Name: application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging of filamentous fungi
Uploaded: 2019-11-28T15:00:00
Duration: 7 min 44 s
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धन्यवाद अल को अनुदान #256524 प्रदान करने के लिए टायरोलियन विज्ञान कोष (टीडब्ल्यूएफ) के कारण, वियना विज्ञान और प्रौद्योगिकी कोष (WWTF) को एसजेड को अनुदान #LS13-086 प्रदान करने के लिए, और ओपन एक्सेस प्रकाशन का समर्थन करने के लिए इंसब्रुक विश्वविद्यालय के प्रकाशन कोष के लिए है। लेखक ों ने लीका टीसीएस एसपी5 द्वितीय कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप प्रदान करने के लिए इंसब्रुक विश्वविद्यालय के जूलॉजी विभाग को भी धन्यवाद दिया।

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों और कुछ भी नहीं खुलासा किया है ।

यह लेख जमीन तोड़ने का काम जारी है कि 2000 के दशककेशुरू में फिलामेंटल कवक के लिए महत्वपूर्ण ऑर्गेनेल मार्कर के रूप में विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों के उपयोग की स्थापना2,4,43,और एफएम रंगों और चयनित सेल दीवार रंगों के फोटोभौतिक और सेल जैविक गुणों पर चर्चा करने का प्रयास पहले की तुलना में अधिक विस्तार से। विशेष रूप से अवांछित सेलुलर प्रभावों के संबंध में, जैसे झिल्ली संतृप्ति या सेल दीवार क्षति, जो कुछ रंग सांद्रता से ऊपर होती हैं। क्या पहले सेलुलर स्तर पर गैर विषाक्त माना जाता है अब आणविक स्तर पर विषाक्त माना जाता है । हालांकि ये प्रभाव बहुत सूक्ष्म हो सकते हैं और ऑर्गेनेल या सेल व्यवहार में स्पष्ट परिवर्तनों से सीधे स्पष्ट नहीं हो सकते हैं, लेकिन दृश्य के अलावा अन्य रंग के आवेदन के किसी भी संभावित हस्तक्षेप को देशी आणविक कार्य की जांच के लिए कम किया जाना चाहिए। सौभाग्य से, सिलिकॉन हिमस्खलन फोटोडायोड डिटेक्टरों (एसआई-एपीडी)44 या एयरिकस्कैन क्षेत्र डिटेक्टर45जैसे आधुनिक डिटेक्टरों की बेहतर संवेदनशीलता और क्वांटम दक्षता, पहले की तुलना में कम रंग की मात्रा के उपयोग को सुविधाजनक बनाता है। लेख का एक अन्य प्रमुख उद्देश्य अन्य फ्लोरोफोरस के साथ इन रंगों के सह-इमेजिंग गुणों का उदाहरण देना है, सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि जीव विज्ञान में सबसे अधिक बार उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में जीएफपी के लोग। यह इमेजिंग प्रयोगों के डिजाइन में सहायता करना चाहिए जिसका उद्देश्य फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की उप-सेलुलर स्थानीयकरण गतिशीलता को फंगल सेल दीवार, प्लाज्मा झिल्ली या एंडो-एंड एक्सोसाइटोसिस मार्ग आदि के लिए सहसंबंधित करना है।
प्राकृतिक और तनाव मुक्त स्थितियों के तहत इमेजिंग विश्वसनीय डेटा के अधिग्रहण के लिए महत्वपूर्ण है। संस्कृति माध्यम और नमूना तैयारी के बारे में कुछ व्यावहारिक विचार इष्टतम शर्तों है कि कलाकृतियों मुक्त, स्वस्थ, उच्चतम एस/एन अनुपात के साथ तनावग्रस्त कोशिकाओं के लंबे समय अवलोकन किसी भी दिए गए नमूने के लिए संभव खोजने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करने का लक्ष्य है । विश्वसनीय और सार्थक इमेजिंग परिणाम प्राप्त करने का कोई सार्वभौमिक तरीका नहीं है। यह दृष्टिकोण के लिए अंतर्निहित है कि नमूना, व्यक्तिपरकता और माइक्रोस्कोपिस्ट की अपेक्षाओं की जैविक भिन्नता, साथ ही छवि पोस्ट प्रसंस्करण का क्रमशः डेटा अधिग्रहण और व्याख्या पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। इसलिए, माइक्रोस्कोपिस्ट का व्यावहारिक अनुभव, जांच के तहत कवक के सेल जीव विज्ञान के बारे में उसका अंतरंग ज्ञान, साथ ही लैब सेटिंग में यथासंभव प्राकृतिक और अबाधित के रूप में स्थितियां बनाने के लिए कुशल नमूना तैयारी, इमेजिंग डेटा प्राप्त करने और मूल्यांकन करने के लिए सर्वोपरि है जो सच्चाई से अध्ययन की गई सेलुलर घटनाओं को दर्शाता है । अंगूठे के नियम के रूप में, फ्लोरोसेंट रंगों के अवांछित दुष्प्रभावों की घटना, सूक्ष्म से लेकर और इस प्रकार स्पष्ट रूप से प्लाज्मा झिल्ली या सेल दीवार की स्पष्ट रूप से दिखाई सक्रियता नहीं है, कोशिका ऑटोलिसिस के सरल साइटोटॉक्सिक प्रेरण के लिए तनाव प्रतिक्रिया रास्ते को फिर से मॉडलिंग करते हैं, केवल कम रंग की सांद्रता लागू करके सुरक्षित रूप से रोका जा सकता है ।
फ्लोरोसेंट रंगों का आवेदन सरल है, फिर भी उनकी विशिष्टताओं की खराब विशेषता है। फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करने की एक प्रमुख ताकत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की तैयारी सादगी है। कवक की खेती और नमूना, रंग (एस) के अलावा, और माइक्रोस्कोप चरण पर बढ़ते (अभ्यास के साथ) सीधा हैं। मूल इमेजिंग सेटिंग्स का समायोजन, जिसमें उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य, एक्सपोजर टाइम, टाइम कोर्स सेटिंग्स आदि शामिल हैं, कोशिकाओं के अंदर इस्तेमाल किए गए फ्लोरोसेंट रंगों के माइक्रोस्कोप और जैविक नियमों के सरल बायोफिजिकल नियमों का पालन करते हैं। तालिका 1 प्रयोग के लिए सबसे उपयुक्त रंग या रंग संयोजन की पहचान का समर्थन करना चाहती है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट रंगों की उचित कीमत होती है, जो भरोसेमंद उच्च गुणवत्ता के साथ आसानी से उपलब्ध होती है और इस प्रकार अत्यधिक प्रजनन योग्य अनुप्रयोग सुनिश्चित करती है।
झिल्ली या सेल दीवार चयनात्मक फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करने के दो प्रमुख प्रतिबंध उनके सटीक धुंधला गुणों का (अक्सर) सीमित ज्ञान हैं, जो ज्यादातर मामलों में ऑर्गेनेल और आणविक स्तर पर गैर-विशिष्ट हैं, और उनकी एकाग्रता-निर्भर अवांछित दुष्प्रभाव हैं। एफएम रंग इंडो-और एक्सोसाइटोसिस में भाग लेने वाले लिपिड बाइलेयर के लिए विशिष्ट हैं। हालांकि, ठीक है जो उपकोशिकीय ऑर्गेनेल्स परीक्षण शर्तों के तहत क्रमिक रूप से लेबल हो जाते हैं, तुरंत स्पष्ट नहीं है और इसके लिए विभिन्न एफएम डी वेरिएंट की तुलना और अतिरिक्त ऑर्गेनेल-विशिष्ट मार्कर के साथ सह-लेबलिंग की आवश्यकता होती है। एफएम 4-64 की तुलना में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली के लिए एफएम 1-43 की वरीयता एक उदाहरण है। सेल वॉल चयनात्मक रंग कवक सेल दीवार के तीन प्रमुख बहुलकों के लिए अलग-अलग विशिष्टता प्रदर्शित करते हैं। CFW को ग्लूकान और चिटिन के लिए एक गैर-विशिष्ट दाग माना जाता है, एसपीएफ को 1,4-ग्लूकान के लिए सबसे चयनात्मक माना जाता है, और सीआर को α-और-chitins के लिए अत्यधिक चयनात्मक माना जाता है। कवक सेल दीवार पॉलीसैकराइड ्समें पीएफएस की बाध्यकारी विशिष्टता के बारे में जानकारी वर्तमान में उपलब्ध नहीं है। जांच के तहत कवक प्रजातियों में दिए गए रंग की एकाग्रता पर किस अनुपात में कवक कोशिका दीवार बहुलक को सबसे प्रभावी ढंग से लेबल किया जाता है, आसानी से उत्तर नहीं दिया जाता है, और अन्य जीवों या अन्य फंगल प्रजातियों में विट्रो या वीवो में प्राप्त विस्तृत मापके आवेदन पर बहुत सावधानी पूर्वक विचार किया जाना चाहिए। दुर्भाग्य से, यह जानकारी35,42,46साहित्य में विरल और अत्यधिक बिखरी हुई है। अधिक हाल के रिकॉर्ड है कि पिछले अध्ययन ों पर पालन करेंगे३३ विशेष रूप से कवक में विशेष रुप से प्रदर्शित रंगों के सटीक धुंधला गुणों में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए वर्तमान में उपलब्ध नहीं हैं ।
धुंधला पैटर्न और सेलुलर प्रतिक्रियाओं का सही मूल्यांकन करने के लिए इमेजिंग नियंत्रण आवश्यक हैं। शायद सबसे चुनौतीपूर्ण हिस्सा है, हालांकि, कवक के सेल जीव विज्ञान को इतनी अच्छी तरह से जानना है कि झिल्ली और सेल दीवार चयनात्मक फ्लोरोसेंट रंगों के उपकोशिकीय स्थानीयकरण में दर्ज परिवर्तन, सेलुलर वास्तुकला या हाइफाल विकास पैटर्न में परिवर्तन विशेष रूप से और आत्मविश्वास से प्रायोगिक उपचार के अभीष्ट प्रभावों से संबंधित हो सकते हैं। इसके लिए, किसी भी नए लाइव-सेल इमेजिंग प्रयोग के साथ अच्छे नियंत्रण होना महत्वपूर्ण है। इनमें अधिग्रहीत छवि से पृष्ठभूमि ऑटोफ्लोरेसेंस और डिटेक्टर शोर को बाहर करने के लिए नकारात्मक इमेजिंग नियंत्रण के रूप में अनुपचारित जंगली प्रकार शामिल हैं, और म्यूटेंट के साथ काम करते समय एक रूपात्मक तुलनात्मक होना शामिल है। इसके अलावा, एक सकारात्मक इमेजिंग नियंत्रण, उदाहरण के लिए एक तनाव जो साइटोप्लाज्म या किसी अन्य प्रसिद्ध फ्लोरोसेंट मार्कर प्रोटीन में जीएफपी या आरएफपी को व्यक्त करता है, आवश्यक न्यूनतम उत्तेजना प्रकाश तीव्रता को सेट करने और सेल जीवन शक्ति नियंत्रण रखने के लिए आवश्यक है। एक बार जब ये नियंत्रण सेट हो जाते हैं, तो फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग केवल दृश्य कार्यों तक ही सीमित नहीं है, बल्कि उनकी एकाग्रता पर निर्भर धुंधला गतिशीलता, साथ ही एकाग्रता पर निर्भर दुष्प्रभावों का विश्लेषण किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, वास्तविक समय में सेल वॉल बायोसिंथेसिस की मात्रात्मक निगरानी के लिए या संवेदनशीलता परख47में उत्परिवर्ती-विशिष्ट फेनोटाइप की पहचान के लिए।
बेहतर भविष्य के अनुप्रयोग ों रंग धुंधला गुणों के एक विस्तृत कार्यात्मक विश्लेषण पर निर्भर करते हैं । एक प्रमुख सतत चुनौती क्वांतिटेटिव इमेज विश्लेषणों को और बेहतर बनाना और स्वचालित करना है ताकि तंतु कवक में झिल्ली और सेल वॉल चयनात्मक फ्लोरोसेंट रंगों की उप-सेलुलर गतिशीलता के कार्यात्मक मूल्यांकन को आगे बढ़ाया जा सके। इसके लिए, विशेष परिवहन मार्गों में कमी वाले उत्परिवर्ती उपभेदों के संयोजन में ज्ञात ऑर्गेनेल और सेल वॉल बहुलक मार्कर के साथ इन रंगों के व्यापक, मात्रात्मक सह-स्थानीयकरण अध्ययनों की आवश्यकता होती है या जिनमें विशिष्ट संरचनात्मक घटकों की कमी होती है। एफएम रंगों के साथ तुलनात्मक विश्लेषण के लिए कई एंडोसाइटोसिस मार्कर48,49उपलब्ध हैं, और कवक में सेल वॉल रंगों की अभी भी खराब विशेषता बाध्यकारी विशिष्टताओं के संबंध में, फ्लोरोसेंट-लेबल ग्लूकन-विशिष्ट एंटीबॉडी50 का अनुप्रयोग इस मुद्दे को हल करने की संभावना प्रदान कर सकता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BRAND cell counting chamber</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR718005</td>
			<td>Thoma format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White M2R</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3543</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td>water immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td>water immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo Red</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6277</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>8,36,73,230</td>
			<td>organic solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 1-43</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6814</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6689</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>Rettberg</td>
			<td>1340691030</td>
			<td>3 mm glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BB02400600A113MNT0</td>
			<td>24 x 60 # 1 glass cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506353</td>
			<td>glycerol immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 Meta</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Minimal Medium</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td>generic fungal growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-slide 8-well</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>ibiTreat #1.5 polymer coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>polyester filtration material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>8,21,472</td>
			<td>92 x 16 mm culture dish w/o cams</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td>transparent gelling agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440762-9904-000</td>
			<td>oil immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pontamine Fast Scarlet 4B</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>212490</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>213400</td>
			<td>fungal growth medium for T. atroviride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Broth (PDB)</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>254920</td>
			<td>fungal growth medium for T. atroviride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706</td>
			<td>1.5 mL SafeSeal tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>5518016</td>
			<td>Cutfix sterile scalpel #23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>6,25,54,502</td>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solophenyl Flavine 7GFE 500</td>
			<td>CIBA</td>
			<td>1485385V6</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynaptoGreen C4</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>70020</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynaptoRed C2</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>70021</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe membrane filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>723-9945</td>
			<td>0.45 &#181;m SFCA syringe filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td>Leica</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vogel&#39;s Minimal Medium (VMM)</td>
			<td>FGSC</td>
			<td>Fungal Genetics Stock Centre</td>
			<td>fungal growth medium for N. crassa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging of filamentous fungi

कवक कोशिकाओं में ऑर्गेनेल गतिशीलता के लाइव-सेल इमेजिंग विश्लेषण के लिए झिल्ली और सेल दीवार चयनात्मक फ्लोरोसेंट रंगों का अनुप्रयोग दो दशक पहले शुरू हुआ था और तब से फिलामेंट्रस फंगल की हमारी समझ में बहुत योगदान देना जारी है जीवन शैली. यह पेपर दो झिल्ली रंगों एफएम 1-43 और एफएम 4-64 और चार सेल वॉल दाग Calcofluor व्हाइट M2R, सोलोफेनाइल फ्लेवाइन 7GFE 500, पोंटामाइन फास्ट स्कार्लेट 48 और कांगो रेड के उपयोग के लिए एक व्यावहारिक गाइड प्रदान करता है। ध्यान उनके कम खुराक आवेदन पर है कलाकृतियों मुक्त धुंधला, उनके सह इमेजिंग गुणों, और उनके मात्रात्मक मूल्यांकन का पता लगाने के लिए । प्रस्तुत किए गए तरीके सभी फिलामेंस फंगल नमूनों पर लागू होते हैं जिन्हें वर्णित तरीकों से तैयार किया जा सकता है। मौलिक धुंधला दृष्टिकोण प्रजातियों के लिए रूपांतरों के लिए शुरू अंक के रूप में काम कर सकते है कि विभिंन खेती की स्थिति की आवश्यकता हो सकती है । सबसे पहले, जैव भौतिक और जैव रासायनिक गुणों की समीक्षा की जाती है क्योंकि इन रंगों को वास्तव में महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट दाग के रूप में उपयोग करने के लिए उनकी समझ आवश्यक है। दूसरे, कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए जाते हैं जो फ्लोरोसेंट लाइव-सेल इमेजिंग के लिए विभिन्न फंगल नमूना प्रकारों की तैयारी का विस्तार करते हैं। अंत में, उदाहरण प्रयोग विभिन्न दृष्टिकोणों को दर्शाते हैं: (1) आनुवंशिक म्यूटेंट में एंडोसाइटोसिस के स्थानिक-लौकिक संगठन में दोषों की पहचान करें, (2) तुलनात्मक रूप से एफएफपी-लेबल वाले लक्ष्य प्रोटीन के साझा और विशिष्ट सह-स्थानीयकरण की विशेषता है एंडोसाइटिक मार्ग में, (3) एक आनुवंशिक उत्परिवर्ती में मॉर्फोजेनेटिक सेल दीवार दोषों की पहचान करता है, और (4) वास्तविक समय में सेल वॉल बायोजेनेसिस की निगरानी करता है।

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Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

आधुनिक फंगल सेल जीव विज्ञान में लाइव-सेल इमेजिंग विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट रंग आवश्यक उपकरण हैं। यह पेपर प्लाज्मा झिल्ली गतिशीलता, एंडो/एक्सोसाइटोसिस और फिलामेंटल कवक में सेल वॉल मॉर्फोजेनेसिस पर नज़र रखने के लिए स्थापित और कम ज्ञात फ्लोरोसेंट रंगों के आवेदन का विवरण देता है।

फिलामेंडस कवक के लाइव-सेल इमेजिंग के लिए झिल्ली और सेल वॉल चयनात्मक फ्लोरोसेंट रंगों का आवेदन

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

झिल्ली और सेल दीवार चयनात्मक फ्लोरोसेंट रंग ऑर्गेनेल गतिशीलता और जीवित फंगल कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। हमारे प्रोटोकॉल वास्तव में महत्वपूर्ण दाग के रूप में इन रंगों के चयन के आवेदन के लिए आवश्यक सैद्धांतिक पृष्ठभूमि और व्यावहारिक दिशानिर्देश प्रदान करते हैं। इसके लिए महत्वपूर्ण बिंदु बहुत कम डाई सांद्रता का उपयोग करना है जो संतृप्ति या डाई विषाक्तता से संबंधित सेलुलर कलाकृतियों का कारण नहीं है, जबकि अभी भी उच्च गुणवत्ता वाले, दीर्घकालिक लाइव सेल इमेजिंग के लिए शोर अनुपात को अच्छा संकेत प्रदान करते हैं।चिकित्सा विश्वविद्यालय के परमाणु चिकित्सा विभाग के सहयोगियों के साथ, हमने हाल ही में इन धुंधला तकनीकों का उपयोग aapergillosis के छवि-निर्देशित निदान के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण विकसित करने के लिए किया। वास्तविक समय में झिल्ली और सेल दीवार संरचनाओं की निगरानी करने की क्षमता प्रायोगिक दवा यौगिक की तेज गतिशीलता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण थी। इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, पहले एक तैयार प्रीकल्चर प्राप्त करें।एक छोटे आगर ब्लॉक को काटने के लिए एक स्टरल स्केलपेल का उपयोग करें जो प्रीकल्चर के कॉलोनी किनारे से गैर-स्पोरुलेटिंग माइसेलियम को वहन करता है। प्रयोगात्मक संस्कृति को टीका लगाने के लिए एक ताजा, ठोस मध्यम प्लेट के केंद्र में आगर ब्लॉक रखें। प्रयोगात्मक संस्कृति को विकासात्मक चरण के अनुसार इनक्यूबेट करना है।नमूना तैयारी कुछ हद तक नाजुक है और छवि अधिग्रहण सेटिंग्स का अनुकूलन जटिल है। मौखिक स्पष्टीकरण के साथ दोनों प्रक्रियाओं का दृश्य प्रदर्शन बहुत ही प्रतिशोध की सुविधा प्रदान करता है। नमूनों को माउंट करने के लिए, एक साफ 24 बाय 60 मिलीमीटर ग्लास कवर स्लिप तैयार रखें और केंद्र पर तरल न्यूनतम मध्यम या शारीरिक नमक समाधान के 18 माइक्रोलीटर जोड़ें।कवर स्लिप के केंद्र में तरल के लिए तैयार 20 माइक्रोमोलर डाई वर्किंग सॉल्यूशन के दो माइक्रोलीटर जोड़ें और हवा के बुलबुले के उत्पादन से बचते हुए कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं। एक साफ स्केलपेल का उपयोग करके, कॉलोनी की परिधि से 15 बाय 15 मिलीमीटर नमूना काटें और इसे कवर स्लिप पर मध्यम बूंद के बगल में खड़ी रखें। ब्लॉक के ऊपरी किनारे और एक उंगली को ब्लॉक के पीछे की ओर रखने के लिए एक उंगली का समर्थन करने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें।फिर, धीरे-धीरे तरल पर माइसेलियम ले जाने वाले पक्ष को कम करें। तैयार नमूने को माइक्रोस्कोप चरण पर माउंट करें। सबसे पहले, टेक्स्ट प्रोटोकॉल में उल्लिखित व्यक्तिगत हाइफा में स्थायी गतिशीलता को कैप्चर करने के लिए मूल छवि अधिग्रहण सेटिंग्स को समायोजित करें।एंडोसाइटोसिस तेज परख के लिए, एफएम 143 या एफएम 464 के लिए सबसे अच्छी उत्तेजन और उत्सर्जन सेटिंग्स की पहचान करने के लिए टेक्स्ट प्रोटोकॉल में से एक फिगर वन और टेबल एक से परामर्श करें जो माइक्रोस्कोपी सिस्टम पर उपलब्ध हैं और तदनुसार सिस्टम में इन सेटिंग्स को समायोजित करें। पहले समायोजित सेटिंग्स का उपयोग करके इमेज रिकॉर्डिंग शुरू करें और परिणामों का मूल्यांकन करें। फिर, प्लाज्मा झिल्ली या एंडोसाइटोसिस गतिशीलता के पहलू को कैप्चर करने के लिए आवश्यक स्थानिक और लौकिक संकल्प के लिए छवि अधिग्रहण सेटिंग्स को अनुकूलित करें प्रयोग पर केंद्रित है।सेल वॉल डायनेमिक्स के लिए, एप्लाइड सेल वॉल डाई के लिए सबसे अच्छी उत्तेजन और उत्सर्जन सेटिंग्स की पहचान करने और तदनुसार माइक्रोस्कोपी सिस्टम पर सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए टेक्स्ट प्रोटोकॉल में से एक फिगर चार और टेबल एक से परामर्श करें। पहले समायोजित सेटिंग्स का उपयोग करके इमेज रिकॉर्डिंग शुरू करें और परिणामों का मूल्यांकन करें। फिर, सेल वॉल मॉर्फोजेनेसिस के पहलू को कैप्चर करने के लिए आवश्यक स्थानिक और लौकिक संकल्प के लिए छवि अधिग्रहण सेटिंग्स को अनुकूलित करें प्रयोग पर केंद्रित है।सिर्फ सेलुलर प्रक्रियाओं की कल्पना करने के अलावा, लाइव सेल इमेजिंग रिकॉर्ड किए गए डेटा से मात्रात्मक जानकारी निकालने की अनुमति देता है। एफएम 464 तेज परख का एक उदाहरण में, कवक नमूनों को कालोनियों के रूप में खेती की जाती है और उल्टे आगर ब्लॉक विधि द्वारा घुड़सवार किया जाता है। परख जीन हटाने में एंडोसिटोसिस के स्थानिओ-लौकिक संगठन में दोषों की पहचान की और ट्राइकोडर्मा एट्रोविराइड के फंगल विशिष्ट प्रोटीन एसएफपी 2 के जीन ओवर-एक्सप्रेस म्यूटेंट ।एंडोसाइटिक डिब्बों के लिए लक्षित फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन के एफएम 464 सह-धुंधला के उदाहरण यहां दिखाए गए हैं। यह सह-धुंधला दो उन्नत हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग ट्रांसमेम्ब्रान प्रोटीन, एसएफपी 2 और जीपीआर 1 के उप-कोशिकीय वितरण से संबंधित है, जो ट्राइकोडर्मा एट्रोविराइड में एंडोसाइटिक मार्ग के लिए है। मॉर्फोजेनेटिक मतभेदों की पहचान के लिए एफएम 464 सह-धुंधला का एक उदाहरण से पता चलता है कि यह सह-धुंधला कुछ तस्करी-निर्भर प्रक्रियाओं जैसे सेप्टा और ध्रुवीकृत हाइफल टिप विकास के गठन के अंत में flourescently लेबल FLOURescently लेबल के उपकोशिकीय स्थानीयकरण गतिशीलता के आगे संबंध की अनुमति देता है।यह न्यूरोस्पोरा क्रैसा के जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती उपभेदों के बीच उपकोशिकीय संगठन और हाइफाल वास्तुकला में अंतर की भी विशेषता है। प्रतिनिधि सेल दीवार धुंधला से पता चलता है कि कैल्कोफ्लोर सफेद, सोलोफेनिल फ्लेवाइन के विभिन्न बातचीत गुण, और सेल वॉल पॉलिमर के साथ कांगो लाल डेल्टा एसएफपी 2 उत्परिवर्ती और ट्राइकोडर्मा एट्रोविराइड के जंगली प्रकार के तनाव के बीच मॉर्मोजेनेटिक मतभेदों को उजागर करते हैं। ऊंचा डाई सांद्रता द्वारा दिए गए सेल दीवार तनाव को बढ़ाना अधिक तेज़ी से होता है और जंगली प्रकार की तुलना में उत्परिवर्ती में अधिक स्पष्ट होता है।इसके अलावा, एक ही छवियां दोनों उपभेदों के बीच हाइफाल व्यास और सेप्टल दूरी के बारे में मॉर्फोजेनेटिक मतभेदों की मात्रा के लिए अनुमति देती हैं। सेल वॉल बायोसिंथेसिस की प्रतिनिधि रीयलटाइम मॉनिटरिंग इंगित करती है कि बहुत कम कैलकोफ्लोर सफेद एकाग्रता डाई अणुओं के साथ सेल दीवार के संतृप्ति को रोकती है और सेल वॉल बायोसिंथेसिस की मात्रात्मक रीयलटाइम निगरानी की अनुमति देती है। इससे पता चलता है कि नई सेल दीवार सामग्री का जमाव एक समान नहीं है, लेकिन न्यूरोस्पोरा क्रैसा में डर्मालिनफ्यूजन से पहले सेल-टू-सेल अटैचमेंट पर एक सेल के सापेक्ष विस्थापन के परिणामस्वरूप स्थानीयकृत शारीरिक तनावों के लिए बहुत तेजी से प्रतिक्रिया करता है।कम ज्यादा है। सेलुलर प्रक्रियाओं के साथ फ्लोरोसेंट मार्कर के हस्तक्षेप को रोकना संभव के रूप में छोटे डाई का उपयोग करें। इस प्रक्रिया के बाद, परिवहन और बायोजेनेसिस काइनेटिक्स की मात्रा निर्धारित करने के लिए फोटो-ब्लीचिंग प्रयोगों के बाद आटा-ब्लीचिंग वसूली की जा सकती है।सहस्राब्दी की शुरुआत में फिलामेंटस कवक में झिल्ली और सेल दीवार धुंधला होने की अग्रणी शुरूआत ने सचमुच कवक को देखने के तरीके में क्रांतिकारी बदलाव किया। Calcofluor सफेद आंखों में जलन पैदा कर सकता है और एक वर्गीकृत कैंसर है। कांगो लाल कैंसर और टेराटोजेनिक है, इसलिए इन रंगों को संभालते समय आंख और त्वचा की सुरक्षा पहनें।

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

गैर इनवेसिव पता लगाने के लिए प्रतिदीप्त रंगों के साथ ऑप्टिकल इमेजिंग के साथ स्टेम सेल लेबल

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

सेल सतह प्रोटीन CyDye DIGE Fluor मिनिमल रंगों का उपयोग कर के चयनात्मक लेबलिंग

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

एफ actin प्रतिदीप्त के माध्यम से गतिशीलता का लाइव सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी धब्बा (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

COS-7 के फ्लोरोसेंट लेबलिंग लाइव सेल इमेजिंग के लिए तस्वीर टैग फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

प्रारंभिक भोजी घटनाक्रम की सेल इमेजिंग लाइव: Omegasomes और परे

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते रहते चूहों में इमेजिंग subcellular संरचनाओं के लिए intravital माइक्रोस्कोपी

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

जी प्रोटीन चयनात्मक GPCR रचना एक जीवित कोशिका सस्पेंशन fluorometer परख में झल्लाहट सेंसर का उपयोग करके मापा

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

प्रोटीन की गुणवत्ता नियंत्रण प्रणाली का अध्ययन<em&gt; डी। discoideum</em&gt; तापमान नियंत्रित लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

प्लेटलेट डीग्रेन्युलेशन और स्राव के तहत लाइव-सेल इमेजिंग फ्लो

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

सुपर-रिज़ॉल्यूशन लाइव सेल इमेजिंग ऑफ सबसेलुलर संरचनाओं

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...