Name: application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging of filamentous fungi
Uploaded: 2019-11-28T15:00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi at JoVE.com

Takk er på grunn av den tyrolske Science Fund (TWF) for å gi stipend #256524 til AL, til Wien Science and Technology Fund (WWTF) for å gi stipend #LS13-086 til SZ, og til publisering fondet ved Universitetet i Innsbruck for å støtte åpen tilgang publikasjon. Forfatterne også takke Institutt for zoology ved Universitetet i Innsbruck for å gi Leica TCS SP5 II konfokalmikroskopi laserskanning mikroskop.

1. utarbeidelse av sopp prøver
<ol><li>Fungal pre-kulturer<ol>
<li>Vaksinere ønsket belastning på en passende solid agar medium, slik som potet druesukker agar (PDA) for Trichoderma atroviride eller Vogel ' s minimal medium (VMM) for Neurospora crassa. Legg til et passende markeringsmerke når du arbeider med transformant stammer.</li>
		<li>Ruge den pre-kulturen ved organismen optimale temperatur. For eksempel, T. atroviride ved 25 ° c og N. Crassa ved 30 ° c, og 12 h/12 h lys/mørke sykluser til en sporulating mycel har utviklet men ennå ikke nådd kanten av platen. På en standard størrelse Petri parabolen (9,2 cm Ø), dette tar Wild-type T. atroviride på 4-6 dagers gjennomsnitt, mens N. crassa Wild type når dette stadiet etter 3-4 dager i gjennomsnitt.</li>
	</ol></li>
	<li>Dyrking av sopp kolonier<ol>
<li>Ved hjelp av en steril skalpell, kuttet en liten 3 mm x 3 mm agar blokk bærer ikke-sporulating mycel fra kolonien kanten av pre-kulturen.</li>
		<li>Plasser agar blokken i midten av en frisk solid medium plate for å vaksinere den eksperimentelle kulturen.</li>
		<li>Ruge den eksperimentelle kulturen i henhold til utviklingsfasen ment å bli undersøkt. For eksempel, den ville-type T. atroviride krever 20-22 timer ved 25 ° c i mørket for å utvikle kolonier av ca 2 cm diameter på PDA, mens vill-type N. crassa når koloni diameter på ca 4 cm etter 14-16 h av Inkubasjons ved 30 ° c i mørket på VMM. Merk: Inkubasjons i mørket hindrer dannelse av pigmenter som kan innføre autofluorescence. For at fjerne medium miljøet fluorescens fra det eksperimentelle kulturen, ombytte agar med 1,5% w/v av en gjennomsiktig solidifying agent (se bordet av materialer), og alle innviklet medium med en definerte minimal medium.</li>
	</ol></li>
	<li>Dyrking av solide germling kulturer<ol>
<li>Bruk 5 mL steril fysiologisk saltoppløsning (0,9% w/v NaCl) for å høste conidial sporer fra pre-kulturen plate og samle den resulterende spore suspensjonen i en 15 mL skrue cap tube.</li>
		<li>Bland spore suspensjonen godt ved energisk virvlingen og deretter filtrere den over en 1 cm x 5 cm stripe av sterilt filter stoff (se tabell over materialer) lett stappet inn i en 1 ml pipette TIP (både montert og autoklaveres forhånd) til en frisk steril tube.</li>
		<li>Bestemme spore tetthet med en celle telling kammer og forberede en 1 x 107 celler/ml spore suspensjon med fysiologisk saltløsning. Merk: spore fjæringen kan oppbevares ved 4 ° c i opptil to uker.</li>
		<li>Klargjør en standard størrelse Petri rett (9,2 cm Ø) med 20 mL fast medium og tilsett 15-20 sterile glassperler (3 mm Ø) på toppen.</li>
		<li>Pipetter 200 μL av spore-fjæringen på medium platen og fordele cellene jevnt over hele platen ved å riste forsiktig. Samle glass perlene i et beger med 70% etanol for gjenbruk.</li>
		<li>Ruge den eksperimentelle kulturen i henhold til utviklingsfasen ment å bli undersøkt. For eksempel krever T. atroviride Wild- typen 5 – 6 timer ved 25 ° c i mørket for å utvikle conidial GERMLINGS på PDA, mens N. crassa Wild-typen utvikler conidial germlings etter 3 – 4 timer med Inkubasjons ved 30 ° c i mørket på VMM. NOTE: for at fjerne alle medium miljøet fluorescens fra det eksperimentelle kulturen, ombytte agar med 1,5% w/v av en gjennomsiktig solidifying agent, og alle innviklet medium med en definerte minimal medium.</li>
	</ol></li>
	<li>Dyrking av flytende germling kulturer<ol>
<li>Fyll 190 μL av flytende kultur medium inn i hver brønn av en 8-brønn kamret mikro-Slide.</li>
		<li>Tilsett 10 μL av en 1 x 107 celler/ml spore løsning (utarbeidet i trinn 1.4.1-1.4.3) og bland ved forsiktig pipettering opp-og-ned et par ganger. Det resulterende totale antall celler er 1 x 105 per brønn.</li>
		<li>Ruge den eksperimentelle kulturen i henhold til utviklingsfasen ment å bli undersøkt. For eksempel, Wild type T. atroviride krever 5-6 h ved 25 ° c i mørket for å utvikle conidial germlings i potet druesukker BULJONG (pdb), mens den ville typen N. crassa utvikler conidial germlings etter 3-4 h av Inkubasjons ved 30 ° c i mørket i flytende VMM.</li>
	</ol></li>
</ol>2. utarbeidelse av Dye arbeider løsninger
<ol><li>For å garantere full løselighet av hver fargestoff, forberede 2 mM lager løsninger i dimethyl sulfoxide (DMSO) ved å legge til riktig mengde (se nøyaktige vekter i tabell 1) til 1 ml 100% DMSO og bland godt av virvlingen. FORSIKTIG: Sørg for å ta DMSO fra en septum-forseglet flaske; Det bør være en klar gjennomsiktig væske. Ved kontakt med luft, blir DMSO brun-sannsynligvis på grunn av oksidasjon av spor urenheter-og kan negativt påvirke cellevekst eller fargestoff flekker.</li>
	<li>Filteret sterilisere lager løsningen gjennom et sprøyte membran filter på 0,2 μm til en frisk, steril 1,5 mL reaksjons slange. For å minimere fargestoff bleking, Pakk røret i aluminiumsfolie. Merk: fargestoff lager løsningen kan aliquoted i mindre volumer for å unngå tine/fryse sykluser, og oppbevares ved 4 ° c i flere måneder.</li>
	<li>Klargjør en væske arbeids løsning på 20 μM ved oppløsning av 2 μL farge lager oppløsning i 198 μL av sterilt destillert vann i et friskt, sterilt 1,5 mL reaksjons rør. For å minimere fargestoff bleking, Pakk røret i aluminiumsfolie. Merk: Dye arbeider løsning bør tilberedes fersk på dagen av eksperimentet.</li>
	<li>Under prøve montering (se pkt. 3) vil farge arbeids løsningen bli Standardly fortynnet 1:10, noe som resulterer i en endelig farge konsentrasjon på 2 μM og 0,1% w/v endelig DMSO-konsentrasjon. Merk: valg av ulike fortynning faktorer ved å endre Volumforholdet mellom Dye arbeider løsning og montering væske, gjør det mulig å enkelt tilpasse den ønskede endelige fargestoff konsentrasjon. FORSIKTIG: for å unngå uønskede effekter på grunn av fargestoff eller DMSO-toksisitet, bør fortynningsfaktoren ikke falle under 1:4 for å oppnå maksimale endelige konsentrasjoner av 5 μM fargestoff og 0,4% w/v DMSO. Høyere fargestoff konsentrasjoner vil raskt mette systemet og forhindre pålitelig signal kvantifisering, mens mer enn 0,5% w/v (≥ 62,5 mM) DMSO kan svekke celle utvikling38.</li>
</ol>3. prøve forberedelser for mikroskopi
<ol><li>Mount prøver fra fungal kolonier (trinn 1,2) eller solid germling kulturer (trinn 1,3) av invertert agar blokken metoden.<ol>
<li>Hold en ren 24 mm x 60 mm glass deksel slip (#1 = 0.13-0.16 mm tykkelse) klar og tilsett 18 μL av flytende minimal medium (VMM eller M9) eller fysiologisk saltløsning på midten.</li>
		<li>Tilsett 2 μL av farge løsningen 20 μM med 18 μL væske og bland godt ved å pipettering opp og ned flere ganger, samtidig som man unngår produksjon av luftbobler. Merk: Når du arbeider med flere prøver, er det tilrådelig å forberede en mester blanding av væske-Dye løsning for alle for å sikre lik fargestoff konsentrasjon gjennom eksperimentet.</li>
		<li>Med en ren skalpell, Skjær ut en 15 mm x 15 mm prøve fra periferien av kolonien eller solid germling kultur og plassere den vertikalt ved siden av medium drop på dekselet slip.</li>
		<li>Ved hjelp av skalpell for å støtte den øvre kanten av blokken og en finger for å holde baksiden av blokken på plass, sakte senke siden bærer mycel eller germlings på væsken. Prøven er nå klar for overføring til mikroskop fasen. FORSIKTIG: det er viktig å gjøre dette langsomt og svært forsiktig for å minimere mekanisk belastning på cellene og for å unngå luftbobler blir fanget mellom prøve og cover slip.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monter væsken germling kulturer fra trinn 1,4. Merk: de fleste praktisk, flytende germling kulturer i kamret mikro-brønn lysbilder kan overføres direkte og videre manipuleres på mikroskopet scenen.<ol>
<li>Tilsett 22 μL av farge arbeider løsning til 200 μL av flytende medium for å resultere i standard endelige konsentrasjoner av 2 μM fargestoff og 0,1% w/v DMSO. Merk: flytende germling kulturer har den store fordelen at fluorescerende fargestoffer (eller andre kjemikalier, slik som hemmere) kan legges til et hvilket som helst ønsket tidspunkt av eksperimentet, også under innspillingen. I så fall må spesiell forsiktighet tas for å administrere væsken synker svært langsomt for å ikke forstyrre cellene. System vibrasjoner og Brownske bevegelse kan allerede innføre noen celle bevegelse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. live-celle mikroskopi
<ol><li>Juster de grunnleggende innstillingene for bilde anskaffelse. Følgende bilde anskaffelses innstillinger gjør det mulig å fange opp farge dynamikk i individuelle hyfer og gjelder for begge de følgende analysene:<ol>
<li>Påfør 5 – 10% laser effekt på 20% av den fulle utgangseffekten på enheten.</li>
		<li>Bruk en plan Apo 60x-63x glyserol eller vann nedsenking mål med en høy numerisk blenderåpning ≥ 1,2.</li>
		<li>Begrens bilde anskaffelses området til omrisset av hyfer ved å angi en bildestørrelse på 1024 x 256 piksler og ved å bruke en optisk zoomfaktor på 2 – 3.</li>
		<li>Bruk toveis skanning med 400 Hz. Juster pinhole størrelse til 1 luftig enhet.</li>
		<li>Sett gevinsten av de mest følsomme detektoren til 100%.</li>
		<li>For tids runder innspilling, start image oppkjøpet med ett bilde hver 15 s for å tillate rimelig Temporal oppløsning uten å produsere fargestoff bleking eller Foto stress.</li>
		<li>For 3D-opptak setter du øvre og nedre romlig grense til grensen av hyfer og plass optiske seksjoner 1 μm fra hverandre for å gi rimelig romlig oppløsning. Merk: på grunn av den raske veksten av hyfer, har høy romlig oppløsning i Z-aksen ofte blitt ofret for høy Temporal oppløsning i X/Y-aksen eller den andre veien rundt. Bare svært moderne konfokalmikroskopi laserskanning mikroskop er raske nok til å tilfredsstille begge krav.</li>
	</ol></li>
	<li>Endocytose opptak analyser<ol>
<li>Rådfør deg med figur 1 og tabell 1 for å finne de beste eksitasjon/utslipps innstillingene for FM 1-43 og/eller FM 4-64 som er tilgjengelig på mikroskopi systemet, og juster deretter. Merk: med den anbefalte 2 μM konsentrasjon, innlemmelse av FM fargestoff i plasma membranen er Instant i normale friske celler. Hele prosessen fra første plasma membran farging til fargestoff utseende i rørformede vakuoler er vanligvis ferdig innen 30-45 min ved romtemperatur. Øke FM farge konsentrasjon øker S/N-ratio og dermed produserer høyere kontrast bilder raskere. Imidlertid, den likeledes setter fart i opp merkingen forarbeide gjør den flere vanskelig å skille ut det kronologisk rad av organelle flekk.</li>
		<li>Start bildeopptak ved hjelp av ovennevnte anbefalte grunnleggende bilde anskaffelses innstillinger og evaluere resultatene.</li>
		<li>Optimaliser innstillingene for bildeinnhenting til den romlige og timelige oppløsningen som kreves for å fange opp aspektet ved plasma membranen eller den endocytose dynamikken eksperimentet er fokusert på.</li>
		<li>For eksempel, for å fange svært rask dynamikk i X/Y, redusere den generelle bildestørrelsen, bildet bare ett fokal plan og øke skanningen hastigheten til 1 FPS. Hvis du vil ha høyere oppløsning i Z-aksen, reduserer du oppløsningen i X/Y, reduserer bildestørrelsen og reduserer avstanden mellom optiske inndelinger til 0,5 μm.</li>
	</ol></li>
	<li>Dynamikk for cellevegg<ol>
<li>Rådfør deg med Figur 4 og tabell 1 for å finne de beste eksitasjon/utslipps innstillingene for brukt cellevegg fargestoff som er tilgjengelig på mikroskopi systemet og juster deretter. Merk: på grunn av deres brede utslipp Spectra, CFW og SPF er ikke godt egnet for samtidig co-Imaging med andre fluorophores, overveiende GFP. Noen restriksjoner gjelder også for sekvensiell bildebehandling tilnærminger med disse fargestoffer, og dermed må optimaliseres individuelt.</li>
		<li>Start bildeopptak ved hjelp av ovennevnte anbefalte grunnleggende bilde anskaffelses innstillinger og evaluere resultatene. Merk: med den anbefalte 2 μM konsentrasjon, inkorporering av fargestoff inn i celle veggen er ikke nødvendigvis umiddelbar, men rimelig rask. Hele prosessen med septum formasjon, for eksempel, tar i gjennomsnitt ca 5-7 min ved romtemperatur20. Øke celle veggen fargestoff konsentrasjon øker S/N-ratio og dermed produserer høyere kontrast bilder raskere. Men det også raskt introduserer gjenstander på grunn av indusert celle veggen skade reparasjon.</li>
		<li>Optimaliser bilde anskaffelses innstillingene til den romlige og timelige oppløsningen som kreves for å fange opp aspektet ved cellevegg morphogenesis eksperimentet er fokusert på, som beskrevet i punkt 4.2.3.</li>
	</ol></li>
</ol>

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser og ingenting å avsløre.

Denne artikkelen fortsetter banebrytende arbeid som etablerte bruk av ulike fluorescerende fargestoffer som vitale organelle markører for trådformede sopp i begynnelsen av 2000-tallet2,4,43, og forsøker å diskutere photophysical og celle biologiske egenskaper FM fargestoffer og valgt cellevegg fargestoffer i større detalj enn før. Spesielt med hensyn til uønskede cellulære effekter, slik som membran metning eller cellevegg skade, som oppstår over visse farge konsentrasjoner. Det som tidligere har blitt betraktet som ikke-giftig på cellenivå er nå betraktet som giftig på molekylnivå. Selv om disse effektene kan være svært subtile og ikke direkte tydelig av åpenbare endringer i organelle eller celle atferd, alle mulige forstyrrelser av Dye anvendelse enn visualisering må minimeres for etterforskningen av innfødte molekylær funksjon. Heldigvis, forbedret følsomhet og Quantum effektivitet av moderne detektorer, slik som silisium skred PHOTODIODE detektorer (si-APD)44 eller Airyscan området detektor45, lette bruken av enda lavere Dye mengder enn før. Et annet viktig mål for artikkelen er å eksempler på co-Imaging egenskaper av disse fargestoffer med andre fluorophores, viktigst, de av GFP som mest brukte fluorescerende protein i biologi. Dette skal hjelpe utformingen av Imaging eksperimenter som tar sikte på å relatere den subcellulære lokalisering dynamikken i fluorescerende Fusion proteiner til de av fungal celle veggen, plasma membranen eller Endo-og exocytosis veien etc.
Imaging under naturlige og stressfrie forhold er nøkkelen for erverv av pålitelige data. Noen praktiske hensyn vedrørende kultur medium og prøve utarbeidelse sikte på å gi et utgangspunkt for å finne de optimale forhold som tillater gjenstand-fri, lang tid observasjon av sunne, trykklette celler med høyest S/N-ratio mulig for en gitt prøve. Det er ingen universell måte å oppnå pålitelige og meningsfulle Imaging resultater. Det er iboende den tilnærmingen som biologisk variasjon av prøven, subjektivitet og forventningene til microscopist, samt bilde etterbehandling har betydelig innflytelse på datainnsamling og tolkning, henholdsvis. Derfor, den praktiske opplevelsen av microscopist, hennes/hans intime kunnskap om cellen biologi av soppen under etterforskning, samt dyktige prøve forberedelser for å skape forhold som "naturlige" og uforstyrret som mulig i en lab innstilling, er avgjørende for å anskaffe og evaluere bildedata som sannferdig reflekterer studert cellulære fenomener. Som en tommelfingerregel, forekomsten av uønskede bivirkninger av fluorescerende fargestoffer, alt fra den subtile og dermed ikke åpenbart synlig aktivering av plasma membran eller celle veggen re-modellering stress respons trasé til enkel cytotoksisk induksjon av celle autolyse, kan bare være sikkert forhindret ved å bruke lave farge konsentrasjoner ≤ 2 μM.
Anvendelsen av fluorescerende fargestoffer er enkel, men deres særegenheter er dårlig karakterisert. En viktig styrke ved å bruke fluorescerende fargestoffer er preparativ enkelhet av eksperimentelle protokoller. Dyrking og prøvetaking av soppen, tilsetning av fargestoff (er), og montering på mikroskopet scenen er (med praksis) grei. Justering av de grunnleggende bildeinnstillingene, inkludert eksitasjon og utslipps bølgelengder, eksponeringstider, tids kurs innstillinger etc., følger enkle Biofysiske regler for mikroskopet og biologiske regler for de brukte fluorescerende fargestoffer inne i cellene. Tabell 1 har til hensikt å støtte identifisering av de mest egnede fargestoff eller fargestoff kombinasjon for eksperimentering. Videre er fluorescerende fargestoffer rimelig priset, lett tilgjengelig med pålitelig høy kvalitet og dermed sikre svært reproduserbar søknad.
To store restriksjoner for å bruke membran eller celle veggen selektive fluorescerende fargestoffer er (ofte) begrenset kunnskap om deres presise flekker egenskaper, som i de fleste tilfeller er ikke-spesifikke på organelle og molekylær nivå, og deres konsentrasjon-avhengige uønskede bivirkninger. FM fargestoffer er spesifikke for lipid bilayers deltar i Endo-og exocytosis. Men presist som subcellulære organeller blir suksessivt merket under testet forholdene er ikke umiddelbart tydelig og krever sammenligning av ulike FM fargestoff varianter, og co-merking med ekstra organelle-spesifikke markører. Preferansen for FM 1-43 for mitokondrie membraner, i forhold til FM 4-64, er ett eksempel. Cell Wall selektive fargestoffer vise varierende spesifisitet for de tre store polymerer av fungal celle veggen. CFW antas å være en ikke-spesifikk flekk for β-betaglukaner og kitin, er SPF antas å være mest selektiv for β-1, 4-betaglukaner, og CR antas å være svært selektiv for α-og β-chitins. Informasjon om bindende spesifisitet av PFS til sopp cellevegg polysakkarider er for øyeblikket ikke tilgjengelig. I hvilket forhold som fungal celle veggen polymer er mest effektivt merket på en gitt fargestoff konsentrasjon i fungal arter under etterforskning er ikke lett besvart, og anvendelsen av detaljerte målinger ervervet in vitro eller in vivo i andre organismer eller andre fungal arter må vurderes svært nøye. Dessverre er denne informasjonen sparsom og svært spredt i litteraturen35,42,46. Nyere poster som ville følge på tidligere studier33 å gi ny innsikt i den presise flekker egenskapene til kjennetegnet fargestoffer spesielt i sopp er for øyeblikket ikke tilgjengelig.
Imaging-kontroller er avgjørende for å evaluere farge mønstre og cellulære responser nøyaktig. Sannsynligvis den mest utfordrende delen, er imidlertid å vite cellen biologi av soppen så godt at de registrerte endringene i subcellulære lokalisering av membran og celle veggen selektive fluorescerende fargestoffer, endringer i cellulær arkitektur eller hyphal vekstmønster kan eksklusivt og trygt være relatert til den tiltenkte effekten av eksperimentell behandling. For dette er det avgjørende å ha gode kontroller sammen med alle nye Live-celle Imaging eksperiment. Disse inkluderer ubehandlet vill type som negativ bildebehandling kontroll for å utelukke bakgrunnen autofluorescence og detektor støy fra ervervet bildet, og å ha en morfologiske komparator når du arbeider med mutanter. Videre, en positiv bildebehandling kontroll, for eksempel en stamme som uttrykker GFP eller RFP i cytoplasma eller en annen velkjent fluorescerende markør protein, er viktig å sette eksitasjon lys intensiteten til den nødvendige minimum og har en celle vitalitet kontroll. Når disse kontrollene er satt, bruk av fluorescerende fargestoffer er ikke begrenset til visualisering oppgaver bare, men deres konsentrasjon-avhengige flekker dynamikk, samt konsentrasjon-avhengige bivirkninger kan være analytisk utnyttet; for eksempel, for kvantitativt overvåking celle veggen biosyntesen i sanntid eller for identifisering av mutant-spesifikke fenotyper i mottakelighet analysene47.
Forbedret fremtidige programmer er avhengig av en detaljert funksjonell analyse av fargestoff flekker egenskaper. En stor pågående utfordring er å ytterligere forbedre og automatisere kvantitative bildeanalyser for å fremme funksjonell evaluering av subcellulære dynamikk av membran og celle veggen selektive fluorescerende fargestoffer i trådformede sopp. For denne, omfattende, kvantitative co-lokalisering studier av disse fargestoffer med kjente organelle og celle veggen polymer markører i kombinasjon med mutant stammer mangelfull i bestemte transportveier eller som mangler spesifikke strukturelle komponenter er først nødvendig. Flere endocytose markører for sammenlignende analyser med fm fargestoffer er tilgjengelig48,49, og med hensyn til fortsatt dårlig karakterisert bindende særegenheter av celle veggen fargestoffer i sopp, anvendelsen av fluorescensmerkete-merket Glukan-spesifikke antistoffer50 kan gi en mulighet til å løse dette problemet.

Tjue år siden, den måten som hyphal morphogenesis og den underliggende molekylære cellebiologi kan være i form av trådformede sopp ble revolusjonert ved anvendelse av membranen selektive fluorescerende "fei Mao Dye FM 4-641." Senere, til fordel for kitin-binding Dye Calcofluor White som Vital fluorescerende markør av fungal celle veggen dynamikk ble realisert2. Siden da har både fargestoffer og varianter derav blitt en iboende del av Live-celle Imaging analyser av organelle dynamikk i sopp, og fortsette å gi enestående innsikt i trådformede fungal livsstil. Dette papiret detaljer anvendelsen av etablerte og mindre kjente fluorescerende fargestoffer for sporing av plasma membran dynamikk, Endo-og exocytosis og cellevegg morphogenesis i trådformede sopp. Endocytose sporing analyser tillate ulike celle biologiske spørsmål knyttet til den generelle studien av endocytose skal håndteres3. For dette, lokalisering, hastighet og rekken av fargede rom på FM fargestoff tillegg er registrert av tid forfalle mikroskopi og kvantitativt sammenlignet mellom testet fungal stammer4. Cell Wall fargestoffer avgrense den ytre grensen av cellen og tillate sporing av Morfogenetiske hendelser, inkludert polarisert hyphal tips vekst2, hyphal forgrening5, hyphal Fusion6,7 og septum formasjon8. Videre Letter de kvantifisering av lokaliserte cellevegg deponering og identifisering av defekter under celle veggen kognitiv9. Fordi detaljert kunnskap om biokjemiske og Biofysiske egenskaper av noen fluorescerende markør er en grunnleggende forutsetning for sin vellykkede in vivo program, disse egenskapene er først oppsummert for de seks fargestoffer omtalt i denne artikkelen.
Membran selektive fargestoffer FM (fei Mao) styryl fargestoffer er små amfifile molekyler som ikke kan passere gjennom, men reverserbart forbinder med den ytre pakningsvedlegget til lipid bilayer av biologiske membraner10. De er praktisk talt ikke-fluorescerende i vandig løsning, men blir intenst fluorescerende på plasma membran integrering, genererer utmerket signal-til-støy (S/N)-prosenter11. Disse egenskapene gjør dem ideelt egnet for visualisering av plasma membran og intracellulære organelle dynamikk, inkludert sporing av Endo-og exocytosis12. Grønn-fluorescerende FM 1-43 og rød-fluorescerende FM 4-64 er de to mest brukte fluorescerende membran markører for disse formålene. SynaptoGreen C4 og SynaptoRed C2 er generiske molekyler fra alternative leverandører som kan brukes om hverandre i stedet for FM 1-43 og FM 4-64, henholdsvis.
Styryl fargestoffer består av tre viktige strukturelle områder: (1) den lipofile halen som forenkler innsetting av fargestoffet i lipid bilayer, (2) fluoroforen kjerne som bestemmer Spectral egenskapene til fargestoffet og er konstituert av to aromatiske ringer koblet sammen med en til tre doble obligasjoner, og (3) positivt ladet hydrofile hode som hindrer fullstendig innsetting og gjennomtrengning av fargestoff gjennom membranen (figur 1a).
Jo lenger den lipofile halen, jo høyere er fargestoffet er hydrofobisiteten og dermed bindende affinitet til membranen, men den nedre er dens vannløselighet og membran de-flekker rate. Følgelig, forskjellige FM fargevarianter produserer ulike flekker dynamikk og mønstre. Den høyere hydrofobisiteten til den C4-ensidige FM-1-43 gir et sterkere og mer stabilt fluorescens signal ved plasma membraner og interne organeller raskere enn den korteste C2 FM-4-64, når den påføres ved ekvimolare konsentrasjoner (figur 2).
Viktigere, den konstante og høye foreningen/dissosiasjon priser på både FM fargestoffer11 med gjennomsnittlig oppbevaringstid på 1-6 s per individuelle fargestoff molekyl13 Reduser sjansene for lokaliserte avbrudd av membran funksjon, for eksempel gjennom modifisering av membran flytende eller tvunget permanent interaksjon av membran proteiner. Dette er trolig den viktigste grunnen til at disse molekylene kan brukes som vitale fargestoffer. Likevel, FM Dye konsentrasjoner over 50 μm er giftig for sopp og planteceller2,14, og bevis fra by-2 tobakk protoplasts indikerer at mer enn 20 μM FM fargestoff føre til plasma membran metning14. Derfor er det ikke tilrådelig å overskride denne grensen, spesielt på grunn av det faktum at utmerket bildebehandling er oppnådd med så lite som 2 – 5 μM15,16.
Spesielt er de Spectral egenskapene til FM fargestoffer varierer sterkt avhengig av den spesielle membran mikromiljøet (gjennomgått14). Generelt, eksitasjon og utslipp Spectra av FM fargestoffer i ren løsningsmiddel løsninger (som vanligvis gitt i produktinformasjonen) avvike betydelig fra det i cellulære miljøer og kan, i de fleste tilfeller, ikke direkte konsulteres for å velge Live-Cell Imaging innstillinger. Den eksitasjon/utslipp Maxima av FM 1-43 og FM 4-64, for eksempel, blir blå-forskjøvet med 37/46 NM og 43/64 NM, henholdsvis når bundet til fungal membraner i forhold til sine løsninger i metanol (tabell 1).
Den banebrytende Fundamentals for bruk av FM 4-64 og FM 1-43 for sporing av plasma membran, Endo-/exocytosis og organelle dynamikk, inkludert Spitzenkörper og mitokondrier, har allerede blitt grundig dokumentert for et bredt spekter av trådformede fungal arter tidligere2,4,17,18,19. Anbefalte bildeinnstillinger for både FM fargestoffer som fungerer i ulike trådformede sopp arter er avbildet i figur 1B. Tekniske begrensninger av tilgjengelig utstyr eller spesielle cellulære og eksperimentelle forhold, som for eksempel kultur medium, pH eller temperatur, kan imidlertid kreve noen tilpasninger. Heldigvis, FM fargestoffer operere over et bredt Spectral Range, og svært god tenkelig resultater oppnås ved spennende FM 1-43 med 514 NM eller FM 4-64 med 488 NM. De optimale bildeinnstillingene må derfor fastsettes individuelt for hver prøve type og tiltenkte bruk.
Den betydelige Stoke ' s Skift av mer enn 135 NM i FM 4-64 gir utmerket, samtidig co-Imaging med fluorophores emitting grønt lys; Dette er ofte utnyttet for å evaluere intracellulære lokalisering dynamikk av grønne fluorescerende protein (GFP)-merket Fusion proteiner i forhold til plasma membranen og endocytic Pathway9,20.
Cell vegg-selektive fargestoffer Calcofluor White M2R (CFW), også markedsført som fluorescerende Brightener 28, er sannsynligvis den mest kjente fluorescerende fargestoff som brukes til å flekk celleveggene av bakterier, sopp, alger, høyere planter og insekter. Opprinnelig brukt som optisk Whitening agent i papir, tekstil og vaskemiddel industrien, sine fordeler for den kliniske diagnosen fungal infeksjoner ble realisert tidlig på21,22. Fordi CFW Hesiod irreversibelt inn i begynnende kitin kjeden det forstyrrer normal kitin microfibril forsamlingen under celle veggen kognitiv dermed generere celle veggen stress23. Dette i sin tur utløser en cellevegg skade reparasjon mekanisme som fører til lokalt forsterket celle veggen avsetning som følge av Glukan og kitin syntase aktivisering24,25. Dette fenomenet kan oppstå med noen fargestoff som opererer ved stabilt binding til celle veggen polymerer, er konsentrasjon-avhengig og er mest merkbar på hyphal tips som representerer de mest produktive voksende og dermed mest følsomme deler av mycel (Figur 3). En omfattende oppsummering av molekylær maskineri som reagerer på cellevegg skade har nylig blitt gitt26.
Overdose fargestoff i kombinasjon med Phototoksisitet kan føre til rask cellelyse av hyphal rom (film 1). Likevel, økt følsomhet for fargestoff konsentrasjoner som er "vitale" i den ville typen kan utnyttes til å identifisere defekter i cellevegg biosyntesen av gen tap-av-funksjon mutanter9. For CFW og Kongo rød (CR), en annen tekstil fargestoff også kjent som direkte rød 28 og ansatt som α-og β-kitin-spesifikk cellevegg flekk for sopp og insekter27,28, terskel konsentrasjoner som sterkt induserer kitin synthases har blitt bestemt med > 60 μM CFW og > 70 μM CR, henholdsvis mens konsentrasjoner <15 μM av enten fargestoff ikke endre eller hemme soppvekst29,30,31. Hickey et al. plasserte denne terskel konsentrasjonen for CFW ved 25 μM2. Derfor er det tilrådelig å bruke farge konsentrasjoner ≤ 5 μM til å ekskludere stress relaterte gjenstander og sikre bruk av disse molekylene som virkelig "vitale fluorescerende fargestoffer"2,32. Dette gjelder like Solophenyl Flavine 7GFE 500 (SPF) og Pontamine fast Scarlet 4B (PFS), synonymt med direkte Yellow 86 og Direct Red 23, henholdsvis to andre nyttige celle veggen fargestoffer som søknad om sopp har blitt rapportert for første gang mer enn et ti år siden33. Men til tross for deres bemerkelsesverdige Spectral egenskaper34,35, har bruken av begge fargestoffer siden da vært svært begrenset36,37. Som tidligere vist for 1,5 μM CFW2, 2 μM SPF er tilstrekkelig til å løse celle veggen dynamikk under native forhold med svært høy Temporal oppløsning (film 2). De samme resultatene kan fås med 2 μM CR eller PFS.
Sammen utgjør disse fire fargestoffer, CFW, SPF, PFS og CR, et sett med cellevegg-selektive fluorescerende markører som dekker nesten hele det synlige utslipps lyset spektrum (400 – 700 NM) benyttet på moderne fluorescerende mikroskop (Figur 4). Den betydelige økningen i fluorescens intensitet ved binding til Cell Wall polymerer er iboende til alle fire og genererer gode S/N-prosenter. Dette i sin tur tillater å holde fargestoff konsentrasjoner og eksitasjon lys intensitet svært lav og gjør det mulig å utføre celle veggen flekker som "lav dose" Live-celle Imaging teknikk2. Fordi disse cellevegg fargestoffer er plasma membran ugjennomtrengelig, de samtidig fungere som levende/døde flekker. Spesielt på grunn av deres ekstremt brede utslipps lys Spectra, noen begrensninger om co-Imaging egenskaper av CFW og SPF med andre fluorophores må nøye vurderes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BRAND cell counting chamber</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR718005</td>
			<td>Thoma format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White M2R</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3543</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td>water immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td>water immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo Red</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6277</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>8,36,73,230</td>
			<td>organic solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 1-43</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6814</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6689</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>Rettberg</td>
			<td>1340691030</td>
			<td>3 mm glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BB02400600A113MNT0</td>
			<td>24 x 60 # 1 glass cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506353</td>
			<td>glycerol immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 Meta</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Minimal Medium</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td>generic fungal growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-slide 8-well</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>ibiTreat #1.5 polymer coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>polyester filtration material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>8,21,472</td>
			<td>92 x 16 mm culture dish w/o cams</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td>transparent gelling agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440762-9904-000</td>
			<td>oil immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pontamine Fast Scarlet 4B</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>212490</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>213400</td>
			<td>fungal growth medium for T. atroviride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Broth (PDB)</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>254920</td>
			<td>fungal growth medium for T. atroviride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706</td>
			<td>1.5 mL SafeSeal tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>5518016</td>
			<td>Cutfix sterile scalpel #23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>6,25,54,502</td>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solophenyl Flavine 7GFE 500</td>
			<td>CIBA</td>
			<td>1485385V6</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynaptoGreen C4</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>70020</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynaptoRed C2</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>70021</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe membrane filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>723-9945</td>
			<td>0.45 &#181;m SFCA syringe filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td>Leica</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vogel&#39;s Minimal Medium (VMM)</td>
			<td>FGSC</td>
			<td>Fungal Genetics Stock Centre</td>
			<td>fungal growth medium for N. crassa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging of filamentous fungi

Anvendelsen av membran og celle veggen selektive fluorescerende fargestoffer for Live-celle Imaging analyser av organelle dynamikk i fungal celler startet to ti år siden, og siden da fortsetter å bidra sterkt til vår forståelse av trådformede fungal Livsstil. Dette papiret gir en praktisk guide for utnyttelse av de to membran fargestoffer FM 1-43 og FM 4-64 og de fire celle veggen flekker Calcofluor White M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine fast Scarlet 48 og Kongo Red. Fokuset er på deres lave dose anvendelse for å konstatere en gjenstand-fri farging, deres co-Imaging egenskaper, og deres kvantitative evaluering. De presenterte metodene gjelder for alle trådformede sopp prøver som kan tilberedes på de beskrevne måter. De grunnleggende flekker tilnærminger kan tjene som utgangspunkt for tilpasninger til arter som kan kreve ulike dyrking forhold. Først, Biofysiske og biokjemiske egenskaper er vurdert som deres forståelse er avgjørende for å bruke disse fargestoffer som virkelig vitale fluorescerende flekker. Dernest er trinn-for-trinn protokoller presenteres som detalj utarbeidelse av ulike fungal prøvetyper for fluorescerende Live-celle Imaging. Til slutt illustrerer eksempel eksperimenter ulike tilnærminger til: (1) identifisere defekter i den spatio organiseringen av endocytose i genetisk mutanter, (2) forholdsvis karakterisere delte og distinkte co-lokalisering av GFP-merket mål proteiner i endocytic veien, (3) identifisere Morfogenetiske cellevegg defekter i en genetisk mutant, og (4) overvåke celle veggen kognitiv i sanntid.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi at JoVE.com

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

Vital fluorescerende fargestoffer er viktige verktøy for Live-celle Imaging analyser i moderne fungal cellebiologi. Dette papiret detaljer anvendelsen av etablerte og mindre kjente fluorescerende fargestoffer for sporing av plasma membran dynamikk, Endo-/exocytosis og cellevegg morphogenesis i trådformede sopp.

Anvendelse av membran og Cell Wall selektiv fluorescerende fargestoffer for Live-Cell Imaging av trådformede sopp

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

Membran og celleveggselektive fluorescerende fargestoffer er viktige verktøy for analyse av organelldynamikk og levende soppceller. Våre protokoller gir grunnleggende teoretisk bakgrunn og praktiske retningslinjer for anvendelse av et utvalg av disse fargestoffene som virkelig viktige flekker. Hovedpoenget for dette er å bruke svært lave fargekonsentrasjoner som ikke forårsaker cellulære artefakter relatert til metning eller fargetoksisitet, samtidig som det gir gode signal-til-støyforhold for høy kvalitet, langsiktig live celleavbildning.Med kolleger fra Institutt for nukleærmedisin ved det medisinske universitetet, brukte vi nylig disse fargingsteknikkene til å utvikle en ny tilnærming for bildestyrt diagnose av aapergillose. Evnen til å overvåke membran- og celleveggstrukturer i sanntid var avgjørende for å bestemme opptaksdynamikken til den eksperimentelle legemiddelforbindelsen. For å begynne denne prosedyren, først få en forberedt prekultur.Bruk en steril skalpell til å kutte en liten agarblokk som bærer ikke-sporulating mycelium fra kolonikanten av forkulturen. Plasser agarblokken i sentrum av en frisk, solid medium plate for å inokulere den eksperimentelle kulturen. Inkuber den eksperimentelle kulturen i henhold til utviklingsstadiet som skal inkueres.Prøveforberedelse er noe delikat og optimalisering av bildeanskaffelsesinnstillinger er ganske komplisert. Visuell demonstrasjon av begge prosedyrene ledsaget av verbal forklaring forenkler i stor grad replikbilitet. For å montere prøvene, hold et rent 24 med 60 millimeter glassdeksel slip klar og tilsett 18 mikroliter flytende minimalt medium eller fysiologisk saltløsning på midten.Tilsett to mikroliter av den tilberedte 20 mikromolarfargearbeidsløsningen til væsken i midten av dekselet slip og bland godt ved å pipetter opp og ned flere ganger samtidig som du unngår produksjon av luftbobler. Bruk en ren skalpell, kutt ut en 15 med 15 millimeter prøve fra periferien av kolonien og legg den vertikalt ved siden av medium dråpe på dekselet slip. Bruk skalpellen til å støtte den øvre kanten av blokken og en finger for å holde baksiden av blokken på plass.Senk deretter langsomt ned siden som bærer myceliumet på væsken. Monter den tilberedte prøven på mikroskopstadiet. Juster først de grunnleggende innstillingene for bildeanskaffelse for å registrere stående dynamikk i individuell hyphae som beskrevet i tekstprotokollen.For endocytosis-opptaksanalysene, se figur en og tabell en av tekstprotokollen for å identifisere de beste eksitasjons- og utslippsinnstillingene for FM 143 eller FM 464 som er tilgjengelige på mikroskopisystemet og justere disse innstillingene i systemet tilsvarende. Start bildeopptak ved hjelp av de tidligere justerte innstillingene og vurder resultatene. Deretter optimaliserer du bildeoppkjøpsinnstillingene til den romlige og timelige oppløsningen som kreves for å fange opp aspektet av plasmamembran eller endocytosedynamikk eksperimentet er fokusert på.For celleveggdynamikk, se figur fire og tabell en av tekstprotokollen for å identifisere de beste eksitasjons- og utslippsinnstillingene for det anvendte celleveggfargestoffet og justere innstillingene på mikroskopisystemet tilsvarende. Start bildeopptak ved hjelp av de tidligere justerte innstillingene og vurder resultatene. Deretter optimaliserer du bildeanskaffelsesinnstillingene til den romlige og timelige oppløsningen som kreves for å fange aspektet av celleveggmorfogenese eksperimentet er fokusert på.I tillegg til bare å visualisere cellulære prosesser, tillater levende celleavbildning utvinning av kvantitativ informasjon fra de registrerte dataene. I et eksempel på FM 464-opptaksanalysene dyrkes soppprøver som kolonier og monteres ved den inverterte agarblokkmetoden. Analysene identifiserte defekter i den spatio-temporale organiseringen av endocytose i gensletting og genoveruttrykkende mutanter av soppspesifikt protein SFP 2 av trichoderma atroviride.Eksempler på FM 464-kompleinering av fluorescerende fusjonsproteiner rettet mot endokytiske rom er vist her. Denne co-farging er ansatt for å relatere den subcellulære fordelingen av de to forbedrede grønne fluorescerende proteiner merket transmembrane proteiner, SFP 2 og GPR 1, til endokytisk vei i trichoderma atroviride. Et eksempel på FM 464 co-farging for identifisering av morfogenetiske forskjeller viser at denne co-farging tillater ytterligere relasjon av subcellulær lokalisering dynamikk av flourescently merket BUD-6 polarisme komplekst protein til slutten av noen menneskehandel-avhengige prosesser som dannelsen av septa og polarisert bindestrek tips vekst.Det karakteriserer også forskjeller i den subcellulære organisasjonen og bindestrekarkitekturen mellom vill type og muterte stammer av neurospora crassa. Representativ celleveggfarging viser at de ulike interaksjonsegenskapene til calcofluor hvit, solophenyl flavine og Kongo rød med celleveggpolymerer fremhever morfogenetiske forskjeller mellom deltaet SFP 2 mutant og den ville typen stamme av trichoderma atroviride. Å øke celleveggens stress påført av forhøyede fargekonsentrasjoner skjer raskere og er mer uttalt i mutanten sammenlignet med den ville typen.I tillegg tillater de samme bildene kvantifisering av morfogenetiske forskjeller om bindestrekdiameter og septalavstand mellom begge stammene. Representativ sanntidsovervåking av celleveggbiosyntese indikerer at den svært lave kalkorhvite konsentrasjonen forhindrer metning av celleveggen med fargemolekyler og tillater kvantitativ sanntidsovervåking av celleveggbiosyntese. Dette avslører at avsetningen av nytt celleveggmateriale ikke er ensartet, men reagerer svært raskt på lokaliserte fysiske påkjenninger som følge av den relative forskyvningen av en celle på celle-til-celle-vedlegg før dermalinfusjon i neurospora crassa.Mindre er mer. Bruk så lite fargestoff som mulig for å utelukke interferens av fluorescerende markør med cellulære prosesser. Etter denne prosedyren kunne melescence utvinning etter fotobleking eksperimenter utføres for å kvantifisere transport og biogenese kinetikk.Den banebrytende innføringen av membran og celleveggfarging i filamentøse sopp i begynnelsen av årtusenet revolusjonerte bokstavelig talt måten vi ser på sopp. Calcofluor hvit kan forårsake øyeirritasjoner og er en klassifisert cancerigen. Kongo rød er kreftfremkallende og teratogent, så vennligst bruk øye- og hudbeskyttelse når du håndterer disse fargestoffene.

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Leve Cell Imaging av Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intramikros for Imaging subcellulære strukturer i levende mus Uttrykke Fluorescent Proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G Protein-selektive GPCR conformations måles ved hjelp av FRET sensorer i en levende celle Suspension fluorometer analysen

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studerer Protein Quality Control System of<em&gt; D. discoideum</em&gt; Bruke Temperaturstyrt Live-Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Levende celle-bildebehandling av blodplategradering og sekresjon under strømning

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Superoppløsning live celleavbildning av subcellulære strukturer

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...