5 M et de 0,4 % w/v DMSO. Des concentrations plus élevées de colorants satureront rapidement le système et empêcheront la quantification fiable du signal, alors que plus de 0,5 % w/v (62,5 mM) DMSO peut nuire au développement cellulaire38.</li>
</ol>3. Préparation d'échantillons pour la microscopie
<ol><li>Échantillons de mont des colonies fongiques (étape 1.2) ou des cultures germinantes solides (étape 1.3) par la méthode inversée de bloc d'agar.<ol>
<li>Gardez un bordereau de couverture en verre propre de 24 mm x 60 mm (#1'épaisseur de 0,13 à 0,16 mm) et ajoutez 18 l de milieu minimal liquide (VMM ou M9) ou une solution physiologique de sel au centre.</li>
		<li>Ajouter 2 ll de la solution de travail de colorant de 20 M À la 18 L de liquide et bien mélanger en pipetting de haut en bas plusieurs fois, tout en évitant la production de bulles d'air. REMARQUE : Lorsque vous travaillez avec plusieurs échantillons, il est conseillé de préparer un mélange maître de solution de teinture liquide pour tous afin d'assurer une concentration égale de colorant tout au long de l'expérience.</li>
		<li>À l'arme claire, découper un échantillon de 15 mm x 15 mm de la périphérie de la colonie ou de la culture de germling solide et placez-le verticalement à côté de la goutte moyenne sur le bordereau de couverture.</li>
		<li>En utilisant le scalpel pour soutenir le bord supérieur du bloc et un doigt pour maintenir le côté arrière du bloc en place, abaissez lentement le côté portant le mycélium ou les germes sur le liquide. L'échantillon est maintenant prêt pour le transfert sur le stade du microscope. CAUTION: Il est essentiel de le faire lentement et très soigneusement afin de minimiser le stress mécanique sur les cellules et d'éviter que les bulles d'air sont piégés entre l'échantillon et le glissement de couverture.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montez les cultures germantes liquides à partir de l'étape 1.4. REMARQUE : Plus commodément, les cultures de germination liquide dans les diapositives de micro-puits chambrées peuvent être directement transférées et manipulées davantage au stade du microscope.<ol>
<li>Ajouter 22 ll de solution de travail de colorant à 200 l de milieu liquide pour avoir comme conséquence les concentrations finales standard de 2-M de colorant et de 0.1% w/v DMSO. REMARQUE : Les cultures germées liquides ont le grand avantage que les colorants fluorescents (ou d'autres produits chimiques, tels que les inhibiteurs) peuvent être ajoutés à n'importe quel moment désiré de l'expérience, également pendant l'enregistrement. Dans ce cas, un soin particulier doit être pris pour administrer les gouttes liquides très lentement afin de ne pas déranger les cellules. Les vibrations du système et le mouvement Brownian pourraient déjà introduire un certain mouvement cellulaire.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Microscopie à cellules vivantes
<ol><li>Ajustez les paramètres d'acquisition d'images de base. Les paramètres d'acquisition d'images suivants permettent de capturer la dynamique de coloration dans les hyphes individuels et s'appliquent aux deux tests suivants<ol>
<li>Appliquer 5 à 10% de puissance laser de 20% de la puissance de sortie complète de l'appareil.</li>
		<li>Utilisez un objectif d'immersion en glycérol ou en eau de Plan Apo 60x-63x avec une ouverture numérique élevée de 1,2.</li>
		<li>Limitez la zone d'acquisition d'image au contour des hyphes en définissant une taille d'image de 1024 x 256 pixels et en utilisant un facteur de zoom optique de 2 à 3.</li>
		<li>Utilisez la numérisation bidirectionnelle avec 400 Hz. Ajustez la taille du sténopé à 1 unité Airy.</li>
		<li>Définir le gain du détecteur le plus sensible à 100%.</li>
		<li>Pour l'enregistrement des tours de temps, commencez l'acquisition d'image avec une image tous les 15 s pour permettre une résolution temporelle raisonnable sans produire de blanchiment de colorant ou de stress photo.</li>
		<li>Pour l'enregistrement 3D, fixez la limite spatiale supérieure et inférieure à la limite des hyphes et des sections optiques spatiales à 1 m l'une de l'autre pour permettre une résolution spatiale raisonnable. REMARQUE : En raison de la croissance rapide des hyphes, la haute résolution spatiale dans l'axe Z a souvent été sacrifiée pour une résolution temporelle élevée dans l'axe X/Y ou dans l'autre sens. Seuls les microscopes à balayage laser confocal très modernes sont assez rapides pour satisfaire les deux demandes.</li>
	</ol></li>
	<li>Essais d'endocytose d'étude<ol>
<li>Consultez la figure 1 et le tableau 1 afin d'identifier les meilleurs paramètres d'excitation/émission pour les FM 1-43 et/ou FM 4-64 disponibles sur le système de microscopie et de les ajuster en conséquence. REMARQUE : Avec la concentration recommandée de 2 M, l'incorporation de colorant FM dans la membrane plasmatique est instantanée dans les cellules saines normales. L'ensemble du processus de coloration initiale de la membrane plasmatique à l'apparence de teinture dans les vacuoles tubulaires est généralement terminé dans les 30 à 45 minutes à température ambiante. L'augmentation de la concentration de colorant FM augmente le S/N-ratio et produit ainsi des images de contraste plus élevées plus rapidement. Cependant, il accélère également le processus d'étiquetage, ce qui rend plus difficile de différencier la succession chronologique de la coloration organelle.</li>
		<li>Commencez l'enregistrement d'images à l'aide des paramètres d'acquisition d'images de base recommandés ci-dessus et évaluez les résultats.</li>
		<li>Optimisez les paramètres d'acquisition d'image à la résolution spatiale et temporelle requise pour capturer l'aspect de la membrane plasmatique ou de la dynamique de l'endocytose sur la dynamique de l'expérience.</li>
		<li>Par exemple, afin de capturer la dynamique très rapide dans X/Y, diminuer la taille globale de l'image, l'image d'un seul plan focal et augmenter le taux de numérisation à 1 fps. Pour une résolution plus élevée dans l'axe Z, diminuez la résolution dans X/Y, diminuez la taille de l'image et diminuez la distance entre les sections optiques à 0,5 m.</li>
	</ol></li>
	<li>Dynamique de mur cellulaire<ol>
<li>Consultez la figure 4 et le tableau 1 afin d'identifier les meilleurs paramètres d'excitation/émission pour le colorant paroi cellulaire appliqué disponible sur le système de microscopie et ajuster en conséquence. REMARQUE : En raison de leurs larges spectres d'émission, le CFW et le FPS ne sont pas bien adaptés à la co-imagerie simultanée avec d'autres fluorophores, principalement des GFP. Certaines restrictions s'appliquent même pour les approches d'imagerie séquentielle avec ces colorants, et doivent donc être optimisées individuellement.</li>
		<li>Commencez l'enregistrement d'images à l'aide des paramètres d'acquisition d'images de base recommandés ci-dessus et évaluez les résultats. REMARQUE : Avec la concentration recommandée de 2 M, l'incorporation de colorant dans la paroi cellulaire n'est pas nécessairement instantanée, mais raisonnablement rapide. L'ensemble du processus de formation de septum, par exemple, prend en moyenne environ 5 à 7 min à température ambiante20. L'augmentation de la concentration de colorant de paroi cellulaire augmente le S/N-ratio et produit ainsi des images de contraste plus élevées plus rapidement. Cependant, il introduit également rapidement des artefacts en raison de la réparation induite des dommages de paroi cellulaire.</li>
		<li>Optimisez les paramètres d'acquisition d'images à la résolution spatiale et temporelle requise pour capturer l'aspect de la morphogenèse de la paroi cellulaire sur laquelle l'expérience est axée, comme indiqué à la section 4.2.3.</li>
	</ol></li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents et rien à divulguer.

Cet article poursuit le travail novateur qui a établi l'utilisation de divers colorants fluorescents comme marqueurs d'organite essentiels pour les champignons filamenteux au début des années 20002,4,43, et tente de discuter des propriétés physiques et cellulaires biologiques des colorants FM et des colorants de mur cellulaire sélectionnés plus en détail qu'auparavant. Particulièrement en ce qui concerne les effets cellulaires indésirables, tels que la saturation de la membrane ou des dommages à la paroi cellulaire, qui se produisent au-dessus de certaines concentrations de teinture. Ce qui était auparavant considéré comme non toxique au niveau cellulaire est maintenant considéré comme toxique au niveau moléculaire. Même si ces effets peuvent être très subtils et pas directement évidents par des changements évidents dans le comportement des organelles ou des cellules, toute interférence possible de l'application de colorant autre que la visualisation doit être minimisée pour l'étude de la fonction moléculaire indigène. Heureusement, l'amélioration de la sensibilité et de l'efficacité quantique des détecteurs modernes, tels que les détecteurs de photodiode d'avalanche de silicium (Si-APDs)44 ou le détecteur de zone Airyscan45, facilitent l'utilisation de quantités de colorant encore plus faibles qu'auparavant. Un autre objectif clé de l'article est d'illustrer les propriétés de co-imagerie de ces colorants avec d'autres fluorophores, plus important encore, ceux de GFP comme la protéine fluorescente la plus fréquemment utilisée en biologie. Cela devrait faciliter la conception d'expériences d'imagerie qui visent à corréler la dynamique de localisation subcellulaire des protéines de fusion fluorescente à celles de la paroi cellulaire fongique, la membrane plasmatique ou la voie de l'endo-et-exocytose, etc.
L'imagerie dans des conditions naturelles et sans stress est essentielle pour l'acquisition de données fiables. Certaines considérations pratiques concernant le milieu de culture et la préparation de l'échantillon visent à fournir un point de départ pour trouver les conditions optimales qui permettent l'observation à long terme et sans artefacts des cellules saines et non stressées avec le rapport S/N le plus élevé possible pour un échantillon donné. Il n'existe aucun moyen universel d'obtenir des résultats d'imagerie fiables et significatifs. Il est inhérent à l'approche que la variation biologique de l'échantillon, la subjectivité et les attentes du microscopiste, ainsi que le post-traitement d'image ont une influence significative sur l'acquisition et l'interprétation des données, respectivement. Par conséquent, l'expérience pratique du microscopiste, sa connaissance intime de la biologie cellulaire du champignon à l'étude, ainsi que la préparation habile de l'échantillon pour créer des conditions aussi «naturelles» et non perturbées que possible dans un cadre de laboratoire, sont primordiales pour l'acquisition et l'évaluation de données d'imagerie qui reflète honnêtement les phénomènes cellulaires étudiés. En règle générale, l'apparition d'effets secondaires indésirables des colorants fluorescents, allant de l'activation subtile et donc pas visible de la membrane plasmatique ou de la paroi cellulaire remodelant les voies de réponse au stress à l'induction cytotoxique directe de l'autolyse cellulaire, ne peut être évitée en toute sécurité qu'en appliquant de faibles concentrations de colorant s'agitent de 2 m.
L'application de colorants fluorescents est simple, mais leurs spécificités sont mal caractérisées. L'une des principales forces de l'utilisation de colorants fluorescents est la simplicité préparative des protocoles expérimentaux. La culture et l'échantillonnage du champignon, l'ajout du colorant et le montage au stade du microscope sont (avec pratique) simples. Ajustement des paramètres d'imagerie de base, y compris les longueurs d'onde d'excitation et d'émission, les temps d'exposition, les réglages de cours, etc., suivre des règles biophysiques simples du microscope et les règles biologiques des colorants fluorescents utilisés à l'intérieur des cellules. Le tableau 1 vise à appuyer l'identification de la combinaison de colorant ou de teinture la plus appropriée aux fins d'expérimentation. En outre, les colorants fluorescents sont à un prix raisonnable, facilement disponibles avec une haute qualité fiable et assurent ainsi une application hautement reproductible.
Deux restrictions majeures de l'utilisation de colorants fluorescents sélectifs de membrane ou de paroi cellulaire sont la connaissance (souvent) limitée de leurs propriétés précises de coloration, qui dans la plupart des cas sont non spécifiques au niveau d'organelle et moléculaire, et leurs effets secondaires non désirés dépendants de la concentration. Les colorants FM sont spécifiques pour les bicouches lipidiques participant à l'endo- et à l'exocytose. Cependant, précisément quels organites subcellulaires deviennent successivement étiquetés dans les conditions examinées n'est pas immédiatement évident et exige la comparaison de différentes variantes de colorant FM, et le co-étiquetage avec des marqueurs organelle-spécifiques supplémentaires. La préférence de FM 1-43 pour les membranes mitochondriales, par rapport au FM 4-64, est un exemple. Les colorants sélectifs de paroi cellulaire présentent une spécificité variable pour les trois principaux polymères de la paroi cellulaire fongique. CFW est pensé pour être une tache non spécifique pour les glucanes et la chitine, SPF est pensé pour être le plus sélectif pour les -1,4-glucans, et CR est pensé pour être très sélectif pour les chitins et 'et '. Aucune information sur la spécificité de liaison du PFS aux polysaccharides de paroi cellulaire fongique n'est actuellement disponible. À quel rapport le polymère de la paroi cellulaire fongique est le plus efficacement étiqueté à une concentration de colorant donnée chez les espèces fongiques à l'étude n'est pas facilement répondu, et l'application de mesures détaillées acquises in vitro ou in vivo dans d'autres organismes ou d'autres espèces fongiques doit être considérée très attentivement. Malheureusement, cette information est clairsemée et très dispersée dans la littérature35,42,46. Les enregistrements plus récents qui suivraient les études précédentes33 pour fournir de nouvelles informations sur les propriétés précises de coloration des colorants en vedette spécifiquement dans les champignons ne sont pas actuellement disponibles.
Les contrôles d'imagerie sont essentiels pour évaluer avec précision les modèles de coloration et les réponses cellulaires. Probablement la partie la plus difficile, cependant, est de connaître la biologie cellulaire du champignon si bien que les changements enregistrés dans la localisation subcellulaire de la membrane et la paroi cellulaire des colorants fluorescents sélectifs, les altérations de l'architecture cellulaire ou le modèle de croissance hyphal peut exclusivement et en toute confiance être liée aux effets prévus du traitement expérimental. Pour cela, il est crucial d'avoir de bons contrôles en même temps que toute nouvelle expérience d'imagerie cellulaire vivante. Il s'agit notamment du type sauvage non traité comme contrôle d'imagerie négative pour exclure l'autofluorescence de fond et le bruit du détecteur de l'image acquise, et d'avoir un comparateur morphologique lors du travail avec des mutants. En outre, un contrôle d'imagerie positif, par exemple une souche qui exprime gFP ou RFP dans le cytoplasme ou une autre protéine de marqueur fluorescent bien connu, est essentiel pour définir l'intensité lumineuse d'excitation au minimum requis et avoir un contrôle de vitalité cellulaire. Une fois ces contrôles réglés, l'utilisation de colorants fluorescents ne se limite pas aux tâches de visualisation seulement, mais leur dynamique de coloration dépendante de la concentration, ainsi que les effets secondaires dépendants de la concentration peuvent être exploités analytiquement; par exemple, pour la surveillance quantitative de la biosynthèse de la paroi cellulaire en temps réel ou pour l'identification de phénotypes spécifiques aux mutants dans les essais de susceptibilité47.
L'amélioration des applications futures dépend d'une analyse fonctionnelle détaillée des propriétés de coloration des colorants. Un défi permanent majeur consiste à améliorer et à automatiser davantage les analyses quantitatives d'image afin de faire progresser l'évaluation fonctionnelle de la dynamique subcellulaire des colorants fluorescents sélectifs de la membrane et de la paroi cellulaire dans les champignons filamenteux. Pour cela, des études de co-localisation quantitatives approfondies de ces colorants avec des marqueurs connus d'organelle et de polymère de paroi cellulaire en combinaison avec des souches mutantes déficientes dans des voies de transport particulières ou qui manquent de composants structurels spécifiques sont d'abord nécessaires. Plusieurs marqueurs d'endocytose pour des analyses comparatives avec des colorants FM sont disponibles48,49, et en ce qui concerne les spécificités de liaison encore mal caractérisés des colorants de paroi cellulaire dans les champignons, l'application d'anticorps fluorescents spécifiques au glucan50 pourrait fournir une possibilité pour résoudre ce problème.

Il y a vingt ans, la façon dont la morphogénèse hyphaletée et la biologie cellulaire moléculaire sous-jacente pouvaient être visualisées dans les champignons filamenteux a été révolutionnée par l'application de la membrane sélective fluorescente Fei Mao colorant FM 4-641. Plus tard, l'avantage du colorant liant la chitin Calcofluor White comme marqueur fluorescent vital de la dynamique de la paroi cellulaire fongique a été réalisé2. Depuis lors, les colorants et les variantes de ceux-ci sont devenus une partie inhérente des analyses d'imagerie à cellules vivantes de la dynamique des organites chez les champignons, et continuent de fournir des informations sans précédent sur le mode de vie fongique filamenteux. Cet article détaille l'application de colorants fluorescents établis et moins connus pour suivre la dynamique de la membrane plasmatique, l'endo- et l'exocytose et la morphogénèse de la paroi cellulaire dans les champignons filamenteux. Les essais de suivi de l'endocytose permettent d'aborder diverses questions biologiques cellulaires liées à l'étude générale de l'endocytose3. Pour cela, la localisation, la vitesse et la succession des compartiments tachés sur l'ajout de colorant FM est enregistrée par microscopie time lapse et quantitativement comparée entre les souches fongiques testées4. Les colorants de paroi cellulaire délimitent la limite extérieure de la cellule et permettent le suivi des événements morphogenetic, y compris la croissance polarisée de pointe d'hyphal2,ramification d'hyphal5,fusion d'hyphal6,7 et formation de septum8. En outre, ils facilitent la quantification du dépôt localisé de paroi cellulaire et l'identification des défauts pendant la biogenèse de mur cellulaire9. Puisque la connaissance détaillée des propriétés biochimiques et biophysiques de n'importe quel marqueur fluorescent est une condition préalable fondamentale pour son application in vivo réussie, ces caractéristiques sont d'abord résumées pour les six colorants décrits dans cet article.
Colorants sélectifs à membrane FM (Fei Mao) teintures styryl sont de petites molécules amphiphiles qui ne peuvent pas passer à travers, mais réversiblement associer avec le dépliant externe de la bicouche lipidique des membranes biologiques10. Ils sont pratiquement non fluorescents dans la solution aqueuse, mais deviennent intensément fluorescents lors de l'intégration de la membrane plasmatique, générant d'excellents rapports signal-bruit (S/N)11. Ces propriétés les rendent idéalement adaptées pour visualiser la membrane plasmatique et la dynamique intracellulaire des organites, y compris le suivi de l'endo- et de l'exocytose12. Le FM 1-43 vert-fluorescent et le FM 4-64 rouge-fluorescent sont les deux marqueurs fluorescents les plus utilisés à ces fins. SynaptoGreen C4 et SynaptoRed C2 sont des molécules génériques de fournisseurs alternatifs qui peuvent être utilisées de façon interchangeable au lieu de FM 1-43 et FM 4-64, respectivement.
Les colorants styryles comprennent trois régions structurelles clés : (1) la queue lipophile qui facilite l'insertion du colorant dans la couche lipidique, (2) le noyau fluorophore qui détermine les propriétés spectrales du colorant et est constitué de deux anneaux aromatiques reliés par une à trois liaisons doubles, et (3) la tête hydrophile chargée positivement qui empêche l'insertion complète et la perméation du colorant à travers la membrane(Figure 1A).
Plus la queue lipophile est longue, plus l'hydrophobicité du colorant est élevée et donc l'affinité de liaison à la membrane, mais plus sa solubilité de l'eau et son taux de décoloration de la membrane sont faibles. Par conséquent, différentes variantes de teinture FM produisent différentes dynamiques et modèles de coloration. L'hydrophobicité plus élevée du FM 1-43 à queue C4 fournit un signal de fluorescence plus fort et plus stable aux membranes plasmatiques et aux organites internes plus rapidement que le FM 4-64 à queue C2 plus court, lorsqu'il est appliqué à des concentrations équimolaires (figure 2).
Fait important, les taux constants et élevés d'association/dissociation des deux colorants FM11 avec des temps de rétention moyens de 1 à 6 s par molécule de colorant individuel13 réduisent les chances de perturbation localisée de la fonction membranaire, par exemple, par la modification de la fluidité membranaire ou l'interaction permanente forcée des protéines membranaires. C'est probablement la principale raison pour laquelle ces molécules peuvent être utilisées comme colorants vitaux. Néanmoins, les concentrations de colorant FM au-dessus de 50 M sont toxiques pour les cellules fongiques et végétales2,14, et les preuves de BY-2 protoplastes de tabac indique que plus de 20 M FM colorant conduire à la saturation de la membraneplasmatique 14. Il est donc conseillé de ne pas dépasser cette limite, d'autant plus que l'imagerie a été obtenue avec aussi peu que 2 à 5 M15,16.
Notamment, les propriétés spectrales des colorants FM varient considérablement en fonction du microenvironnement membranaire particulier (révisé14). En général, les spectres d'excitation et d'émission des colorants FM dans les solutions de solvantpur pur (comme cela est habituellement fourni dans les informations sur le produit) diffèrent considérablement de ceux des environnements cellulaires et ne peuvent, dans la plupart des cas, pas directement être consultés pour la sélection des paramètres d'imagerie des cellules vivantes. Les maxima d'excitation/émission de FM 1-43 et FM 4-64, par exemple, deviennent bleus décalés de 37/46 nm et 43/64 nm, respectivement, lorsqu'ils sont liés à des membranes fongiques par rapport à leurs solutions dans le méthanol (tableau 1).
Les principes fondamentaux révolutionnaires pour l'utilisation de FM 4-64 et FM 1-43 pour le suivi de la membrane plasmatique, de l'endo-/exocytose et de la dynamique des organites, y compris le Spitzenkârper et les mitochondries, ont déjà été entièrement documentés pour un large éventail d'espèces fongiques filamentes précédemment2,4,17,18,19. Les paramètres d'imagerie recommandés pour les deux colorants FM qui fonctionnent dans diverses espèces fongiques filamenteuses sont représentés dans la figure 1B. Les limitations techniques de l'équipement disponible ou des conditions cellulaires et expérimentales particulières, telles que le milieu de culture, le pH ou la température, peuvent toutefois nécessiter certaines adaptations. Heureusement, les colorants FM fonctionnent sur une large gamme spectrale, et de très bons résultats d'imagerie sont obtenus par FM 1-43 passionnant avec 514 nm ou FM 4-64 avec 488 nm. Par conséquent, les paramètres d'imagerie optimaux doivent être déterminés individuellement pour chaque type d'échantillon et l'application prévue.
Le déplacement considérable de Stoke de plus de 135 nm de FM 4-64 permet une excellente co-imagerie simultanée avec des fluorophores émettant la lumière verte ; ceci est fréquemment exploité pour évaluer la dynamique intracellulaire de localisation des protéines fluorescentes vertes (GFP)-étiquetées de fusion par rapport à la membrane de plasma et à la voie endocytic9,20.
Colorants sélectifs par parmure cellulaire Calcofluor White M2R (CFW), également commercialisé sous le nom de Fluorescent Brightener 28, est probablement le colorant fluorescent le plus connu utilisé pour tacher les parois cellulaires des bactéries, des champignons, des algues, des plantes plus élevées et des insectes. Initialement utilisé comme agent de blanchiment optique dans l'industrie du papier, du textile et du détergent, ses avantages pour le diagnostic clinique des infections fongiques ont été réalisés dès le21,22. Parce que CFW intercale de façon irréversible dans la chaîne naissante de chitin il perturbe l'assemblage microfibril de chitin normal pendant la biogenèse de mur cellulaire générant de ce fait l'effort de paroi cellulaire23. Ceci déclenche à son tour un mécanisme de réparation de dommages de paroi cellulaire menant au dépôt localement augmenté de paroi de cellules en raison de l'activation de synthase de glucane et de chitin24,25. Ce phénomène peut se produire avec n'importe quel colorant qui fonctionne en se liant de façon stable aux polymères de la paroi cellulaire, est dépendant de la concentration et est plus perceptible aux pointes d'hyphal qui représentent les parties les plus prolifiques de plus en plus et donc les plus sensibles du mycélium (Figure 3). Un résumé complet de la machinerie moléculaire qui répond aux dommages de la paroi cellulaire a récemment été fourni26.
Teinture surchargée en combinaison avec la phototoxicité peut conduire à une lyse cellulaire rapide des compartiments hyphal (Film 1). Néanmoins, une sensibilité accrue aux concentrations de colorants qui sont « vitales » dans le type sauvage peut être exploitée pour identifier les défauts dans la biosynthèse de la paroi cellulaire des mutants de perte de fonction de gène9. Pour CFW et Congo Red (CR), un autre colorant textile également connu sous le nom direct rouge 28 et employé comme tache de paroi cellulaire spécifique à la chitine pour les champignons et les insectes27,28, concentrations seuils qui induisent fortement les synthases de chitine ont été déterminées avec 'gt; 60 M CFW et 70 M CR, respectivement, tandis que les concentrations de15 m de colorant n'ont pas modifié ou inhibé la croissance fongique29,30,31. Hickey et coll. ont placé cette concentration de seuil pour CFW à 25 M2. Par conséquent, il est conseillé d'utiliser des concentrations de colorants de 5 m pour exclure les artefacts liés au stress et s'assurer d'utiliser ces molécules comme véritables « colorants fluorescents vitaux »2,32. Cela vaut également pour Solophenyl Flavine 7GFE 500 (SPF) et Pontamine Fast Scarlet 4B (PFS), synonyme de Direct Yellow 86 et Direct Red 23, respectivement, deux autres colorants de paroi cellulaire utiles dont l'application pour les champignons a été signalée pour la première fois il ya plus d'une décennie33. Mais malgré leurs remarquables propriétés spectrales34,35, l'utilisation des deux colorants a depuis lors été très limitée36,37. Comme indiqué précédemment pour 1,5 M CFW2, 2 M SPF sont suffisants pour résoudre la dynamique de la paroi cellulaire dans des conditions indigènes avec une résolution temporelle très élevée (Movie 2). Les mêmes résultats peuvent être obtenus avec 2 'M CR ou PFS.
Ensemble, ces quatre colorants, CFW, SPF, PFS et CR, comprennent un ensemble de marqueurs fluorescents sélectifs par mur cellulaire qui couvrent presque le spectre complet de lumière d'émission visible (400 à 700 nm) utilisé sur les microscopes fluorescents modernes(figure 4). L'augmentation significative de l'intensité de fluorescence lors de la liaison aux polymères de paroi cellulaire est inhérente aux quatre et génère d'excellents s/N-ratios. Ceci permet à son tour de maintenir des concentrations de colorant et l'intensité lumineuse d'excitation très basse et permet d'exécuter la coloration de mur cellulaire comme technique de « basse dose » d'imagerie de cellules vivantes2. Puisque ces colorants de paroi cellulaire sont imperméables de membrane de plasma, ils fonctionnent simultanément comme taches vivantes/mortes. Notamment, en raison de leurs spectres de lumière d'émission extrêmement larges, certaines limitations concernant les propriétés de co-imagerie de CFW et SPF avec d'autres fluorophores doivent être soigneusement examinées.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BRAND cell counting chamber</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR718005</td>
			<td>Thoma format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White M2R</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3543</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td>water immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td>water immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo Red</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6277</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>8,36,73,230</td>
			<td>organic solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 1-43</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6814</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6689</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>Rettberg</td>
			<td>1340691030</td>
			<td>3 mm glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BB02400600A113MNT0</td>
			<td>24 x 60 # 1 glass cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506353</td>
			<td>glycerol immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 Meta</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Minimal Medium</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td>generic fungal growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-slide 8-well</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>ibiTreat #1.5 polymer coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>polyester filtration material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>8,21,472</td>
			<td>92 x 16 mm culture dish w/o cams</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td>transparent gelling agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440762-9904-000</td>
			<td>oil immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pontamine Fast Scarlet 4B</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>212490</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>213400</td>
			<td>fungal growth medium for T. atroviride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Broth (PDB)</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>254920</td>
			<td>fungal growth medium for T. atroviride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706</td>
			<td>1.5 mL SafeSeal tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>5518016</td>
			<td>Cutfix sterile scalpel #23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>6,25,54,502</td>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solophenyl Flavine 7GFE 500</td>
			<td>CIBA</td>
			<td>1485385V6</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynaptoGreen C4</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>70020</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynaptoRed C2</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>70021</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe membrane filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>723-9945</td>
			<td>0.45 &#181;m SFCA syringe filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td>Leica</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vogel&#39;s Minimal Medium (VMM)</td>
			<td>FGSC</td>
			<td>Fungal Genetics Stock Centre</td>
			<td>fungal growth medium for N. crassa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging of filamentous fungi

L'application de colorants fluorescents sélectifs de membrane et de paroi cellulaire pour des analyses d'imagerie de cellules vivantes de la dynamique des organlions dans les cellules fongiques a commencé il y a deux décennies et continue depuis de contribuer grandement à notre compréhension du fongique filamenteux Vie. Cet article fournit un guide pratique pour l'utilisation des deux colorants membranaires FM 1-43 et FM 4-64 et les quatre taches de paroi cellulaire Calcofluor White M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 et Congo Red. L'accent est mis sur leur application à faible dose pour déterminer la coloration sans artefacts, leurs propriétés de co-imagerie, et leur évaluation quantitative. Les méthodes présentées s'appliquent à tous les échantillons fongiques filamenteux qui peuvent être préparés de la manière décrite. Les approches fondamentales de coloration peuvent servir de points de départ pour l'adaptation à des espèces qui pourraient nécessiter des conditions de culture différentes. Tout d'abord, les propriétés biophysiques et biochimiques sont examinées car leur compréhension est essentielle pour l'utilisation de ces colorants comme taches fluorescentes vraiment vitales. Deuxièmement, des protocoles étape par étape sont présentés qui détaillent la préparation de divers types d'échantillons fongiques pour l'imagerie fluorescente des cellules vivantes. Enfin, des exemples d'expériences illustrent différentes approches pour : (1) identifier les défauts dans l'organisation spatio-temporelle de l'endocytose chez les mutants génétiques, (2) caractériser comparativement la co-localisation partagée et distincte des protéines cibles étiquetées GFP dans la voie endocytique, (3) identifient les défauts morphogénétiques de paroi de cellules dans un mutant génétique, et (4) surveillent la biogenèse de mur cellulaire en temps réel.

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Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

Les colorants fluorescents vitaux sont des outils essentiels pour les analyses d'imagerie des cellules vivantes dans la biologie des cellules fongiques modernes. Cet article détaille l'application de colorants fluorescents établis et moins connus pour suivre la dynamique de la membrane plasmatique, l'endo-/exocytose et la morphogénèse de la paroi cellulaire dans les champignons filamenteux.

Application de colorants fluorescents sélectifs de membrane et de mur cellulaire pour l'imagerie de cellules vivantes des champignons filamenteux

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

Les colorants fluorescents sélectifs de membrane et de mur cellulaire sont des outils importants pour l’analyse de la dynamique organelle et des cellules fongiques vivantes. Nos protocoles fournissent un contexte théorique essentiel et des lignes directrices pratiques pour l’application d’une sélection de ces colorants comme taches vraiment vitales. Le point clé pour cela est d’utiliser des concentrations de colorants très faibles qui ne causent pas d’artefacts cellulaires liés à la saturation ou la toxicité des colorants tout en fournissant de bons rapports signal/bruit pour l’imagerie cellulaire vivante de haute qualité et à long terme.Avec des collègues du Département de médecine nucléaire de l’université médicale, nous avons récemment utilisé ces techniques de coloration pour développer une nouvelle approche pour le diagnostic guidé par l’image de l’aapergillose. La capacité de surveiller les structures des membranes et des paroi cellulaires en temps réel était cruciale pour déterminer la dynamique d’absorption du composé expérimental du médicament. Pour commencer cette procédure, d’abord obtenir une préculture préparée.Utilisez un scalpel de stéril pour couper un petit bloc d’agar qui transporte le mycélium non sporulant du bord de la colonie de la préculture. Placez le bloc d’agar au centre d’une assiette moyenne fraîche et solide pour inoculer la culture expérimentale. Incuber la culture expérimentale selon le stade de développement destiné à être incubé.La préparation de l’échantillon est quelque peu délicate et l’optimisation des paramètres d’acquisition d’images est assez complexe. La démonstration visuelle des deux procédures accompagnée de l’explication verbale facilite grandement la réplicabilité. Pour monter les échantillons, gardez un glissement de couverture en verre propre de 24 par 60 millimètres prêt et ajoutez 18 microlitres de solution de sel moyen ou physiologique minimal liquide sur le centre.Ajouter deux microlitres de la solution de travail de teinture de 20 micromolaires préparée au liquide au centre de la feuille de couvercle et bien mélanger en pipetting de haut en bas à plusieurs reprises tout en évitant la production de bulles d’air. À l’aide d’un scalpel propre, découpez un échantillon de 15 par 15 millimètres de la périphérie de la colonie et placez-le verticalement à côté de la goutte moyenne sur le glissement de couverture. Utilisez le scalpel pour soutenir le bord supérieur du bloc et un doigt pour maintenir le côté arrière du bloc en place.Puis, abaissez lentement le côté portant le mycélium sur le liquide. Montez l’échantillon préparé sur l’étape du microscope. Tout d’abord, ajustez les paramètres d’acquisition d’image de base pour capturer la dynamique debout dans les hyphes individuels tels qu’ils sont décrits dans le protocole de texte.Pour les analyses d’absorption de l’endocytose, consultez la figure un et le tableau un du protocole texte pour identifier les meilleurs paramètres d’excitation et d’émission pour fm 143 ou FM 464 qui sont disponibles sur le système de microscopie et ajuster ces paramètres dans le système en conséquence. Commencez l’enregistrement d’images à l’aide des paramètres précédemment ajustés et évaluez les résultats. Ensuite, optimisez les paramètres d’acquisition d’image à la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour capturer l’aspect de la membrane plasmatique ou de la dynamique d’endocytose sur quoi l’expérience se concentre.Pour la dynamique de la paroi cellulaire, consultez la figure quatre et le tableau un du protocole textuel afin d’identifier les meilleurs paramètres d’excitation et d’émission pour le colorant à paroi cellulaire appliquée et d’ajuster les paramètres du système de microscopie en conséquence. Commencez l’enregistrement d’images à l’aide des paramètres précédemment ajustés et évaluez les résultats. Ensuite, optimisez les paramètres d’acquisition d’image à la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour capturer l’aspect de la morphogenèse de la paroi cellulaire sur qui l’expérience se concentre.En plus de simplement visualiser les processus cellulaires, l’imagerie cellulaire en direct permet l’extraction d’informations quantitatives à partir des données enregistrées. Dans un exemple des analyses d’absorption fm 464, les échantillons fongiques sont cultivés en colonies et montés par la méthode du bloc d’agar inversé. Les analyses ont identifié des défauts dans l’organisation spatio-temporelle de l’endocytose dans la suppression de gène et les mutants sur-exprimants de gène de la protéine spécifique fongique SFP 2 de l’atroviride de trichoderma.Des exemples de co-coloration fm 464 de protéines de fusion fluorescentes ciblées sur les compartiments endocytiques sont montrés ici. Cette co-coloration est employée pour relier la distribution subcellulaire des deux protéines fluorescentes vertes améliorées marquées protéines transmembrane, SFP 2 et GPR 1, à la voie endocytique dans l’atroviride de trichoderma. Un exemple de co-coloration fm 464 pour l’identification des différences morphogenétiques montre que cette co-coloration permet une relation supplémentaire de la dynamique de localisation subcellulaire de la protéine complexe polarisme BUD-6 étiquetée flourescently à la fin de certains processus dépendant du trafic tels que la formation de septa et la croissance polarisée de pointe hyphale.Il caractérise également les différences dans l’organisation subcellulaire et l’architecture hyphale entre le type sauvage et les souches mutantes de neurospora crassa. La coloration représentative de la paroi cellulaire montre que les différentes propriétés d’interaction du calcofluor blanc, de la flavine solophényle et du rouge congo avec des polymères à paroi cellulaire mettent en évidence les différences morphogenétiques entre le mutant delta SFP 2 et la souche sauvage de trichoderma atroviride. L’augmentation du stress de la paroi cellulaire infligée par des concentrations élevées de colorants se produit plus rapidement et est plus prononcée chez le mutant par rapport au type sauvage.En outre, les mêmes images permettent la quantification des différences morphogenétiques concernant le diamètre hyphal et la distance septale entre les deux souches. La surveillance représentative en temps réel de la biosynthèse des paroi cellulaires indique que la très faible concentration de blanc calcofluor empêche la saturation de la paroi cellulaire avec des molécules de colorant et permet une surveillance quantitative en temps réel de la biosynthèse des paroi cellulaires. Ceci indique que le dépôt du nouveau matériel de paroi cellulaire n’est pas uniforme, mais répond très rapidement aux contraintes physiques localisées résultant du déplacement relatif d’une cellule sur l’attachement de cellule à cellule avant la dermalinfusion dans la crassa de neurospora.Moins, c’est plus. Utilisez le moins de colorant possible pour empêcher l’interférence du marqueur fluorescent avec les processus cellulaires. Après cette procédure, la récupération de flourescence après des expériences de photo-blanchiment a pu être exécutée pour quantifier le transport et la cinétique de biogenèse.L’introduction pionnière de la coloration des membranes et des paroi cellulaires dans les champignons filamenteux au début du millénaire a littéralement révolutionné notre façon de voir les champignons. Calcofluor blanc peut causer des irritations oculaires et est un cancerigen classé. Congo rouge est cancérogène et tératogène, donc s’il vous plaît porter la protection des yeux et de la peau lors de la manipulation de ces teintures.

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