Name: application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging of filamentous fungi
Uploaded: 2019-11-28T15:00:00
Duration: 7 min 44 s
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Dank geht an den Tiroler Wissenschaftsfonds (TWF) für die Gewährung #256524 an AL, an den Wiener Wissenschafts- und Technologiefonds (WWTF) für die Gewährung #LS13-086 an die SZ und an den Publikationsfonds der Universität Innsbruck für die Unterstützung der Open-Access-Publikation. Die Autoren danken auch der Klinik für Zoologie der Universität Innsbruck für die Bereitstellung des konfokalen Laserscanmikroskops Leica TCS SP5 II.

1. Herstellung von Pilzproben
<ol><li>Pilzvorkulturen<ol>
<li>Impfen Sie die gewünschte Belastung eines geeigneten soliden Agarmediums, wie Z.B. Kartoffeldextrose Agar (PDA) für Trichoderma-Atrovidid oder Vogels Minimal Medium (VMM) für Neurospora crassa. Fügen Sie eine geeignete Auswahlmarkierung hinzu, wenn Sie mit transformierenden Stämmen arbeiten.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Vorkultur bei der optimalen Temperatur des Organismus. Zum Beispiel T. Atroviride bei 25 °C und N. crassa bei 30 °C und 12 h/12 h helle/dunkle Zyklen, bis sich ein sporierendes Myzel entwickelt hat, aber noch nicht den Rand der Platte erreicht hat. Bei einer Petrischale in Standardgröße (9,2 cm) nimmt dies den Wildtyp T. atroviride im Durchschnitt von 4 bis 6 Tagen, während der N. crassa wild type diese Stufe nach durchschnittlich 3–4 Tagen erreicht.</li>
	</ol></li>
	<li>Kultivierung von Pilzkolonien<ol>
<li>Schneiden Sie mit einem sterilen Skalpell einen kleinen 3 mm x 3 mm Agarblock mit nicht sporenförmigem Myzel vom Kolonierand der Vorkultur.</li>
		<li>Platzieren Sie den Agarblock in der Mitte einer frischen massiven Mittelplatte, um die experimentelle Kultur zu impfen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die experimentelle Kultur entsprechend dem Entwicklungsstadium, das untersucht werden soll. So benötigt der Wilde-Typ T. atroviride 20–22 Stunden bei 25 °C im Dunkeln, um Kolonien von etwa 2 cm Durchmesser auf PDA zu entwickeln, während der Wildetyp N. crassa nach 14–16 h Inkubation bei 30 °C im Dunkeln auf VMM Koloniedurchmesser von etwa 4 cm erreicht. HINWEIS: Die Inkubation im Dunkeln verhindert die Bildung von Pigmenten, die eine Autofluoreszenz einleiten könnten. Um die mittlere Hintergrundfluoreszenz aus der experimentellen Kultur zu eliminieren, ersetzen Sie Agar durch 1,5 % w/v eines transparenten Erstarrungsmittels (siehe Materialtabelle)und jedes komplexe Medium durch ein definiertes minimales Medium.</li>
	</ol></li>
	<li>Kultivierung fester Keimkulturen<ol>
<li>Verwenden Sie 5 ml sterile physiologische Salzlösung (0,9% w/v NaCl), um Konidialsporen von der Vorkulturplatte zu ernten und die resultierende Sporensuspension in einem 15 ml Schraubverschlussrohr zu sammeln.</li>
		<li>Mischen Sie die Sporenaufhängung gut durch kräftiges Wirbeln und filtern Sie sie anschließend über einen 1 cm x 5 cm langen Streifen sterilen Filtergewebes (siehe Materialtisch)leicht in eine 1 ml Pipettenspitze (sowohl montiert als auch autoklaviert) in ein frisches steriles Rohr.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Sporendichte mit einer Zellzählkammer und bereiten Sie eine 1 x 107 Zellen/ml Sporensuspension mit physiologischer Salzlösung vor. HINWEIS: Die Sporensuspension kann bis zu zwei Wochen bei 4 °C gehalten werden.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Standard-Petrischale (9,2 cm) mit 20 ml festem Medium vor und fügen Sie 15–20 sterile Glasperlen (3 mm) oben hinzu.</li>
		<li>Pipette 200 l der Sporensuspension auf die mittlere Platte und verteilt die Zellen durch sanftes Schütteln gleichmäßig über die gesamte Platte. Sammeln Sie die Glasperlen in einen Becher mit 70% Ethanol zur Wiederverwendung.</li>
		<li>Inkubieren Sie die experimentelle Kultur entsprechend dem Entwicklungsstadium, das untersucht werden soll. Zum Beispiel benötigt der T. atroviride Wildtyp 5–6 h bei 25 °C im Dunkeln, um Konidialkeime auf PDA zu entwickeln, während der N. crassa wild Typ nach 3-4 h Inkubation bei 30 °C im Dunkeln auf VMM Konidialkeime entwickelt. ANMERKUNG: Um jegliche fluoreszenz mittlere Hintergrunddaten aus der experimentellen Kultur zu eliminieren, ersetzen Sie Agar durch 1,5 % w/v eines transparenten Erstarrungsmittels und jedes komplexe Medium durch ein definiertes minimales Medium.</li>
	</ol></li>
	<li>Kultivierung flüssiger Keimkulturen<ol>
<li>Füllen Sie 190 l flüssiges Kulturmedium in jeden Brunnen eines 8-well-kammerförmigen Mikroschlittens.</li>
		<li>Fügen Sie 10 l einer 1 x 107 Zellen/ml Sporenlösung (in den Schritten 1.4.1–1.4.3) hinzu und mischen Sie sie, indem Sie ein paar Mal sanft nach oben und unten pipetieren. Die resultierende Gesamtzahl der Zellen beträgt 1 x 105 pro Bohrkörper.</li>
		<li>Inkubieren Sie die experimentelle Kultur entsprechend dem Entwicklungsstadium, das untersucht werden soll. So benötigt der Wildetyp T. atroviride 5–6 h bei 25 °C im Dunkeln, um in Kartoffeldextrosebrühe (PDB) Konidialkeime zu entwickeln, während der wilde Typ N. crassa nach 3–4 h Inkubation bei 30 °C in der Dunkelheit in flüssigem VMM Konidialkeime entwickelt.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Vorbereitung von Farbstoffbearbeitungslösungen
<ol><li>Um die volle Löslichkeit jedes Farbstoffs zu gewährleisten, bereiten Sie 2 mM Stofflösungen in Dimethylsulfoxid (DMSO) vor, indem Sie die entsprechende Menge (siehe genaue Gewichte in Tabelle 1)auf 1 ml 100% DMSO hinzufügen und durch Wirbelgut vermischen. VORSICHT: Achten Sie darauf, den DMSO aus einer septumversiegelten Flasche zu entnehmen; es sollte eine klare transparente Flüssigkeit sein. Bei Kontakt mit Luft wird DMSO braun – wahrscheinlich aufgrund der Oxidation von Spurenunreinheiten – und kann sich negativ auf das Zellwachstum oder die Färbefärbung auswirken.</li>
	<li>Filter sterilisieren die Stammlösung durch einen 0,2 m Spritzenmembranfilter in ein frisches steriles 1,5 ml Reaktionsrohr. Um die Farbstoffbleiche zu minimieren, wickeln Sie das Rohr in Aluminiumfolie. HINWEIS: Die Farbstoffstofflösung kann in kleinere Volumina eingepfert werden, um Auftau-/Gefrierzyklen zu vermeiden, und mehrere Monate bei 4 °C gehalten werden.</li>
	<li>Bereiten Sie eine wässrige Lösung für wässrige Farbstoffe von 20 m vor, indem Sie 2 l Farbstammlösung in 198 l sterilen destillierten Wassers in einem frischen sterilen 1,5 ml Reaktionsrohr auflösen. Um die Farbstoffbleiche zu minimieren, wickeln Sie das Rohr in Aluminiumfolie. HINWEIS: Die Farbstoffarbeitslösung sollte am Tag des Experiments frisch zubereitet werden.</li>
	<li>Während der Probenmontage (siehe Abschnitt 3) wird die Farbstoffarbeitslösung standardmäßig 1:10 verdünnt, was zu einer Endfarbstoffkonzentration von 2 m und 0,1% w/v End-DMSO-Konzentration führt. HINWEIS: Die Wahl verschiedener Verdünnungsfaktoren durch einfaches Ändern des Volumenverhältnisses zwischen Farbstoffarbeitslösung und Montageflüssigkeit ermöglicht eine einfache Anpassung der gewünschten Endfarbstoffkonzentration. VORSICHT: Um unerwünschte Wirkungen durch Farbstoff- oder DMSO-Toxizität zu vermeiden, sollte der Verdünnungsfaktor nicht unter 1:4 fallen, um maximale Endkonzentrationen von 5 m Farbstoff und 0,4 % w/v DMSO zu erzielen. Höhere Farbkonzentrationen sättigen das System schnell und verhindern eine zuverlässige Signalquantifizierung, während mehr als 0,5 % w/v (ca. 62,5 mM) DMSO die Zellentwicklung beeinträchtigen können38.</li>
</ol>3. Probenvorbereitung für die Mikroskopie
<ol><li>Mountproben aus Pilzkolonien (Schritt 1.2) oder festen Keimkulturen (Schritt 1.3) nach der invertierten Agarblock-Methode.<ol>
<li>Halten Sie einen sauberen 24 mm x 60 mm Glasdeckel (#1 = 0,13–0,16 mm Dicke) bereit und fügen Sie 18 l flüssiges Minimalmedium (VMM oder M9) oder physiologische Salzlösung in die Mitte.</li>
		<li>Fügen Sie der 20-Mm-Farblösung 2,5 Km der Flüssigkeit hinzu und mischen Sie sie gut, indem Sie mehrmals nach oben und unten pfeifen und gleichzeitig die Produktion von Luftblasen vermeiden. HINWEIS: Bei der Arbeit mit mehreren Proben ist es ratsam, eine Master-Mischung aus Flüssigfarbstofflösung für alle vorzubereiten, um eine gleiche Farbstoffkonzentration während des gesamten Experiments zu gewährleisten.</li>
		<li>Mit einem sauberen Skalpell eine 15 mm x 15 mm Probe aus der Peripherie der Kolonie oder der festen Keimkultur herausschneiden und vertikal neben dem mittleren Tropfen auf den Deckelschlupf legen.</li>
		<li>Mit dem Skalpell, um die obere Kante des Blocks zu unterstützen und einen Finger, um die Rückseite des Blocks an Ort und Stelle zu halten, langsam senken Sie die Seite tragen das Myzel oder Keime auf die Flüssigkeit. Die Probe ist nun bereit für den Transfer auf die Mikroskopstufe. VORSICHT: Es ist wichtig, dies langsam und sehr sorgfältig zu tun, um die mechanische Belastung der Zellen zu minimieren und zu vermeiden, dass Luftblasen zwischen Probe und Abdeckungsschlupf gefangen werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montieren Sie die flüssigen Keimkulturen aus Schritt 1.4. HINWEIS: Am bequemsten können flüssige Keimkulturen in kammerförmigen Mikrobrunnenschlitten direkt übertragen und auf der Mikroskopstufe weiter manipuliert werden.<ol>
<li>Fügen Sie 22 l Farbstoff-Arbeitslösung zu 200 l flüssigem Medium hinzu, um Standard-Endkonzentrationen von 2 M Farbstoff und 0,1 % w/v DMSO zu erzielen. HINWEIS: Flüssige Keimkulturen haben den großen Vorteil, dass Fluoreszenzfarbstoffe (oder andere Chemikalien, wie Inhibitoren) zu jedem gewünschten Zeitpunkt des Experiments, auch während der Aufzeichnung, zugesetzt werden können. In diesem Fall ist besonders darauf zu achten, dass die Flüssigkeitstropfen sehr langsam verabreicht werden, um die Zellen nicht zu stören. Systemschwingungen und Brownsche Bewegung könnten bereits einige Zellbewegungen einführen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Live-Zell-Mikroskopie
<ol><li>Passen Sie die grundlegenden Einstellungen für die Bildaufnahme an. Die folgenden Bildaufnahmeeinstellungen ermöglichen die Erfassung von Färbedynamiken in einzelnen Hyhasen und sind auf die beiden folgenden Assays anwendbar.<ol>
<li>Wenden Sie 5–10% Laserleistung von 20% der vollen Ausgangsleistung des Geräts an.</li>
		<li>Verwenden Sie ein Plan Apo 60x–63x Glycerin oder Wasser Immersion objektiv mit einer hohen numerischen Blende bei 1,2.</li>
		<li>Beschränken Sie den Bildaufnahmebereich auf die Umrisslinie des Hyphen, indem Sie eine Bildgröße von 1024 x 256 Pixel festlegen und einen optischen Zoomfaktor von 2–3 verwenden.</li>
		<li>Verwenden Sie bidirektionales Scannen mit 400 Hz. Passen Sie die Lochgröße auf 1 Luftige Einheit an.</li>
		<li>Stellen Sie die Verstärkung des empfindlichsten Detektors auf 100 % ein.</li>
		<li>Für die Zeitrundenaufnahme beginnen Sie mit der Bildaufnahme mit einem Frame alle 15 s, um eine angemessene zeitliche Auflösung zu ermöglichen, ohne Eine Farbbleichung oder Fotobeanspruchung zu erzeugen.</li>
		<li>Legen Sie für die 3D-Aufnahme die obere und untere räumliche Grenze auf die Grenze der hyphenischen und raumoptischen Abschnitte 1 m auseinander, um eine angemessene räumliche Auflösung zu ermöglichen. HINWEIS: Aufgrund des schnellen Wachstums von Hyphen wurde eine hohe räumliche Auflösung in der Z-Achse oft für eine hohe zeitliche Auflösung in der X/Y-Achse oder umgekehrt geopfert. Nur sehr moderne konfokale Laserscanmikroskope sind schnell genug, um beide Anforderungen zu erfüllen.</li>
	</ol></li>
	<li>Endozytose-Aufnahme-Assays<ol>
<li>In Abbildung 1 und Tabelle 1 finden Sie die besten Anregungs-/Emissionseinstellungen für FM 1-43 und/oder FM 4-64, die auf dem Mikroskopiesystem verfügbar sind, und passen Sie entsprechend an. HINWEIS: Mit der empfohlenen Konzentration von 2 M ist die Aufnahme von FM-Farbstoff in die Plasmamembran in normalen gesunden Zellen sofort erfolgt. Der gesamte Prozess von der anfänglichen Plasmamembranfärbung bis zum Farbstoffaussehen in röhrenförmigen Vakuolen wird in der Regel innerhalb von 30–45 min bei Raumtemperatur abgeschlossen. Die Erhöhung der FM-Farbstoffkonzentration erhöht das S/N-Verhältnis und erzeugt dadurch schneller kontrastreichere Bilder. Es beschleunigt jedoch auch den Etikettierungsprozess, was es schwieriger macht, die chronologische Abfolge der Organellenfärbung zu unterscheiden.</li>
		<li>Starten Sie die Bildaufzeichnung mit den oben empfohlenen grundlegenden Bildaufnahmeeinstellungen und werten Sie die Ergebnisse aus.</li>
		<li>Optimieren Sie die Einstellungen für die Bildaufnahme auf die räumliche und zeitliche Auflösung, die erforderlich ist, um den Aspekt der Plasmamembran oder Endozytosedynamik zu erfassen, auf die sich das Experiment konzentriert.</li>
		<li>Um beispielsweise eine sehr schnelle Dynamik in X/Y zu erfassen, die Gesamtbildgröße zu verringern, nur eine Fokusebene abzubilden und die Scanrate auf 1 fps zu erhöhen. Verringern Sie bei höherer Auflösung in der Z-Achse die Auflösung in X/Y, verringern Sie die Bildgröße und verringern Sie den Abstand zwischen optischen Abschnitten auf 0,5 m.</li>
	</ol></li>
	<li>Zellwanddynamik<ol>
<li>In Abbildung 4 und Tabelle 1 finden Sie die besten Anregungs-/Emissionseinstellungen für den auf dem Mikroskopiesystem verfügbaren aufgebrachten Zellwandfarbstoff und passen Sie entsprechend an. HINWEIS: Aufgrund ihrer breiten Emissionsspektren eignen sich CFW und SPF nicht gut für die gleichzeitige Ko-Imaging mit anderen Fluorophoren, vorwiegend GFP. Einige Einschränkungen gelten sogar für sequenzielle Bildgebungsansätze mit diesen Farbstoffen und müssen daher individuell optimiert werden.</li>
		<li>Starten Sie die Bildaufzeichnung mit den oben empfohlenen grundlegenden Bildaufnahmeeinstellungen und werten Sie die Ergebnisse aus. HINWEIS: Bei der empfohlenen Konzentration von 2 M ist die Aufnahme von Farbstoff in die Zellwand nicht unbedingt sofort, sondern einigermaßen schnell. Der gesamte Prozess der Septumbildung, zum Beispiel, dauert im Durchschnitt etwa 5–7 min bei Raumtemperatur20. Die Erhöhung der Zellwandfarbstoffkonzentration erhöht das S/N-Verhältnis und erzeugt dadurch schneller kontrastreichere Bilder. Es führt jedoch auch schnell Artefakte aufgrund von induzierten Zellwandschäden Reparatur.</li>
		<li>Optimieren Sie die Einstellungen für die Bildaufnahme auf die räumliche und zeitliche Auflösung, die erforderlich ist, um den Aspekt der Zellwandmorphogenese zu erfassen, auf den sich das Experiment konzentriert, wie in Abschnitt 4.2.3 beschrieben.</li>
	</ol></li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen und nichts zu offenbaren haben.

Dieser Artikel setzt die bahnbrechende Arbeit fort, die die Verwendung verschiedener fluoreszierender Farbstoffe als lebenswichtige Organelle-Marker für fadenförmige Pilze in den frühen 2000er Jahren2,4,43, und versucht, die photophysikalischen und zellbiologischen Eigenschaften von FM-Farbstoffen und ausgewählten Zellwandfarbstoffen detaillierter als zuvor zu diskutieren. Vor allem im Hinblick auf unerwünschte zelluläre Effekte, wie Membransättigung oder Zellwandschäden, die oberhalb bestimmter Farbstoffkonzentrationen auftreten. Was bisher auf zellulärer Ebene als ungiftig galt, gilt heute auf molekularer Ebene als toxisch. Auch wenn diese Effekte sehr subtil sein können und nicht direkt durch offensichtliche Veränderungen des Organellen- oder Zellverhaltens erkennbar sind, müssen mögliche Interferenzen der Farbstoffanwendung außer der Visualisierung für die Untersuchung der nativen molekularen Funktion minimiert werden. Glücklicherweise erleichtern eine verbesserte Empfindlichkeit und Quanteneffizienz moderner Detektoren wie Siliziumlawinenphotodiodendetektoren (Si-APDs)44 oder des Airyscan-Bereichsdetektors45den Einsatz noch geringerer Farbstoffmengen als bisher. Ein weiteres wichtiges Ziel des Artikels ist es, die Co-Imaging-Eigenschaften dieser Farbstoffe mit anderen Fluorophoren zu veranschaulichen, vor allem mit denen von GFP als dem am häufigsten verwendeten fluoreszierenden Protein in der Biologie. Dies sollte die Entwicklung von bildgebenden Experimenten unterstützen, die darauf abzielen, die subzelluläre Lokalisationsdynamik von fluoreszierenden Fusionsproteinen mit denen der Pilzzellwand, der Plasmamembran oder des Endo- und Exozytosewegs usw. zu korrelieren.
Die Bildgebung unter natürlichen und stressfreien Bedingungen ist der Schlüssel für die Erfassung zuverlässiger Daten. Einige praktische Überlegungen zur Kulturmedium- und Probenvorbereitung zielen darauf ab, einen Ausgangspunkt für die Suche nach optimalen Bedingungen zu schaffen, die eine artefaktfreie Langzeitbeobachtung gesunder, unbestressedr Zellen mit dem höchsten S/N-Verhältnis für jede gegebene Probe ermöglichen. Es gibt keine universelle Möglichkeit, zuverlässige und aussagekräftige Bildgebungsergebnisse zu erzielen. Dem Ansatz ist inhärent, dass die biologische Variation der Probe, subjektivität und Erwartungen des Mikroskops sowie die Bildnachbearbeitung einen erheblichen Einfluss auf die Datenerfassung bzw. -interpretation haben. Daher sind die praktische Erfahrung des Mikroskops, sein intimes Wissen über die Zellbiologie des untersuchten Pilzes sowie die geschickte Probenvorbereitung, um bedingungen so "natürlich" und ungestört wie möglich in einem Laborzustell zu schaffen, von größter Bedeutung für den Erwerb und die Auswertung von bildgebenden Daten, die die untersuchten zellulären Phänomene wahrheitsgemäß widerspiegeln. Als Faustregel gilt, dass das Auftreten unerwünschter Nebenwirkungen von Fluoreszenzfarbstoffen, die von der subtilen und damit nicht offensichtlich sichtbaren Aktivierung von Plasmamembran- oder Zellwand-Remodellierungs-Stressreaktionswegen bis hin zur einfachen zytotoxischen Induktion der Zellautolyse reichen, nur durch die Anwendung niedriger Farbstoffkonzentrationen von 2 bis 2 M sicher verhindert werden kann.
Die Anwendung von Fluoreszenzfarbstoffen ist einfach, aber ihre Besonderheiten sind schlecht charakterisiert. Eine wesentliche Stärke der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen ist die präparative Einfachheit der experimentellen Protokolle. Die Kultivierung und Probenahme des Pilzes, die Zugabe des Farbstoffs und die Montage auf der Mikroskopbühne sind (mit der Praxis) einfach. Die Einstellung der grundlegenden bildgebenden Einstellungen, einschließlich Anregungs- und Emissionswellenlängen, Belichtungszeiten, Zeitverlaufseinstellungen usw., folgt einfachen biophysikalischen Regeln des Mikroskops und biologischen Regeln der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe in den Zellen. Tabelle 1 soll die Identifizierung der am besten geeigneten Farbstoff- oder Farbstoffkombination für Experimente unterstützen. Darüber hinaus sind Fluoreszenzfarbstoffe preisgünstig, mit zuverlässiger hoher Qualität leicht erhältlich und sorgen so für eine hochreproduzierbare Anwendung.
Zwei wesentliche Einschränkungen bei der Verwendung von Membran- oder Zellwandselektive Fluoreszenzfarbstoffe sind die (oft) begrenzte Kenntnis ihrer genauen Färbeeigenschaften, die in den meisten Fällen auf Organelle- und Molekularebene unspezifisch sind, und ihre konzentrationsabhängigen unerwünschten Nebenwirkungen. FM-Farbstoffe sind spezifisch für Lipid-Doppelschichten, die an Endo- und Exozytose teilnehmen. Welche subzellulären Organellen unter den getesteten Bedingungen sukzessive gekennzeichnet werden, ist jedoch nicht sofort ersichtlich und erfordert den Vergleich verschiedener FM-Farbstoffvarianten und eine Co-Kennzeichnung mit zusätzlichen organelle-spezifischen Markern. Die Präferenz von FM 1-43 für mitochondriale Membranen, im Vergleich zu FM 4-64, ist ein Beispiel. Zellwandselektive Farbstoffe zeigen unterschiedliche Spezifität für die drei Hauptpolymere der Pilzzellwand. ES wird angenommen, dass CFW ein unspezifischer Fleck für die Glucane und Chitins ist, SPF gilt als am selektivesten für die -1,4-Glucane, und CR wird als sehr selektiv für die Chitine von . Informationen zur Bindungsspezifität von PFS an Pilzzellwandpolysaccharide liegen derzeit nicht vor. Welches Verhältnis welches Pilzzellwandpolymer bei einer bestimmten Farbstoffkonzentration bei den untersuchten Pilzarten am effektivsten gekennzeichnet ist, lässt sich nicht leicht beantworten, und die Anwendung detaillierter Messungen, die in vitro oder in vivo bei anderen Organismen oder anderen Pilzarten erworben wurden, muss sehr sorgfältig geprüft werden. Leider ist diese Information spärlich und stark verstreut in der Literatur35,42,46. Neuere Aufzeichnungen, die auf früheren Studien33 folgen würden, um neue Einblicke in die genauen Färbeeigenschaften der vorgestellten Farbstoffe speziell in Pilzen zu liefern, sind derzeit nicht verfügbar.
Bildgebende Kontrollen sind wichtig, um Färbemuster und zelluläre Reaktionen genau zu bewerten. Der wohl schwierigste Teil ist jedoch, die Zellbiologie des Pilzes so gut zu kennen, dass die aufgezeichneten Veränderungen in der subzellulären Lokalisation von Membran- und Zellwandselektiven, Veränderungen in der zellulären Architektur oder Hyphalwachstumsmuster ausschließlich und selbstbewusst mit den beabsichtigten Wirkungen der experimentellen Behandlung in Verbindung gebracht werden können. Dazu ist es wichtig, neben jedem neuen Live-Zell-Bildgebungsexperiment auch gute Kontrollen zu haben. Dazu gehören der unbehandelte Wildtyp als negative Bildgebungskontrolle, um Hintergrundautofluoreszenz und Detektorrauschen aus dem erfassten Bild auszuschließen und einen morphologischen Vergleicher zu haben, wenn man mit Mutanten arbeitet. Darüber hinaus ist eine positive Bildgebungskontrolle, z. B. ein Stamm, der GFP oder RFP im Zytoplasma ausdrückt, oder ein anderes bekanntes fluoreszierendes Markerprotein unerlässlich, um die Anregungslichtintensität auf das erforderliche Minimum einzustellen und eine Zellvitalitätskontrolle zu haben. Sobald diese Kontrollen festgelegt sind, beschränkt sich die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen nicht nur auf Visualisierungsaufgaben, sondern ihre konzentrationsabhängige Färbedynamik sowie konzentrationsabhängige Nebenwirkungen können analytisch genutzt werden; zum Beispiel zur quantitativen Überwachung der Zellwandbiosynthese in Echtzeit oder zur Identifizierung mutierter phänospezifischer Phänotypen in Anfälligkeits-Assays47.
Verbesserte zukünftige Anwendungen hängen von einer detaillierten funktionellen Analyse der Färbeeigenschaften ab. Eine große herausforderung besteht darin, quantitative Bildanalysen weiter zu verbessern und zu automatisieren, um die funktionelle Bewertung der subzellulären Dynamik von Membran- und Zellwandselektiven fluoreszierenden Farbstoffen in fadenförmigen Pilzen voranzutreiben. Dazu werden umfangreiche, quantitative Kolokalisierungsstudien dieser Farbstoffe mit bekannten Organelle- und Zellwandpolymermarkern in Kombination mit mutierten Stämmen benötigt, die in bestimmten Transportwegen mangelhaft sind oder an spezifischen Strukturkomponenten fehlen. Mehrere Endozytosemarker für vergleichende Analysen mit FM-Farbstoffen stehen48,49, und in Bezug auf die noch schlecht charakterisierten Bindungsspezifitäten von Zellwandfarbstoffen in Pilzen könnte die Anwendung fluoreszierend markierter Glucan-spezifische Antikörper50 eine Möglichkeit bieten, dieses Problem anzugehen.

Vor zwanzig Jahren wurde die Art und Weise, wie die Hyphalmorphogenese und die zugrunde liegende Molekularzellbiologie in fadenförmigen Pilzen visualisiert werden konnten, durch die Anwendung des membranselektiven fluoreszierenden Fei Mao Farbstoffs FM 4-641revolutioniert. Später wurde der Nutzen des Chitin-bindenden Farbstoffs Calcofluor White als vitaler fluoreszierender Marker der Pilzzellwanddynamik realisiert2. Seitdem sind sowohl Farbstoffe als auch Varianten davon zu einem inhärenten Bestandteil der livezellbildnenden Analysen der Organellendynamik bei Pilzen geworden und liefern nach wie vor beispiellose Einblicke in den fadenförmigen Pilzlebensstil. Dieses Papier beschreibt die Anwendung etablierter und weniger bekannter Fluoreszenzfarbstoffe zur Verfolgung der Plasmamembrandynamik, Endo- und Exozytose und Zellwandmorphogenese in fadenförmigen Pilzen. Endozytose-Tracking-Assays ermöglichen es, verschiedene zellbiologische Fragen im Zusammenhang mit der allgemeinen Studie der Endozytose zu behandeln3. Dazu werden die Lokalisierung, Geschwindigkeit und Abfolge von gebeizten Fächern nach FM-Farbstoffzugabe durch Zeitraffermikroskopie aufgezeichnet und quantitativ zwischen den getesteten Pilzstämmen4verglichen. Zellwandfarbstoffe abgrenzen die äußere Grenze der Zelle und ermöglichen die Verfolgung morphogenetischer Ereignisse, einschließlich polarisiertes Hypahypospitzenwachstum2, Hyphenverzweigung5, Hyphalfusion6,7 und Septumbildung8. Darüber hinaus erleichtern sie die Quantifizierung der lokalisierten Zellwandabscheidung und die Identifizierung von Defekten bei der Zellwandbiogenese9. Da detaillierte Kenntnisse der biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften eines Fluoreszenzmarkers eine Grundvoraussetzung für seine erfolgreiche In-vivo-Anwendung sind, werden diese Eigenschaften zunächst für die sechs farbstoffe In-Vivo-Anwendungen zusammengefasst.
Membranselektive Farbstoffe FM (Fei Mao) Styrylfarbstoffe sind kleine amphiphile Moleküle, die nicht durchgehen können, aber reversibel mit der äußeren Packungsbeilage der Lipid-Doppelschicht biologischer Membranen10assoziieren. Sie sind praktisch nicht fluoreszierend in wässriger Lösung, werden aber bei der Integration der Plasmamembran intensiv fluoreszierend und erzeugen hervorragende Signal-Rausch-Verhältnisse (S/N)-Verhältnisse11. Diese Eigenschaften machen sie ideal geeignet für die Visualisierung von Plasmamembran und intrazelluläre Organelle Dynamik, einschließlich Tracking von Endo- und Exozytose12. Die grünfluoreszierenden FM 1-43 und die rotfluoreszierende FM 4-64 sind die beiden am häufigsten verwendeten fluoreszierenden Membranmarker für diese Zwecke. SynaptoGreen C4 und SynaptoRed C2 sind generische Moleküle von alternativen Anbietern, die austauschbar anstelle von FM 1-43 bzw. FM 4-64 verwendet werden können.
Styrylfarbstoffe umfassen drei wichtige Strukturbereiche: (1) den lipophilen Schwanz, der das Einführen des Farbstoffs in die Lipid-Bilayer erleichtert, (2) den Fluorophorkern, der die spektralen Eigenschaften des Farbstoffs bestimmt und durch zwei aromatische Ringe besteht, die durch ein bis drei Doppelbindungen verbunden sind, und (3) den positiv geladenen hydrophilen Kopf, der eine vollständige Insertion und Permeation des Farbstoffs durch die Membran verhindert (Abbildung 1A).
Je länger der lipophile Schwanz, desto höher ist die Hydrophobie des Farbstoffs und damit die Bindungsaffinität zur Membran, aber je geringer seine Wasserlöslichkeit und Membranentfärbungsrate. Folglich erzeugen verschiedene FM-Farbstoffvarianten unterschiedliche Färbedynamiken und Muster. Die höhere Hydrophobie des C4-tailed FM 1-43 bietet ein stärkeres und stabileres Fluoreszenzsignal an Plasmamembranen und inneren Organellen schneller als der kürzere C2-tailed FM 4-64, wenn er bei Äquimolarenkonzentrationen angewendet wird (Abbildung 2).
Wichtig ist, dass die konstanten und hohen Assoziations-/Dissoziationsraten beider FM-Farbstoffe11 mit durchschnittlichen Retentionszeiten von 1–6 s pro einzelnem Farbstoff13 die Chancen für eine lokalisierte Störung der Membranfunktion verringern, beispielsweise durch die Modifikation der Membranfluidität oder die erzwungene permanente Interaktion von Membranproteinen. Dies ist wahrscheinlich der Hauptgrund, warum diese Moleküle als lebenswichtige Farbstoffe verwendet werden können. Dennoch sind FM-Farbstoffkonzentrationen über 50 m toxisch für Pilz- und Pflanzenzellen2,14, und Hinweise aus BY-2-Tabakprotoplasten deuten darauf hin, dass mehr als 20 M FM-Farbstoff zu einer Plasmamembransättigungführen 14. Daher ist es ratsam, diese Grenze nicht zu überschreiten, zumal eine hervorragende Bildgebung mit nur 2 –5 'M15,16erreicht wurde.
Insbesondere variieren die spektralen Eigenschaften von FM-Farbstoffen stark je nach der jeweiligen Membran-Mikroumgebung (geprüft14). Im Allgemeinen unterscheiden sich Anregungs- und Emissionsspektren von FM-Farbstoffen in reinen Lösungsmittellösungen (wie in der Regel in den Produktinformationen angegeben) erheblich von denen in zellulären Umgebungen und können in den meisten Fällen nicht direkt bei der Auswahl von Live-Zell-Bildgebungseinstellungen konsultiert werden. Die Anregungs-/Emissionsmaxima von FM 1-43 und FM 4-64 werden beispielsweise um 37/46 nm bzw. 43/64 nm blau verschiebt, wenn sie im Vergleich zu ihren Lösungen in Methanol an Pilzmembranen gebunden sind (Tabelle 1).
Die bahnbrechenden Grundlagen für den Einsatz von FM 4-64 und FM 1-43 zur Verfolgung von Plasmamembran, Endo-/Exozytose und Organelle-Dynamik, einschließlich Spitzenkörper und Mitochondrien, sind bereits umfassend für eine Vielzahl von fadenförmigen Pilzarten bisher2,4,17,18,19dokumentiert. Empfohlene Bildgebungseinstellungen für beide FM-Farbstoffe, die in verschiedenen fadenförmigen Pilzarten wirken, sind in Abbildung 1Bdargestellt. Technische Einschränkungen der verfügbaren Ausrüstung oder bestimmte zelluläre und experimentelle Bedingungen, wie Kulturmedium, pH-Wert oder Temperatur, können jedoch einige Anpassungen erfordern. Glücklicherweise arbeiten FM-Farbstoffe über einen weiten Spektralbereich, und sehr gute Bildgebungsergebnisse werden durch spannende FM 1-43 mit 514 nm oder FM 4-64 mit 488 nm erreicht. Daher müssen die optimalen Bildeinstellungen für jeden Probentyp und jede vorgesehene Anwendung individuell festgelegt werden.
Die beachtliche Stokes Verschiebung von mehr als 135 nm FM 4-64 ermöglicht eine ausgezeichnete, gleichzeitige Co-Imaging mit Fluorophoren, die grünes Licht aussenden; Dies wird häufig genutzt, um die intrazelluläre Lokalisationsdynamik von grünen fluoreszierenden Proteinen (GFP)-markierten Fusionsproteinen relativ zur Plasmamembran und dem endozytären Weg9,20zu bewerten.
Zellwandselektive Farbstoffe Calcofluor White M2R (CFW), auch als Fluoreszenzaufheller 28 vermarktet, ist wahrscheinlich der bekannteste Fluoreszenzfarbstoff, der verwendet wird, um die Zellwände von Bakterien, Pilzen, Algen, höheren Pflanzen und Insekten zu färben. Ursprünglich als optisches Aufhellungsmittel in der Papier-, Textil- und Waschmittelindustrie verwendet, wurde der nutzen für die klinische Diagnose von Pilzinfektionen früh am21,22realisiert. Da CFW irreversibel in die entstehende Chitinkette einsteigt, stört es die normale Chitin-Mikrofibril-Montage während der Zellwandbiogenese und erzeugt so Zellwandspannung23. Dies wiederum löst einen Reparaturmechanismus für Zellwände aus, der zu einer lokal erhöhten Zellwandabscheidung als Folge der Glucan- und Chitin-Synthase-Aktivierung24,25führt. Dieses Phänomen kann bei jedem Farbstoff auftreten, der durch stabile Bindung an Zellwandpolymere arbeitet, konzentrationsabhängig ist und am deutlichsten an Hyphaumspitzen auftritt, die die produktivsten wachsenden und damit empfindlichsten Teile des Myzels darstellen (Abbildung 3). Eine umfassende Zusammenfassung der molekularen Maschinerie, die auf Zellwandschäden reagiert, wurde vor kurzem 26 zur Verfügunggestellt.
Überdosierte Farbstoffe in Kombination mit Phototoxizität können zu einer schnellen Zelllyse von Hyphenfächern führen (Film 1). Nichtsdestotrotz kann eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Farbstoffkonzentrationen, die im wilden Typ "vital" sind, genutzt werden, um Defekte in der Zellwandbiosynthese von Genverlust-von-Funktions-Mutanten9zu identifizieren. Für CFW und Congo Red (CR), ein weiterer Textilfarbstoff, auch bekannt als Direct Red 28 und verwendet als - und -chitin-spezifische Zellwandfleck für Pilze und Insekten27,28, Wurden Schwellenkonzentrationen, die stark chitin Synthasen induzieren, mit > 60 M CFW bzw. > 70 M CR, während die Konzentrationen von15 m entweder Farbstoff das Pilzwachstum nicht verändert enden oder hemmten29,30,31. Hickey et al. bezifferten diese Schwellenkonzentration für CFW auf 25 m2. Daher ist es ratsam, Farbstoffkonzentrationen von 5 m zu verwenden, um stressbedingte Artefakte auszuschließen und sicherzustellen, dass diese Moleküle als wirklich "vitale Fluoreszenzfarbstoffe"2,32verwendet werden. Dies gilt gleichermaßen für Solophenyl Flavine 7GFE 500 (SPF) und Pontamin Fast Scarlet 4B (PFS), synonym für Direct Yellow 86 bzw. Direct Red 23, zwei weitere nützliche Zellwandfarbstoffe, deren Anwendung für Pilze erstmals vor mehr als einem Jahrzehnt berichtet wurde33. Aber trotz ihrer bemerkenswerten spektralen Eigenschaften34,35, die Verwendung beider Farbstoffe ist seitdem sehr begrenzt36,37. Wie bereits für 1,5 m CFW2gezeigt, reichen 2 M SPF aus, um die Zellwanddynamik unter nativen Bedingungen mit sehr hoher zeitlicher Auflösung zu lösen (Film 2). Die gleichen Ergebnisse können mit 2 M CR oder PFS erzielt werden.
Zusammen bilden diese vier Farbstoffe CFW, SPF, PFS und CR eine Reihe von zellwandselektiven Fluoreszenzmarkern, die fast das gesamte sichtbare Emissionslichtspektrum (400–700 nm) abdecken, das auf modernen Fluoreszenzmikroskopen verwendet wird (Abbildung 4). Die signifikante Erhöhung der Fluoreszenzintensität bei Bindung an Zellwandpolymere ist allen vier inhärent und erzeugt hervorragende S/N-Verhältnisse. Dies wiederum ermöglicht es, die Farbkonzentrationen und die Anregungslichtintensität sehr gering zu halten und ermöglicht die Durchführung von Zellwandfärbung als "niedrig dosierte" Live-Zell-Bildgebungstechnik2. Da diese Zellwandfarbstoffe plasmamembranundurchlässig sind, fungieren sie gleichzeitig als lebende/tote Flecken. Insbesondere aufgrund ihrer extrem großen Emissionslichtspektren müssen einige Einschränkungen hinsichtlich der Co-Imaging-Eigenschaften von CFW und SPF mit anderen Fluorophoren sorgfältig geprüft werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BRAND cell counting chamber</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR718005</td>
			<td>Thoma format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White M2R</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3543</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td>water immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td>water immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo Red</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6277</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>8,36,73,230</td>
			<td>organic solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 1-43</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6814</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6689</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>Rettberg</td>
			<td>1340691030</td>
			<td>3 mm glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BB02400600A113MNT0</td>
			<td>24 x 60 # 1 glass cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506353</td>
			<td>glycerol immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 Meta</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Minimal Medium</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td>generic fungal growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-slide 8-well</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>ibiTreat #1.5 polymer coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>polyester filtration material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>8,21,472</td>
			<td>92 x 16 mm culture dish w/o cams</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td>transparent gelling agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440762-9904-000</td>
			<td>oil immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pontamine Fast Scarlet 4B</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>212490</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>213400</td>
			<td>fungal growth medium for T. atroviride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Broth (PDB)</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>254920</td>
			<td>fungal growth medium for T. atroviride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706</td>
			<td>1.5 mL SafeSeal tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>5518016</td>
			<td>Cutfix sterile scalpel #23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>6,25,54,502</td>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solophenyl Flavine 7GFE 500</td>
			<td>CIBA</td>
			<td>1485385V6</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynaptoGreen C4</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>70020</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynaptoRed C2</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>70021</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe membrane filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>723-9945</td>
			<td>0.45 &#181;m SFCA syringe filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td>Leica</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vogel&#39;s Minimal Medium (VMM)</td>
			<td>FGSC</td>
			<td>Fungal Genetics Stock Centre</td>
			<td>fungal growth medium for N. crassa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging of filamentous fungi

Die Anwendung von Membran- und Zellwandselektiven Fluoreszenzfarbstoffen für livezellbildende Analysen der Organellendynamik in Pilzzellen begann vor zwei Jahrzehnten und trägt seitdem wesentlich zu unserem Verständnis des fadenförmigen Pilzes bei. Lebensstil. Dieses Papier bietet eine praktische Anleitung für die Verwendung der beiden Membranfarbstoffe FM 1-43 und FM 4-64 und die vier Zellwandflecken Calcofluor White M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 und Congo Red. Der Schwerpunkt liegt auf ihrer niedrig dosierten Anwendung, um artefaktfreie Färbung, ihre Co-Imaging-Eigenschaften und ihre quantitative Bewertung zu ermitteln. Die vorgestellten Methoden gelten für alle fadenförmigen Pilzproben, die auf die beschriebene Weise hergestellt werden können. Die grundlegenden Färbeansätze können als Ausgangspunkte für Anpassungen an Arten dienen, die unterschiedliche Anbaubedingungen erfordern könnten. Erstens werden biophysikalische und biochemische Eigenschaften überprüft, da ihr Verständnis für die Verwendung dieser Farbstoffe als wirklich lebenswichtige fluoreszierende Flecken unerlässlich ist. Zweitens werden Schritt-für-Schritt-Protokolle vorgestellt, die die Vorbereitung verschiedener Pilzprobentypen für die fluoreszierende Livezellbildgebung detailliert beschreiben. Schließlich veranschaulichen Beispielexperimente verschiedene Ansätze: (1) Identifizieren von Defekten in der räumlich-zeitlichen Organisation der Endozytose bei genetischen Mutanten, (2) vergleichen die gemeinsame und ausgeprägte Kolokalisierung von GFP-markierten Zielproteinen im endozytischen Weg (3) morphogenetische Zellwanddefekte in einer genetischen Mutante identifizieren und (4) die Zellwandbiogenese in Echtzeit überwachen.

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Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

Vitale Fluoreszenzfarbstoffe sind wesentliche Werkzeuge für livezellbildende Analysen in der modernen Pilzzellbiologie. Dieses Papier beschreibt die Anwendung etablierter und weniger bekannter Fluoreszenzfarbstoffe zur Verfolgung der Plasmamembrandynamik, Endo-/Exozytose und Zellwandmorphogenese in fadenförmigen Pilzen.

Anwendung von Membran- und Zellwandselektiven Fluoreszenzfarbstoffen für die Live-Zell-Bildgebung von filamentösen Pilzen

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

Membran- und Zellwandselektive Fluoreszenzfarbstoffe sind wichtige Werkzeuge für die Analyse der Organelle-Dynamik und lebender Pilzzellen. Unsere Protokolle bieten wesentliche theoretische Hintergründe und praktische Richtlinien für die Anwendung einer Auswahl dieser Farbstoffe als wirklich lebenswichtige Flecken. Der Schlüsselpunkt dafür ist, sehr niedrige Farbstoffkonzentrationen zu verwenden, die keine zellulären Artefakte im Zusammenhang mit Sättigung oder Farbstofftoxizität verursachen, während gleichzeitig gute Signal-Rausch-Verhältnisse für hochwertige, langfristige Live-Zell-Bildgebung zur Verfügung gestellt werden.Mit Kollegen vom Institut für Nuklearmedizin der Medizinischen Universität haben wir vor kurzem diese Färbetechniken eingesetzt, um einen neuartigen Ansatz für die bildgesteuerte Diagnose von Aapergillose zu entwickeln. Die Fähigkeit, Membran- und Zellwandstrukturen in Echtzeit zu überwachen, war entscheidend für die Bestimmung der Aufnahmedynamik der experimentellen Wirkstoffverbindung. Um dieses Verfahren zu beginnen, erhalten Sie zunächst eine vorbereitete Präkultur.Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um einen kleinen Agarblock zu schneiden, der nicht-sporulating Myzel vom Kolonierand der Präkultur trägt. Platzieren Sie den Agarblock in der Mitte einer frischen, festen mittelgroßen Platte, um die experimentelle Kultur zu impfen. Inkubieren Sie die experimentelle Kultur entsprechend dem Entwicklungsstadium, das inkubiert werden soll.Die Probenvorbereitung ist etwas heikel und die Optimierung der Bildaufnahmeeinstellungen recht komplex. Die visuelle Demonstration beider Verfahren, begleitet von einer verbalen Erklärung, erleichtert die Reproduzierlichkeit erheblich. Um die Proben zu montieren, halten Sie einen sauberen 24 mal 60 Millimeter Glasdeckel schlupf bereit und fügen Sie 18 Mikroliter flüssige minimale mittlere oder physiologische Salzlösung in die Mitte.Fügen Sie der Flüssigkeit in der Mitte des Deckels zwei Mikroliter der vorbereiteten 20 Mikromolar-Farbstoff-Arbeitslösung hinzu und mischen Sie sie gut, indem Sie mehrmals nach oben und unten pfeifen und gleichzeitig die Produktion von Luftblasen vermeiden. Mit einem sauberen Skalpell eine 15 mal 15 Millimeter große Probe aus der Peripherie der Kolonie herausschneiden und vertikal neben den mittleren Tropfen auf dem Deckelschlupf platzieren. Verwenden Sie das Skalpell, um die obere Kante des Blocks zu unterstützen und einen Finger, um die Rückseite des Blocks an Ort und Stelle zu halten.Dann senken Sie langsam die Seite, die das Myzel auf die Flüssigkeit trägt. Montieren Sie die vorbereitete Probe auf die Mikroskopstufe. Passen Sie zunächst die grundlegenden Einstellungen für die Bildaufnahme an, um die stehende Dynamik in einzelnen Hyhasen zu erfassen, wie im Textprotokoll beschrieben.Für die Endozytose-Aufnahme-Assays konsultieren Sie Abbildung 1 und Tabelle eins des Textprotokolls, um die besten Anregungs- und Emissionseinstellungen für FM 143 oder FM 464 zu identifizieren, die auf dem Mikroskopiesystem verfügbar sind, und passen Sie diese Einstellungen im System entsprechend an. Starten Sie die Bildaufzeichnung mit den zuvor angepassten Einstellungen und werten Sie die Ergebnisse aus. Optimieren Sie dann die Bildaufnahmeeinstellungen auf die räumliche und zeitliche Auflösung, die erforderlich ist, um den Aspekt der Plasmamembran oder Endozytosedynamik zu erfassen, auf die sich das Experiment konzentriert.Für die Zellwanddynamik konsultieren Sie Abbildung vier und Tabelle eins des Textprotokolls, um die besten Anregungs- und Emissionseinstellungen für den angewendeten Zellwandfarbstoff zu identifizieren und die Einstellungen auf dem Mikroskopiesystem entsprechend anzupassen. Starten Sie die Bildaufzeichnung mit den zuvor angepassten Einstellungen und werten Sie die Ergebnisse aus. Optimieren Sie dann die Einstellungen für die Bildaufnahme auf die räumliche und zeitliche Auflösung, die erforderlich ist, um den Aspekt der Zellwandmorphogenese zu erfassen, auf den sich das Experiment konzentriert.Neben der Visualisierung zellulärer Prozesse ermöglicht die Live-Zell-Bildgebung die Extraktion quantitativer Informationen aus den aufgezeichneten Daten. In einem Beispiel der FM 464 Aufnahmetests werden Pilzproben als Kolonien kultiviert und nach der invertierten Agarblock-Methode montiert. Die Assays identifizierten Defekte in der räumlich-zeitlichen Organisation der Endozytose bei der Genlöschung und Genüberexpression von Mutanten des pilzspezifischen Proteins SFP 2 von Trichoderma-Atrovidrid.Beispiele für fm 464 Co-Färbung von fluoreszierenden Fusionsproteinen, die auf endozytische Kompartimente ausgerichtet sind, werden hier gezeigt. Diese Co-Färbung wird verwendet, um die subzelluläre Verteilung der beiden verbesserten grünen fluoreszierenden Proteine mit Transmembranproteinen, SFP 2 und GPR 1, mit dem endozytischen Weg bei Trichoderma-Atrovidid in Verbindung zu bringen. Ein Beispiel für FM 464 Co-Färbung zur Identifizierung morphogenetischer Unterschiede zeigt, dass diese Co-Färbung eine weitere Beziehung der subzellulären Lokalisationsdynamik von mehleszierend als BUD-6 Polarismus-Komplexprotein bezeichnet, um einige handelsabhängige Prozesse wie die Bildung von Septen und polarisiertem Hyphaumspitzenwachstum zu beenden.Es charakterisiert auch Unterschiede in der subzellulären Organisation und Hyphenarchitektur zwischen wildem Typ und mutierten Stämmen von Neurospora crassa. Repräsentative Zellwandfärbung zeigt, dass die unterschiedlichen Wechselwirkungseigenschaften von Calcofluorweiß, Solophenylflavine und Kongorot mit Zellwandpolymeren morphogenetische Unterschiede zwischen dem Delta-SFP 2-Mutanten und dem wilden Typstamm von Trichodermie-Atrovirid hervorheben. Die Erhöhung der Zellwandspannung, die durch erhöhte Farbstoffkonzentrationen verursacht wird, tritt schneller auf und ist in der Mutante im Vergleich zum Wildtyp ausgeprägter.Darüber hinaus ermöglichen die gleichen Bilder die Quantifizierung morphogenetischer Unterschiede in Bezug auf Denkstrichdurchmesser und Septumabstand zwischen beiden Stämmen. Repräsentative Echtzeitüberwachung der Zellwandbiosynthese zeigt, dass die sehr niedrige Calcofluor-Weißkonzentration eine Sättigung der Zellwand mit Farbstoffmolekülen verhindert und eine quantitative Echtzeitüberwachung der Zellwandbiosynthese ermöglicht. Dies zeigt, dass die Ablagerung von neuem Zellwandmaterial nicht einheitlich ist, sondern sehr schnell auf lokalisierte physikalische Belastungen reagiert, die sich aus der relativen Verschiebung einer Zelle auf Zell-zu-Zell-Anhaftung vor der Dermalinfusion in Neurospora crassa ergeben.Weniger ist mehr. Verwenden Sie so wenig Farbstoff wie möglich, um Eine Störung des Fluoreszenzmarkers mit zellulären Prozessen zu verhindern. Nach diesem Verfahren konnte die Mehleszenzerholung nach Photobleichexperimenten durchgeführt werden, um die Transport- und Biogenesekinetik zu quantifizieren.Die bahnbrechende Einführung von Membran- und Zellwandfärbung in fadenförmigen Pilzen zu Beginn des Jahrtausends hat die Art und Weise, wie wir Pilze betrachten, buchstäblich revolutioniert. Calcofluorweiß kann Augenreizungen verursachen und ist ein klassifizierter Krebs. Kongo rot ist krebserregend und teratogen, also tragen Sie bitte Augen- und Hautschutz beim Umgang mit diesen Farbstoffen.

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Forschung

Biologie

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Selektive Markierung von Zelloberflächen-Proteinen unter Verwendung von CyDye DIGE Fluor Minimal Farbstoffe

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Live Cell Imaging von F-Aktin Dynamics über Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Fluoreszenzmarkierung von COS-7 mit dem Ausdruck SNAP-tag-Fusionsproteinen für das Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G-Protein-selektive GPCR Konformationen gemessen mit FRET-Sensoren in einer Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

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Die Untersuchung der Proteinqualitätskontrolle System der<em&gt; D. discoideum</em&gt; Verwendung von Temperaturgesteuerte Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Live-Zelle Bildgebung von Platelet Degranulation und Sekretion unter Flow

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Hochauflösende Live-Cell-Bildgebung subzellulärer Strukturen

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...