Name: application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging of filamentous fungi
Uploaded: 2019-11-28T15:00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi at JoVE.com

תודה בשל הקרן טירולית (TWF) למתן מענק #256524 אל, אל המדע והטכנולוגיה של וינה הקרן (WWTF) עבור מתן מענק #LS13-086 ש', ו לקרן פרסום של אוניברסיטת אינסברוק על תמיכה בפרסום גישה פתוחה. המחברים גם מודים למחלקה לזואולוגיה של אוניברסיטת אינסברוק לאספקת TCS לייקה SP5 II מיקרוסקופ סריקת לייזר מיקוד.

1. הכנת דגימות פטרייתי
<ol><li>מקדם תרבויות פטרייתי<ol>
<li>איחסן את המתח הרצוי על בינונית מוצק אגר מתאים, כגון תפוחי אדמה דקסטרוז אגר (PDA) עבור Trichoderma האטרויום או בינוני מינימלי של ווגל (vmm) עבור neurospora crassa. הוסף סמן בחירה מתאים בעת עבודה עם זנים טרנספורקנטים.</li>
		<li>מודמת את התרבות הקדם בטמפרטורה אופטימלית של האורגניזם. למשל, T. מתנוון ב -25 ° c ו -N. crassa ב -30 ° c, ו 12 h/12 h מחזורי אור/כהות עד התפתחה מיקליום המטיר אך עדיין לא הגיעה לקצה הלוחית. על גודל סטנדרטי צלחת פטרי (9.2 ס מ Ø), זה לוקח פראי-סוג T. מתנוון על 4-6 ימים בממוצע, בעוד N. crassa סוג פראי מגיע לשלב זה אחרי 3 – 4 ימים בממוצע.</li>
	</ol></li>
	<li>טיפוח מושבות פטרייתיים<ol>
<li>באמצעות אזמל סטרילי, לגזור קטן 3 מ"מ x 3 מ"מ בלוק אגר הנושאת אי-הספורייצ'יום מקצה המושבה של טרום התרבות.</li>
		<li>מניחים את בלוק אגר במרכז של צלחת בינונית מוצק טרי כדי לחסן את התרבות הניסיונית.</li>
		<li>מודאת התרבות הניסיונית על פי השלב ההתפתחותי שנועד להיחקר. למשל, הסוג הפראי T. המתנוון דורש 20 – 22 שעות ב -25 ° c בחשכה לפתח מושבות של כ 2 ס"מ בקוטר על מחשב כף יד, ואילו מסוג פראי N. crassa מגיע קטרים המושבה של כ 4 ס"מ אחרי 14-16 h הדגירה ב 30 ° c בחושך על vmm. הערה: הדגירה בחשכה מונעת היווצרות של פיגמנטים שעשויים להחדיר לקרינה פלואורסצנטית אוטומטי. על מנת לסלק את הזריחה הבינונית ברקע מן התרבות הניסיונית, להחליף את אגר עם 1.5% w/v של סוכן מיצוק שקוף (לראות את הטבלה של חומרים), וכל מדיום מורכב עם מדיום מוגדר מינימלי.</li>
	</ol></li>
	<li>טיפוח תרבויות מוצקות<ol>
<li>השתמש 5 מ ל של פתרון מלחים פיזיולוגיים סטרילי (0.9% w/v) כדי לקצור נבגים con, הקציר מן הצלחת טרום תרבות ולאסוף את הבולם נבג שנוצר בצינור 15 מ ל בורג.</li>
		<li>מערבבים את ההשעיה נבג היטב על ידי vortexing נמרץ ולאחר מכן לסנן אותו על 1 ס מ x 5 ס מ הרצועה של בד סינון סטרילי (לראות את הטבלה של חומרים) ממולאים בקלות לתוך הטיפ 1 מ ל צינור (שניהם התאספו מראש) לתוך צינורית סטרילי טרי.</li>
		<li>לקבוע את צפיפות הנבג עם תא ספירת תאים ולהכין 1 x 107 תאים/mL השעיה נבג עם פתרון המלח הפיזיולוגי. הערה: ניתן לשמור על השעיית הנבג ב-4 ° צ' עד שבועיים.</li>
		<li>הכן צלחת פטרי בגודל סטנדרטי (9.2 ס מ Ø) עם 20 מ ל של בינוני אחיד ולהוסיף 15 – 20 חרוזי זכוכית סטרילית (3 מ"מ Ø) על גבי.</li>
		<li>פיפטה 200 μL של ההשעיה נבג על הלוח הבינוני באופן שווה להפיץ את התאים על פני הצלחת כולה על ידי טלטול עדין. לאסוף את חרוזי זכוכית לתוך גביע עם 70% אתנול לשימוש חוזר.</li>
		<li>מודאת התרבות הניסיונית על פי השלב ההתפתחותי שנועד להיחקר. לדוגמה, הסוג הפראי של ה -T מחייב 5 – 6 h ב -25 ° c בחשכה כדי לפתח מגרדים שחורים במחשב כף-יד, ואילו הסוג הפראי של N. crassa מפתח מגרדים לאחר 3 – 4 מהדגירה ב -30 ° c בחשכה ב-vmm. הערה: כדי לסלק את הקרינה הפלואורסצנטית בינונית מהתרבות הניסיונית, החלף את אגר עם 1.5% w/v של סוכן מיצוק שקוף, וכל מדיום מורכב עם מדיום מינימלי מוגדר.</li>
	</ol></li>
	<li>טיפוח של תרביות גרלינג נוזלי<ol>
<li>מילוי 190 μL של בינוני תרבותי נוזלי לתוך כל טוב של 8-היטב שקופית מיקרו-שקופיות.</li>
		<li>הוסף 10 μL של 1 x 107 תאים/לפתרון נבג mL (מוכן בשלבים 1.4.1 – 1.4.3) ולערבב על ידי ליטוף בעדינות למעלה ולמטה כמה פעמים. מספר התאים הכולל שהתקבל הוא 1 x 105 לכל היותר.</li>
		<li>מודאת התרבות הניסיונית על פי השלב ההתפתחותי שנועד להיחקר. למשל, הסוג הפראי T. האטרויום דורש 5 – 6 h ב -25 ° c בחושך כדי לפתח מגרדים הקונדידים בדקסטרוז מרק תפוחי אדמה (PDB), ואילו סוג פראי N. crassa מפתחת הקונדינגס לאחר 3 – 4 h של דגירה ב 30 ° c בחושך ב vmm נוזלי.</li>
	</ol></li>
</ol>2. הכנת פתרונות לעיבוד צבע
<ol><li>כדי להבטיח מסיסות מלאה של כל צבע, להכין 2 מ"מ פתרונות מדמין diמתיל סולפוקסיד (DMSO) על ידי הוספת הסכום המתאים (ראה משקולות המדויק בטבלה 1) ל 1 מ ל של 100% dmso ומערבבים היטב על ידי vortexing. התראה: הקפד לקחת את DMSO מן בקבוק אטום מחיצת ממחיצה; זה צריך להיות נוזל שקוף ברור. עם מגע עם האוויר, DMSO הופך חום-כנראה בשל החמצון של מעקב זיהומים-ועלול להשפיע לרעה על צמיחת תאים או צביעת צבע.</li>
	<li>מסנן לעקר את הפתרון מניות באמצעות מסנן 0.2 יקרומטר מזרק ממברנה לתוך צינור חדש סטרילי 1.5 mL התגובה. כדי למזער את צבע הלבנת, לעטוף את הצינור רדיד אלומיניום. הערה: פתרון מלאי הצבע ניתן לצוטט לנפחים קטנים יותר כדי למנוע החלקה/הקפאה של מחזורי, ושמרו על 4 ° c במשך מספר חודשים.</li>
	<li>להכין 20 μM מימית צבע הפתרון לעבוד על ידי המסת 2 μL של פתרון מלאי צבע ב 198 μL של מים מזוקקים סטרילי בצינור חדש סטרילי 1.5 mL התגובה. כדי למזער את צבע הלבנת, לעטוף את הצינור רדיד אלומיניום. הערה: יש להכין את פתרון עבודת הצבע הטרייה ביום הניסוי.</li>
	<li>במהלך הרכבה לדוגמה (ראה סעיף 3), פתרון העבודה לצבוע יהיה מדולל בלהיטות 1:10, וכתוצאה מכך ריכוז הצבע הסופי של 2 μM ו 0.1% w/v הסופי ריכוז DMSO. הערה: בחירת גורמי דילול שונים על-ידי שינוי היחס בין פתרון העבודה לצבען לבין הנוזל הגובר, מאפשר להתאים בקלות את ריכוז הצבע הסופי הרצוי. התראה: כדי למנוע השפעות לא רצויות עקב הרעילות או הרעלת DMSO, מקדם הדילול לא צריך ליפול תחת 1:4 כדי לגרום לריכוזים הסופיים המרבי של 5 לצבוע μM ו 0.4% w/v DMSO. ריכוזי לצבוע גבוה במהירות לרוויה המערכת ולמנוע כימות האות אמין, בעוד יותר מ 0.5% w/v (≥ 62.5 mM) DMSO יכול לפגוע בפיתוח תאים38.</li>
</ol>3. הכנה לדוגמא למיקרוסקופיה
<ol><li>דגימות הר ממושבות פטרייתי (שלב 1.2) או בתרבויות germling מוצק (שלב 1.3) על ידי שיטת הבלוק הפוכה אגר.<ol>
<li>שמור על נקי 24 מ"מ x 60 מ"מ מכסה זכוכית (#1 = 0.13 – 0.16 mm עובי) מוכן ולהוסיף 18 μL של בינונית נוזלית מינימלית (VMM או M9) או תמיסת מלח פיזיולוגית על המרכז.</li>
		<li>הוסף 2 μL של הפתרון 20 μM צבע העבודה ל 18 μL של נוזל ומערבבים היטב על ידי ליטוף למעלה ולמטה מספר פעמים, תוך הימנעות הייצור של בועות אוויר. הערה: כאשר עובדים עם מספר דוגמאות, רצוי להכין שילוב מאסטר של פתרון הצבע הנוזלי עבור כולם על מנת להבטיח ריכוז שווה של צבע במהלך הניסוי.</li>
		<li>עם אזמל נקי, לגזור מדגם 15 מ"מ x 15 מ"מ מן הפריפריה של המושבה או התרבות germling מוצק ומניחים אותו באופן אנכי לצד ירידה בינונית על מכסה המכסה.</li>
		<li>באמצעות האזמל לתמוך בקצה העליון של הבלוק ואצבע כדי להחזיק את הצד האחורי של הבלוק במקום, לאט להנמיך את הצד נושאת תפטיר או הגרמנגס על הנוזל. הדגימה כעת מוכנה להעברה. אל במת המיקרוסקופ התראה: חיוני לעשות זאת לאט ובזהירות רבה כדי למזער את הלחץ המכני על התאים וכדי למנוע בועות אוויר לכוד בין דגימה לכיסוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לעלות את התרביות germling נוזלי משלב 1.4. הערה: באופן הנוח ביותר, תרבויות germling נוזלי ב-מיקרו-טוב שקופיות שניתן להעביר ישירות ועוד מניפולציות על הבמה במיקרוסקופ.<ol>
<li>הוסף 22 μL של פתרון עבודה בצבע כדי 200 μL של בינוני נוזלי כדי לגרום לריכוזים סופיים סטנדרטיים של 2 לצבוע μM ו 0.1% w/v DMSO. הערה: לתרביות הנוזל הנוזלי יש את היתרון הגדול שצבעי פלורסנט (או כימיקלים אחרים, כגון מעכבי) ניתן להוסיף בכל נקודת זמן רצויה של הניסוי, גם במהלך ההקלטה. במקרה זה, טיפול מיוחד צריך להילקח כדי לנהל את טיפות נוזלי לאט מאוד כדי לא להפריע את התאים. מערכת תנודות ותנועה בראונית עשויים כבר להציג כמה תנועות תא.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. מיקרוסקופ תאים חי
<ol><li>כוונן את הגדרות רכישת התמונות הבסיסיות. הגדרות רכישת התמונה הבאות מאפשרות ללכוד דינמיקת הצביעת בלקורבן בודדים וחלים על שני הצדדים הבאים:<ol>
<li>החל 5 – 10% כוח לייזר של 20% מעוצמת הפלט המלאה של המכשיר.</li>
		<li>השתמש בתוכנית של Apo 60x – 63 x גליצרול או מטרה טבילה מים עם צמצם מספרי גבוה ≥ 1.2.</li>
		<li>הגבל את אזור רכישת התמונה למתאר של הלקורבן על-ידי הגדרת גודל תמונה של 1024 x 256 פיקסלים ובאמצעות פקטור זום אופטי של 2 – 3.</li>
		<li>השתמש בסריקה דו-כיוונית עם 400 Hz. כוונן את גודל הנקב ליחידה אוורירית אחת.</li>
		<li>הגדר את הרווח של הגלאי הרגיש ביותר עד 100%.</li>
		<li>עבור הקפות זמן הקלטה, להתחיל רכישת תמונה עם מסגרת אחת כל 15 s כדי לאפשר רזולוציית הזמן סבירים מבלי לייצר הלבנת צבע או לחץ צילום.</li>
		<li>עבור הקלטה תלת-ממדית, הגדר את הגבול המרחבי העליון והתחתון לגבול של הרכיבים האופטיים והרווחים באזור 1 יקרומטר מלבד כדי לאפשר רזולוציה מרחבית סבירה. הערה: בשל הצמיחה המהירה של הhyphae רזולוציה גבוהה מרחבית בציר Z הוקרב לעתים קרובות לרזולוציה גבוהה בציר X/Y או להיפך. רק מיקרוסקופים מאוד מודרנית סריקת לייזר סריקה מספיק מהר כדי לספק את שתי הדרישות.</li>
	</ol></li>
	<li>ספיגת האנדוציטוזה אומרת<ol>
<li>עיין באיור 1 ובטבלה 1 כדי לזהות את הגדרות העירור/הפליטה הטובות ביותר עבור fm 1-43 ו/או FM 4-64 הזמינות במערכת המיקרוסקופיה והתאם בהתאם. הערה: עם ריכוז 2 μM המומלץ, התאגדות של צבע FM לתוך קרום הפלזמה הוא מיידית בתאים בריאים נורמליים. התהליך כולו מתוך הקרום פלזמה הראשונית כתמים כדי לצבוע את המראה בתוך ובחללים צינורי הוא הושלם בדרך כלל בטווח של 30 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר. הגדלת הריכוז לצבוע FM מגדיל את S/N-יחס ובכך מייצרת תמונות חדות גבוהה יותר מהר. עם זאת, זה גם מאיץ את תהליך תיוג להקשות יותר להבדיל את הרצף הכרונולוגי של כתמים ארגונית.</li>
		<li>התחל הקלטת תמונה באמצעות ההגדרות המומלצות לרכישת תמונות בסיסיות והערך את התוצאות.</li>
		<li>מטב את הגדרות רכישת התמונה לרזולוציה המרחבית והטמפורלית הנדרשת כדי ללכוד את ההיבט של ממברנה פלזמה או דינמיקה אנדוציטוזה הניסוי מתמקד.</li>
		<li>למשל, כדי ללכוד הדינמיקה מהירה מאוד ב-X/Y, להקטין את גודל התמונה הכוללת, התמונה רק מטוס מוקד אחד ולהגדיל את קצב הסריקה ל 1 fps. לקבלת רזולוציה גבוהה יותר בציר Z, הפחת את הרזולוציה ב-X/Y, הקטן את גודל התמונה והקטן את המרחק בין המקטעים האופטיים ל-0.5 μm.</li>
	</ol></li>
	<li>דינמיקה של קיר התא<ol>
<li>עיין באיור 4 ובטבלה 1 כדי לזהות את הגדרות העירור/פליטה הטובות ביותר עבור צבע התא המוחל הזמין במערכת המיקרוסקופיה והתאם בהתאם. הערה: בשל ספקטרום הפליטה הרחב שלהם, CFW ו-SPF אינם מתאימים היטב שיתוף הדמיה בו עם fluorophores אחרים, בעיקר GFP. הגבלות מסוימות מוחלות אף הן על גישות של הדמיה רציפה עם צבעים אלה, ולכן יש למטב אותן בנפרד.</li>
		<li>התחל הקלטת תמונה באמצעות ההגדרות המומלצות לרכישת תמונות בסיסיות והערך את התוצאות. הערה: עם הריכוז המומלץ של 2 μM, שילוב הצבע לקיר התא אינו בהכרח מיידי אך מהיר באופן סביר. התהליך כולו של היווצרות המחיצה, למשל, לוקח בממוצע כ-5 – 7 דקות בטמפרטורת החדר20. הגדלת ריכוז צבע קיר התא מגדיל את S/N-יחס ובכך מייצרת תמונות חדות גבוהה יותר מהר. עם זאת, הוא גם מציג במהירות פריטים עקב תיקון המושרה קיר תא נזק.</li>
		<li>מטב את הגדרות רכישת התמונה לרזולוציה המרחבית והטמפורלית הנדרשת כדי ללכוד את ההיבט של קיר התא מורפולגנזה הניסוי מתמקד, כפי שמתואר בסעיף 4.2.3.</li>
	</ol></li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים ושום דבר לחשוף.

מאמר זה ממשיך את העבודה שבירת הקרקע אשר הקימה את השימוש בצבעי פלורסנט שונים כמו סמנים מאורגל החיוניות עבור פטריות filamentous בתחילתשנות ה-2000,4,43, וניסיונות לדון המאפיינים הביולוגיים של התאים והתא של צבע FM וצבע תא נבחר הקיר בפירוט רב יותר מבעבר. במיוחד ביחס להשפעות סלולריות לא רצויות, כגון רוויית ממברנה או נזק לקיר התא, המתרחשות מעל ריכוזי צבע מסוימים. מה שהיה בעבר נחשב שאינו רעיל ברמה התאית נחשב כעת רעיל ברמה המולקולרית. למרות ההשפעות הללו עשוי להיות מאוד עדין ולא ברור ישירות על ידי שינויים ברורים ארגונית או התנהגות התא, כל הפרעה אפשרית של יישום צבע אחר מאשר הדמיה צריך להיות ממוזער לחקירה של תפקוד מולקולרי יליד. למרבה המזל, רגישות משופרת ויעילות קוונטית של גלאים מודרניים, כגון מפולת סיליקון גלאי פוטודיודה (Si-APDs)44 או הגלאי אזור Airyscan45, להקל על השימוש של כמויות צבע נמוכות אפילו יותר מבעבר. מטרת מפתח נוספת של המאמר היא להדגים את המאפיינים שיתוף הדמיה של צבעים אלה עם fluorophores אחרים, החשוב ביותר, אלה של GFP כמו חלבון פלורסנט בשימוש תכוף ביותר בביולוגיה. זה צריך לסייע בעיצוב של ניסויים הדמיה כי המטרה להתאים את הדינמיקה לוקליזציה subcellular של חלבונים פיוז'ן פלורסנט לאלה של קיר התא פטרייתי, את קרום הפלזמה או את מסלול אנדו ואקסוציטוזה וכו '.
הדמיה בתנאים טבעיים וללא מתח היא המפתח לרכישת נתונים אמינים. כמה שיקולים מעשיים לגבי תרבות בינונית והכנה לדוגמה למטרה לספק נקודת התחלה למציאת התנאים האופטימליים המאפשרים הוצאת חפץ, זמן רב התבוננות של תאים בריאים, בלתי לחוצים עם S/היחס הגבוה ביותר האפשרי עבור כל מדגם נתון. אין דרך אוניברסלית להשגת תוצאות דימות אמינות ומשמעותיות. היא טבועה בגישה שווריאציה הביולוגית של המדגם, הסובייקטיביות והציפיות של המיקרוסקוסט, כמו גם עיבוד לאחר תמונה יש השפעה משמעותית על רכישת נתונים ופרשנות, בהתאמה. מכאן, החוויה המעשית של הmicroscopist, הידע האינטימי שלה על ביולוגיה התא של הפטריה תחת חקירה, כמו גם הכנה לדוגמה מיומנת כדי ליצור תנאים כמו ' טבעי ' ו מופרעת ככל האפשר בהגדרת מעבדה, הם העליונה לרכישת והערכת נתוני דימות כי בכנות משקף את התופעות הסלולר למדה. ככלל אצבע, התרחשות תופעות לוואי לא רצויות של צבעי פלורסנט, החל מעודן ולכן לא ברור לעין הפעלה של קרום פלזמה או קיר תא מחדש דוגמנות מתח מסלולים תגובה האינדוקציה ציטוטוקסיים ישירה של התאים אוטוליזיס, ניתן למנוע באופן מאובטח רק על ידי החלת ריכוזי צבע נמוך ≤ 2 μM.
היישום של צבעי פלורסנט הוא פשוט, ובכל זאת המינים שלהם הם מאופיינים בצורה גרועה. חוזק מפתח של שימוש בצבעי פלורסנט הוא הפשטות הדרך של הפרוטוקולים הניסיוניים. טיפוח ודגימה של הפטריה, הוספת הצבען (ים), והרכבה על המיקרוסקופ הם (עם תרגול) ישיר. התאמה של הגדרות הדמיה בסיסיות, כולל העירור ואת אורכי הגל, החשיפה פעמים, הגדרות קורס זמן וכו ', בעקבות כללי ביופיזיים פשוטים של המיקרוסקופ והכללים הביולוגיים של צבעי הפלורסנט המשמשים בתוך התאים. טבלה 1 מתכוונת לתמוך בזיהוי של שילוב הצבע או הצבע המתאימים ביותר לניסויים. יתר על כן, צבעי פלורסנט הם תחרותיים באופן סביר, זמין עם איכות גבוהה אמין ובכך להבטיח יישום מאוד מתוכנת.
שתי הגבלות גדולות של שימוש בקרום או קיר התא צבעי פלורסנט סלקטיבית הם (לעתים קרובות) ידע מוגבל של תכונות מדויקות שלהם, אשר ברוב המקרים הם לא ספציפיים על ארגונית מולקולרית הרמה, ואת הריכוז שלהם תלוי התופעות לוואי לא רצויות. צבעי FM הם ספציפיים עבור bilayers השומנים השתתפות אנדו-ו אקסוציציטוזה. עם זאת, בדיוק אילו מרכיבי הסלולר הופכים להיות מתויג ברציפות תחת התנאים נבדק אינו ברור באופן מיידי והוא דורש השוואה של משתני צבען FM שונים, ושיתוף תיוג עם סמנים נוספים מסוימים ספציפיים. ההעדפה של FM 1-43 עבור ממברנות מיטוכונדריאלי, בהשוואה ל-FM 4-64, היא אחת הדוגמאות. קיר תא צבע סלקטיבי להציג ספציפיות שונות עבור שלושת הפולימרים העיקריים של קיר התא פטרייתי. CFW הוא נחשב כתם לא ספציפי עבור β-glucans ו כיאין, SPF הוא חשב להיות סלקטיבי ביותר עבור β-1, 4-הגלוקנים, ו CR הוא חשב להיות סלקטיבי מאוד עבור α-ו β-chitin. מידע על הקשירה הספציפיות של PFS ל-pvc של דופן התא אינו זמין כרגע. לאיזה יחס שאותו פולימר קיר התאים הפטרייתיים מסומן באופן יעיל ביותר בריכוז צבע מסוים במינים הפטרייתיים בחקירה, לא ניתן להשיב בקלות, והיישום של מדידות מפורטות שנרכשו בתוך מבחנה או בvivo באורגניזמים אחרים או במינים פטרייתיים אחרים, חייבים להיחשב בזהירות רבה. למרבה הצער, מידע זה הוא דליל ומפוזר מאוד בספרות35,42,46. רשומות עדכניות יותר שיעקבו אחרי מחקרים קודמים33 כדי לספק תובנות חדשות למאפייני הצבע המדויקים של הצבעים המוצגים במיוחד בפטריות כרגע אינם זמינים.
שולטת הדמיה חיוניים כדי להעריך דפוסי הצביעת ותגובות הסלולר במדויק. כנראה החלק המאתגר ביותר, עם זאת, הוא לדעת את הביולוגיה התא של הפטריה כל כך טוב כי שינויים מוקלטים לוקליזציה subcellular של קרום וקיר תא צבעי פלורסנט סלקטיבית, שינויים באדריכלות הסלולר או בדפוס הצמיחה hyphal יכול באופן בלעדי ובביטחון להיות קשור להשפעות המיועדות של הטיפול הניסיוני. בשביל זה, זה חיוני לקבל שליטה טובה לצד כל ניסוי חדש של הדמיה תא חי. אלה כוללים את סוג פראי מטופל כמו שליטה הדמיה שלילית כדי להוציא את הרקע האוטומטי ורעש הגלאי של התמונה רכשה, ולהיות בעל המשווה מורפולוגית כאשר עובדים עם מוטציות. יתר על כן, שליטה חיובית הדמיה, למשל זן המבטא GFP או RFP בציטופלסמה או אחר מוכר היטב של חלבון סמן פלורסנט, חיוני להגדיר את עוצמת האור עירור למינימום הנדרש ויש להם שליטה חיוניות התא. לאחר שפקדים אלה מוגדרים, השימוש בצבעי פלורסנט אינו מוגבל למשימות ויזואליזציה בלבד, אך הדינמיקה שלהם תלויה בריכוז, כמו גם תופעות לוואי תלויות-ריכוז, יכולות להיות מנוצלות באופן אנליסטי; למשל, עבור הניטור ככמת ביולוגי הקיר תא בזמן אמת או לזיהוי של פנוטיפים ספציפיים מוטציה הרגישות בחני47.
יישומים משופרים בעתיד תלוי בניתוח פונקציונלי מפורט של מאפייני צבען צביעת. אתגר מתמשך הגדול הוא לשפר עוד ולהפוך ניתוח התמונה כמותית על מנת לקדם הערכה תפקודית של הדינמיקה subcellular של קרום התא ממברנה בררניים צבעי פלורסנט בפטריות filamentous. בשביל זה, נרחב, כמותי לוקליזציה מחקרים של צבעים אלה עם ארגונית ידוע ו-cell סמנים פולימר הקיר בשילוב עם זנים מוטציה לקויה מסלולים הובלה מסוימים או חוסר רכיבים מבניים ספציפיים נדרשים לראשונה. מספר סמנים endocyציטוזה לניתוח השוואתי עם צבעי FM זמינים48,49, וביחס עדין מאופיין specificities של צבע קירות הקיר בפטריות, היישום של50 נוגדנים בעלי תווית מוגדרת על-ידי fluorto-ספציפי לשימוש התוויות יכול לספק אפשרות אחת כדי לטפל בבעיה זו.

לפני עשרים שנה, את האופן שבו hyphal מורפולגנזה ואת הביולוגיה התא המולקולרי הבסיסי יכול להיות דמיינו בפטריות filamentous היה מהפכה על ידי יישום של הקרום הפלורסנט הסלקטיבית פיי מאו צבע FM 4-641. מאוחר יותר, היתרון של הטיה-כריכת הצבע Calcofluor לבן כסמן פלורסנט חיוני של הדינמיקה הדופן של התא פטרייתי התממשו2. מאז, הצבעים והמשתנים שלהם הפכו לחלק בלתי נפרד מניתוחי הדמיה של אורגל דינמיקה בפטריות, וממשיכים לספק תובנות חסרות תקדים לאורח החיים הפטרייתי הפילנטאלי. נייר זה מפרט את היישום של צבעי פלורסנט הוקמה ופחות ידוע עבור מעקב הדינמיקה קרום הפלזמה, אנדו-ואקסוציטוזה וקיר התא מורפולגנזה בפטריות filamentous. מעקב אנדוקציטוזה מאפשר שאלות ביולוגיות שונות הקשורות לחקר המחקר הכללי של האנדוציטוזה המתייחס ל-3. בשביל זה, לוקליזציה, מהירות וירושה של תאים ויטראז על התוספת לצבוע FM נרשם על ידי מיקרוסקופ הזמן לשגות וכימות לעומת הזנים פטריות נבדק4. צבע קיר תאים להתוות את הגבול החיצוני של התא ולאפשר מעקב אחר אירועים מורפולגנטיים, כולל התגבשות מקוטב קצה הצמיחה2, מסעףhyphal היתוך מיקוף6,7 והיווצרות מחיצת8. יתר על כן, הם להקל על כימות התצהיר של קיר התא מקומי זיהוי פגמים במהלך הקיר תאים biogenesis9. מכיוון שידע מפורט בתכונות הביוכימי והביופיזיקלי של כל סמן פלורסנט הוא תנאי מוקדם בסיסי עבור מוצלח ביישום vivo, מאפיינים אלה מסוכמים לראשונה עבור ששת הצבעים המוצגים במאמר זה.
צבעי ממברנה סלקטיבית FM (פיי מאו) צבעי לבנה הם מולקולות אמפיניתיים קטנות שאינן יכולות לעבור דרך הקשר אך הפיך עם העלון החיצוני של הביריות השומנים של הממברנות הביולוגית10. הם כמעט לא פלורסנט בתמיסה מימית, אבל להיות פלורסנט באינטנסיביות על שילוב קרום הפלזמה, יצירת אות לרעש מעולה (S/N)-יחס11. מאפיינים אלה הופכים אותם למותאמים באופן אידיאלי לצורך המחשה של קרום הפלזמה והדינמיקה התאיים, כולל מעקב אחר האנדו והאקסוציטוזה12. ירוק-פלורסנט FM 1-43 והאדום-פלורסנט FM 4-64 הם שני סמנים הנפוץ ביותר בשימוש בקרום פלורסנט למטרות אלה. SynaptoGreen C4 ו SynaptoRed C2 הם מולקולות גנריות מספקים חלופיים שניתן להלסירוגין בשימוש במקום FM 1-43 ו-FM 4-64, בהתאמה.
צבע הצבעים מהווה שלושה אזורים מבניים מרכזיים: (1) הזנב ליפופילית המקל על החדרת הצבע לתוך שומנים בלהה, (2) הליבה fluorophore הקובע את התכונות ספקטרליות של הצבע, והוא היווה על ידי שתי טבעות ארומטי מחובר על ידי אחד לשלושה איגרות חוב כפולות, ו (3) ראש הידרופילי טעונה חיובי המונע הכנסה מלאה וחדירות של הצבע דרך הקרום (איור 1A).
ככל הזנב ליפופילית, גבוה יותר הוא hydrophobicity של הצבע ובכך מחייב זיקה הקרום, אבל התחתון הוא מסיסות המים שלה ואת הקרום דה צביעת שיעור. כתוצאה מכך, משתני צבע FM שונים מייצרים הדינאמיקה ודפוסי הצביעת השונים. ההידרופוטביטי הגבוה ביותר של ה-C4-זנבית 1-43 מספק אות זריחה חזקה ויציבה יותר בקרומים פלזמה ומהירות ארגונית פנימית מהירה יותר מאשר ה-FM הקצר יותר C2 4-64, כאשר מיושם בריכוזים שווים (איור 2).
חשוב מכך, שיעורי ההתאגדות/הדיסוציאציה הקבועה והגבוהה של שני צבעי FM11 עם זמני ההחזקה הממוצעים של 1 – 6 לכל מולקולה לצבוע בודדים13 להפחית את הסיכויים לשיבוש הפרעה של תפקוד הממברנה, למשל, באמצעות שינוי של נזילות ממברנה או אינטראקציה קבועה בכפייה של חלבונים ממברנה. זו כנראה הסיבה העיקרית מדוע מולקולות אלה ניתן להשתמש כצבעים חיוניים. אף על פי כן, ריכוזי צבע FM מעל 50 μm רעילים לתאים פטרייתיים וצמחים2,14, וראיות של BY-2 פרוטואופרזה טבק מצביע על כך יותר 20 μm צבע FM להוביל לרוויה הממברנה פלזמה14. לכן, רצוי שלא לחרוג ממגבלה זו, במיוחד בהתחשב בעובדה כי הדמיה מעולה הושג עם מעט כמו 2 – 5 μm15,16.
בעיקר, תכונות ספקטרליות של הצבעים FM להשתנות מאוד בהתאם מיקרוסביבה קרום מסוים (נבדקו14). בדרך כלל, העירור וספקטרום הפליטה של צבעי FM בפתרונות ממיסים טהורים (כפי שניתן בדרך כלל במידע המוצר) שונים באופן משמעותי מזה בסביבות הסלולר ויכולים, ברוב המקרים, לא ישירות להתייעץ לבחירת הגדרות הדמיה של תא חי. עירור/פליטה מקסימה של FM 1-43 ו-FM 4-64, למשל, להיות כחול מוזז על ידי 37/46 nm ו 43/64 ננומטר, בהתאמה, כאשר מאוגד ממברנות פטריות בהשוואה לפתרונות שלהם ב מתנול (שולחן 1).
יסודות שבירת הקרקע לשימוש fm 4-64 ו-fm 1-43 עבור מעקב ממברנה פלזמה, אנדו-/exסוציציטוזה ו אורגונל דינמיקה, כולל הספיזנקירפר והמיטומטר, כבר תועד באופן מקיף עבור מגוון רחב של מינים פטרייתי filamentous בעבר2,4,17,18,19. הגדרות הדמיה מומלצות לצבעי FM הפועלים במינים מסוגים שונים של פטרייתי, מתוארים באיור 1B. מגבלות טכניות של הציוד הזמין או תנאים סלולריים וניסיוניים מסוימים, כגון בינוני התרבות, pH או טמפרטורה, עם זאת, עשוי לדרוש כמה עיבודים. למרבה המזל, צבעי FM לפעול מעל טווח ספקטרלי רחב, ותוצאות הדמיה טובה מאוד מושגת על ידי FM מרגש 1-43 עם 514 nm או FM 4-64 עם 488 nm. כתוצאה מכך, יש לקבוע את הגדרות ההדמיה האופטימליות בנפרד עבור כל סוג לדוגמה ויישום מיועד.
המשמרת של סטוק משמעותית של יותר מ 135 ננומטר של FM 4-64 מאפשר מעולה, במקביל שיתוף הדמיה עם fluorophores פולט אור ירוק; זה מנוצל לעתים קרובות כדי להעריך את הדינמיקה לוקליזציה תאיים של חלבון פלורסנט ירוק (gfp)-התווית היתוך חלבונים ביחס קרום פלזמה השביל endocytic9,20.
קירות תא-צבע סלקטיבי Calcofluor לבן M2R (CFW), גם משווק כמו פלורסנט בריאר 28, הוא כנראה צבע הפלורסנט הידוע ביותר המשמש כדי להכתים את קירות התא של חיידקים, פטריות, אצות, צמחים גבוהים חרקים. בתחילה משמש כסוכן הלבנה אופטית בתעשיית נייר, טקסטיל וחומרי ניקוי, היתרונות שלה עבור אבחון קליני של זיהומים פטרייתיים התממשו מוקדם על21,22. בגלל CFW intercalates הפיכה לתוך שרשרת כיטין המתהווה זה מפריע כאשר הרכבה רגילה של מיקרופיבריל במהלך biogenesis קיר התא ובכך לייצר לחץ קיר תא23. זה בתורו מעורר נזק קיר תא מנגנון תיקון המוביל לתוך מקומי מוגבר הקיר בתצהיר הגדר כתוצאה של גלוקן ו הפעלת הפעלה סטנדרטים24,25. תופעה זו יכולה להתרחש עם כל צבע שפועל על ידי מחייב באופן בלתי נשכח לפולימר קיר התא, הוא תלוי ריכוז והוא בולט ביותר בטיפים hyphal המייצגים את החלקים הפורה ביותר ובכך רגיש ביותר של תפטיר (איור 3). סיכום מקיף של המכונות המולקולריות המגיב לנזק לקיר התאים המסופק לאחרונה26.
צבע מנת יתר בשילוב עם רעילות יכול להוביל לפירוק התא מהיר של תאי hyphal (סרט 1). עם זאת, רגישות מוגברת כדי לצבוע ריכוזי כי הם "חיוניים" בסוג פראי ניתן לנצל כדי לזהות פגמים בביוסינתזה קיר התא של מוטציות הפסד של הגן9. עבור CFW ו קונגו האדום (CR), עוד צבע טקסטיל הידוע גם אדום ישיר 28 ו מועסקים כמו α-ו-β-כיטין-ספציפית קיר תא כתם עבור פטריות וחרקים27,28, ריכוזי הסף כי מאוד לגרום כיטין סטנדרטים היו נחושים עם > 60 μm CFW ו > 70 μm CR, בהתאמה, בעוד ריכוזים <15 μm של כל צבע לא לשנות או לעכב את הצמיחה פטרייתי29,30,31. היקי ואח ' הניח את הריכוז הזה הסף עבור CFW ב 25 μM2. לכן, מומלץ להשתמש ריכוזי צבען ≤ 5 μm להוציא את הלחץ הקשורות חפצים ולהבטיח באמצעות מולקולות אלה כמו באמת "צבעי פלורסנט חיוניים"2,32. זה חל באופן שווה על סולופניאיל Flavine 7GFE 500 (SPF) ו Pontamine Fast סקרלט 4B (PFS), נרדף ישירה צהוב 86 ישיר אדום 23, בהתאמה, שני צבעים אחרים שימושי קיר תאים אשר בקשת עבור פטריות דווחו בפעם הראשונה יותר מאשר לפני עשור33. אבל למרות תכונות ספקטרליות מדהים שלהם34,35, השימוש בשני הצבעים יש מאז מאוד מוגבלת36,37. כפי שהוצג בעבר עבור 1.5 μM CFW2, 2 ΜM SPF מספיקים כדי לפתור את הדינמיקה של קיר התא תחת תנאים מקומיים עם רזולוציה גבוהה מאוד הזמני (סרט 2). את אותן תוצאות ניתן להשיג עם 2 μM CR או PFS.
יחד, אלה ארבעת הצבעים, CFW, SPF, PFS ו-CR, מהווים ערכה של הקיר-סמנים מבוססי-פלורסנט סלקטיבי המכסה כמעט את ספקטרום אור הפליטה המלא לעין (400-700 ננומטר) מנוצל על מיקרוסקופ פלורסנט מודרני (איור 4). העלייה המשמעותית בעוצמת הקרינה הפלואורסצנטית על-ידי הקשירה לפולימרים של וול-cell היא הטבועה בכל הארבעה ומפיקה יחסי S/N מצוינים. זה בתורו היתרי לשמור על ריכוזי הצבע ואת עוצמת האור העירור נמוך מאוד מאפשר לבצע מכתים קיר תא כמו "מינון נמוך" לחיות הדמיה תא טכניקה2. מכיוון שצבעי הקיר האלה הם ממברנות פלזמה הניתנים לפעולה, הם מתפקדים בו ככתמים חיים/מתים. בעיקר, בשל ספקטרום מאוד רחב שלהם אור הפליטה, כמה מגבלות לגבי התכונות שיתוף הדמיה של CFW ו SPF עם fluorophores אחרים צריך להיחשב בזהירות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BRAND cell counting chamber</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR718005</td>
			<td>Thoma format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White M2R</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3543</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td>water immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td>water immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo Red</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6277</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>8,36,73,230</td>
			<td>organic solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 1-43</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6814</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6689</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>Rettberg</td>
			<td>1340691030</td>
			<td>3 mm glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BB02400600A113MNT0</td>
			<td>24 x 60 # 1 glass cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506353</td>
			<td>glycerol immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 Meta</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Minimal Medium</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td>generic fungal growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-slide 8-well</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>ibiTreat #1.5 polymer coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>polyester filtration material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>8,21,472</td>
			<td>92 x 16 mm culture dish w/o cams</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td>transparent gelling agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440762-9904-000</td>
			<td>oil immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pontamine Fast Scarlet 4B</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>212490</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>213400</td>
			<td>fungal growth medium for T. atroviride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Broth (PDB)</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>254920</td>
			<td>fungal growth medium for T. atroviride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706</td>
			<td>1.5 mL SafeSeal tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>5518016</td>
			<td>Cutfix sterile scalpel #23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>6,25,54,502</td>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solophenyl Flavine 7GFE 500</td>
			<td>CIBA</td>
			<td>1485385V6</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynaptoGreen C4</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>70020</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynaptoRed C2</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>70021</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe membrane filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>723-9945</td>
			<td>0.45 &#181;m SFCA syringe filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td>Leica</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vogel&#39;s Minimal Medium (VMM)</td>
			<td>FGSC</td>
			<td>Fungal Genetics Stock Centre</td>
			<td>fungal growth medium for N. crassa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging of filamentous fungi

היישום של קרום וקיר התא צבעי פלורסנט סלקטיבית לניתוח הדמיה של תא חי של אורגונל דינמיקה בתאי פטרייתי התחיל לפני שני עשורים ומאז ממשיך לתרום במידה רבה להבנת הפטרייתי הפילאמנטבי חיים. נייר זה מספק מדריך מעשי לניצול של שני צבעי הממברנה FM 1-43 ו-FM 4-64 ואת ארבעה כתמי קיר תא Calcofluor לבן M2R, סולופניאיל Flavine 7GFE 500, Pontamine Fast סקרלט 48 וקונגו האדום. המוקד הוא על היישום במינון נמוך שלהם כדי לוודא כתמים ללא פריט, הדמיה שיתוף המאפיינים שלהם, ואת ההערכה הכמותית שלהם. השיטות המוצגות חלות על כל הדגימות הפטרייתי הפילנטיות שניתן להכין בדרכים המתוארות. הגישות הבסיסיות לצביעת יכולות לשמש כנקודות התחלה למינים העשויים לדרוש תנאי טיפוח שונים. ראשית, התכונות הביופיסיים והביוכימי נבדקות כאשר הבנתם חיונית לשימוש בצבעים אלה ככתמי פלורסנט חיוניים באמת. שנית, הפרוטוקולים צעד-אחר-צעד מוצגים כי פירוט הכנת סוגים שונים של דגימות פטרייתי עבור הדמיה לחיות הפלורסנט. לבסוף, ניסויים לדוגמה להמחיש גישות שונות: (1) לזהות פגמים בארגון הזמני בזמן של אנדוקציטוזה במוטציות גנטיות, (2) בצורה יחסית לאפיין משותף וברור שיתוף לוקליזציה של GFP-שכותרתו חלבונים היעד במסלול endocytic, (3) זיהוי מורורפולתאי הקיר מומים במוטציה גנטית, ו (4) לפקח על הקיר תא biogenesis בזמן אמת.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi at JoVE.com

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

צבעי פלורסנט חיוניים הם כלים חיוניים לניתוח הדמיה של תא חי בביולוגיה מודרנית של תאים פטרייתיים. נייר זה מפרט את היישום של צבעי פלורסנט ידוע פחות ידועים עבור מעקב הדינמיקה קרום הפלזמה, אנדו-/אקסוציטוזה וקיר התא מורגנזה בפטריות filamentous.

יישום של ממברנה וקיר תא צבעי פלורסנט סלקטיבית עבור הדמיה בשידור חי התא של פטריות Filamentous

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

צבעי פלואורסצנט סלקטיביים ממברנה וקיר תא הם כלים חשובים לניתוח דינמיקת organelle ותאים פטרייתיים חיים. הפרוטוקולים שלנו מספקים רקע תיאורטי חיוני והנחיות מעשיות ליישום מבחר צבעים אלה כתמים חיוניים באמת. נקודת המפתח לכך היא להשתמש בריכוזי צבע נמוכים מאוד שאינם גורמים לחפצים תאיים הקשורים לרוויה או לרעילות צבע ועדיין מספקים אות טוב ליחסי רעש להדמיית תאים חיים באיכות גבוהה וארוכת טווח.עם עמיתים מהמחלקה לרפואה גרעינית של האוניברסיטה הרפואית, השתמשנו לאחרונה בטכניקות הכתמים האלה כדי לפתח גישה חדשנית לאבחון מונחה תמונה של aapergillosis. היכולת לפקח על מבני קרום וקיר התא בזמן אמת הייתה חיונית לקביעת דינמיקת ספיגת תרכובת התרופה הניסיונית. כדי להתחיל בהליך זה, השג תחילה תרבות מוקדמת מוכנה.השתמש אזמל סטריל לחתוך בלוק אגר קטן שנושא מיסליום לא sporulating מקצה המושבה של תרבות מוקדמת. מניחים את גוש אגר במרכז צלחת בינונית טרייה ומוצקה כדי לחסן את התרבות הניסיונית. הדגירה את התרבות הניסיונית על פי השלב ההתפתחותי שנועד להיות דגירה.הכנת מדגם היא עדינה במקצת ואופטימיזציה של הגדרות רכישת תמונה היא מורכבת למדי. הדגמה חזותית של שני ההליכים המלווים בהסבר מילולי מקלה מאוד על ההגיון. כדי לטעון את הדגימות, יש לשמור על תפירת כיסוי זכוכית נקייה של 24 על 60 מ"מ ולהוסיף למרכז 18 מיקרוליטרים של תות תוסף מלח נוזלי מינימלי בינוני או פיזיולוגי.הוסף שני microliters של מוכן 20 פתרון עבודה צבע micromolar לנוזל במרכז להחליק את הכיסוי ומערבבים היטב על ידי צינורות למעלה ולמטה מספר פעמים תוך הימנעות הייצור של בועות אוויר. באמצעות אזמל נקי, לגזור מדגם 15 על ידי 15 מילימטר מהפריפריה של המושבה ולמקם אותו אנכית ליד טיפה בינונית על החלקת הכיסוי. השתמש באזמל כדי לתמוך בקצה העליון של הבלוק ואצבע להחזיק את הצד האחורי של הבלוק במקום.לאחר מכן, לאט לאט להוריד את הצד נושא את המסטליום על הנוזל. הר את הדגימה המוכנה על שלב המיקרוסקופ. תחילה, התאימו את קביעות רכישת התמונה הבסיסיות כדי ללכוד דינמיקה עומדת בהיקף בודד כמפורט בפרוטוקול הטקסט.לצורך בדיקות ספיגת אנדוציטוזיס, התייעץ עם איור 1 וטבלה אחד מפרוטוקול הטקסט כדי לזהות את הגדרות העירור וההמסה הטובות ביותר עבור FM 143 או FM 464 הזמינות במערכת המיקרוסקופיה ולהתאים הגדרות אלה במערכת בהתאם. התחל הקלטת תמונה באמצעות ההגדרות שהותאמו בעבר והערך את התוצאות. לאחר מכן, מטב את הגדרות רכישת התמונה לרזולוציה המרחבית והזמפוראלית הנדרשת כדי ללכוד את ההיבט של קרום פלזמה או דינמיקת אנדוציטוזיס שהניסוי מתמקד בה.לדינמיקה של קיר התא, התייעץ עם איור 4 וטבלה אחת של פרוטוקול הטקסט כדי לזהות את הגדרות העירור וההמסה הטובות ביותר עבור צבע קיר התא המוחל ולהתאים את ההגדרות במערכת המיקרוסקופיה בהתאם. התחל הקלטת תמונה באמצעות ההגדרות שהותאמו בעבר והערך את התוצאות. לאחר מכן, מטב את הגדרות רכישת התמונה לרזולוציה המרחבית והזמפוראלית הנדרשת כדי ללכוד את ההיבט של מורפוגנזה של קיר התא שהניסוי מתמקד בו.בנוסף רק לדמיין תהליכים תאיים, הדמיה של תאים חיים מאפשרת הפקת מידע כמותי מהנתונים המוקלטים. בדוגמה של מסיאי ספיגת FM 464, דגימות פטרייתיות מעובדות כמושבות ומורכבות בשיטת בלוק אגר הפוכה. הראיה זיהתה פגמים בארגון spatio-temporal של אנדוציטוזיס במחיקת גנים וגנים מבטאים יתר על כן מוטנטים של החלבון הספציפי הפטרייתי SFP 2 של trichoderma atroviride.דוגמאות של FM 464 שיתוף הכתמים של חלבוני היתוך פלואורסצנטיים המיועדים לתאים אנדוציטיים מוצג כאן. כתם משותף זה מועסק כדי לקשר את ההתפלגות התת-תאית של שני החלבונים הפלואורסצנטיים הירוקים המשופרים המתויגים בחלבוני טרנס-ממברנה, SFP 2 ו- GPR 1, למסלול האנדוציטי בטריווירוסיד טריכודרמה. דוגמה של FM 464 שיתוף הכתמים לזיהוי הבדלים מורפוגנטיים מראה כי זה שיתוף הכתם מאפשר קשר נוסף של הדינמיקה לוקליזציה subcellular של חלבון מורכב BUD-6 תיוג קמח כדי לסיים כמה תהליכים תלויי סחר כגון היווצרות של ספיגה וצמיחה מקוטבת קצה המקף.הוא גם מאפיין הבדלים בארגון התת-תאי ובארכיטקטורת המקף בין סוג פראי וזנים מוטנטים של קרסה נוירוספרה. כתמי קיר תאים מייצגים מראים כי תכונות האינטראקציה השונות של לבן קלקופלור, solophenyl flavine, וקונגו אדום עם פולימרים קיר התא להדגיש הבדלים מורפגנטיים בין מוטציה דלתא SFP 2 ואת סוג הבר של trichoderma atroviride. הגדלת הלחץ בקיר התא שנגרם על ידי ריכוזי צבע גבוהים מתרחשת מהר יותר והוא בולט יותר מוטציה לעומת סוג הבר.בנוסף, אותן תמונות מאפשרות כימות של הבדלים מורפוגניים לגבי קוטר המקף ומרחק המחיצה בין שני הזנים. ניטור מייצג בזמן אמת של biosynthesis קיר התא עולה כי ריכוז לבן calcofluor נמוך מאוד מונע רוויה של קיר התא עם מולקולות צבע ומאפשר ניטור כמותי בזמן אמת של biosynthesis קיר התא. זה מגלה כי התצהיר של חומר קיר תא חדש אינו אחיד, אבל מגיב במהירות רבה ללחצים פיזיים מקומיים הנובעים עקירה יחסית של תא אחד על התקשרות תא לתא לפני dermalinfusion ב neurospora crassa.פחות זה יותר. יש להשתמש בצבע מועט ככל האפשר כדי למנוע הפרעה לסמן הפלואורסצנטי בתהליכים תאיים. בעקבות הליך זה, התאוששות flourescence לאחר ניסויים הלבנת תמונה יכול להתבצע כדי לכמת תחבורה ביוגנזה קינטיקה.ההקדמה החלוצית של כתמי ממברנה וקיר תאים בפטריות סיסמנטיות בתחילת המילניום עשתה ממש מהפכה באופן שבו אנו מסתכלים על פטריות. לבן Calcofluor יכול לגרום לגירויים בעיניים והוא סרטן מסווג. קונגו אדום הוא cancerigenic ו טרטוגנית, אז בבקשה ללבוש הגנה על העין והעור בעת טיפול צבעים אלה.

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

תיוג בתאי גזע עם צבעי ניאון על איתור פולשני עם דימות אופטי

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Labelling סלקטיבי של חלבונים על פני קרום התא באמצעות CyDye DIGE צבעים פלואוריד מינימלי

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

תיוג פלורסנט של COS-7-SNAP הבעת תג חלבונים Fusion עבור דימות תא חי

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

לחיות תא הדמיה של אירועי autophagy מוקדמים: Omegasomes ומעבר

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G- חלבון סלקטיבית GPCR תצורות נמדדו באמצעות סריג חיישנים ב assay fluorometer השעית תא חי

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

לימוד חלבון מערכת בקרת איכות של<em&gt; D. discoideum</em&gt; שימוש הדמית תא חי בקרת טמפרטורה

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Live-cell הדמיה של degranulation טסיות והפרשה תחת זרימה

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

הדמיית תאים חיים ברזולוציה סופר-רזולוציה של מבנים תת-תאיים

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...