Name: application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging of filamentous fungi
Uploaded: 2019-11-28T15:00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi at JoVE.com

Os agradecimentos são devidos ao Fundo de Ciência Tirolês (TWF) para fornecer #256524 de subvenção para AL, para o Fundo de Ciência e Tecnologia de Viena (WWTF) para fornecer subvenção #LS13-086 para SZ, e para o Fundo de Publicação da Universidade de Innsbruck para apoiar a publicação de acesso aberto. Os autores também agradecem ao Departamento de Zoologia da Universidade de Innsbruck por fornecer o microscópio de varredura de laser confocal Leica TCS SP5 II.

1. Preparação de amostras de fungos
<ol><li>Pré-culturas fúngicas<ol>
<li>Inocular a tensão desejada em um meio de ágar sólido apropriado, como agar dextrose de batata (PDA) para o atroviride de Trichoderma ou o mínimo médio (VMM) de Vogel para neurospora crassa. Adicione um marcador de seleção apropriado ao trabalhar com cepas transformantes.</li>
		<li>Incubar a pré-cultura à temperatura ideal do organismo. Por exemplo, T. atroviride em 25 °C e N. crassa em 30 °C, e 12 h/12 h ciclos claros/escuros até que um micélio esporuulando se tornou mas ainda não alcançou a borda da placa. Em uma placa de Petri de tamanho padrão (9,2 cm Ø), isso leva o atroz t. do tipo selvagem em média de 4-6 dias, enquanto o n. crassa selvagem tipo atinge esta fase após 3-4 dias, em média.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultivo de colônias fúngicas<ol>
<li>Usando um bisturi estéril, corte um pequeno bloco de ágar de 3 mm x 3 mm que transportava micélio não-esporuantes da borda da colônia da pré-cultura.</li>
		<li>Coloque o bloco de ágar no centro de uma placa média sólida fresca para inocular a cultura experimental.</li>
		<li>Incubar a cultura experimental de acordo com o estágio de desenvolvimento destinado a ser investigado. Por exemplo, o atroviride T. do tipo selvagem requer 20-22 horas a 25 °C no escuro para desenvolver colônias de cerca de 2 cm de diâmetro no PDA, enquanto o selvagem-tipo N. crassa atinge diâmetros de colônia de cerca de 4 cm após 14-16 h de incubação em 30 °C no escuro em VMM. NOTA: A incubação no escuro impede a formação de pigmentos que possam introduzir a autofluorescência. A fim de eliminar a fluorescência de fundo médio da cultura experimental, substitua ágar por 1,5% w/v de um agente solidificante transparente (ver a Tabela de Materiais),e qualquer meio complexo com um meio mínimo definido.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultivo de culturas germantes sólidas<ol>
<li>Use 5 mL de solução fisiológica estéril de sal (0,9% w/v NaCl) para colher esporos de coniscarantes da placa pré-cultura e coletar a suspensão resultante do esporo em um tubo de tampa de rosca de 15 mL.</li>
		<li>Misture bem a suspensão poreso por vórtice vigoroso e, posteriormente, filtre-a sobre uma tira de 1 cm x 5 cm de tecido de filtro estéril (veja a Mesa de Materiais) levemente enfiada em uma ponta de pipeta de 1 mL (montada e autocllavada de antemão) em um tubo estéril fresco.</li>
		<li>Determine a densidade do esporo com uma câmara de contagem celular e prepare uma suspensão de esporos de 1 x 107 células/mL com solução fisiológica de sal. NOTA: A suspensão porosa pode ser mantida em 4 °C por até duas semanas.</li>
		<li>Prepare uma placa de Petri de tamanho padrão (9,2 cm Ø) com 20 mL de meio sólido e adicione 15-20 contas de vidro estéreis (3 mm Ø) em cima.</li>
		<li>Pipeta 200 μL da suspensão esporo na placa média e distribuir uniformemente as células em toda a placa por agitação suave. Coletar as contas de vidro em um copo com 70% de etanol para reutilização.</li>
		<li>Incubar a cultura experimental de acordo com o estágio de desenvolvimento destinado a ser investigado. Por exemplo, o tipo selvagem do atroviride de T. exige 5-6 h em 25 °C na obscuridade para desenvolver germlings conidial no PDA, visto que o tipo selvagem do crassa de N. desenvolve germlings conidial após 3-4 h da incubação em 30 °C na obscuridade em VMM. NOTA: A fim eliminar toda a fluorescência média do fundo da cultura experimental, substitua o ágar com o agar de 1.5% w/v de um agente solidifying transparente, e de todo o meio complexo com um meio mínimo definido.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultivo de culturas germantes líquidas<ol>
<li>Preencha 190 μL de meio de cultura líquida em cada poço de um micro-slide com câmara de 8 poços.</li>
		<li>Adicione 10 μL de uma solução de esporos de 1 x 107 células/mL (preparada nos passos 1.4.1-1.4.3) e misture suavemente tubulação para cima e para baixo algumas vezes. O número total resultante de células é de 1 x 105 por poço.</li>
		<li>Incubar a cultura experimental de acordo com o estágio de desenvolvimento destinado a ser investigado. Por exemplo, o tipo selvagem T. atroviride requer 5-6 h a 25 °C no escuro para desenvolver germlings conidial em caldo de dextrose de batata (PDB), enquanto o tipo selvagem N. crassa desenvolve germlings conidial após 3-4 h de incubação em 30 °C no escuro em VMM líquido.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação de soluções de trabalho de tinuosidade
<ol><li>Para garantir a solubilidade total de cada tintura, prepare soluções de estoque 2 mM em dimetil sulfoxide (DMSO), adicionando a quantidade adequada (ver pesos exatos na Tabela 1) a 1 mL de 100% DMSO e misture bem vórtice. CUIDADO: Certifique-se de tomar o DMSO de uma garrafa selada de septo; deve ser um líquido transparente claro. Após o contato com o ar, DMSO fica marrom, provavelmente devido à oxidação de impurezas traço - e pode afetar negativamente o crescimento celular ou coloração de corante.</li>
	<li>Filtro esterilizar a solução de estoque através de um filtro de membrana de seringa de 0,2 μm em um tubo de reação estéril fresco de 1,5 mL. Para minimizar o branqueamento de corantes, envolva o tubo em folha de alumínio. NOTA: A solução de estoque de tingelo pode ser alicitada em volumes menores para evitar ciclos de descongelamento/congelamento e mantida em 4 °C por vários meses.</li>
	<li>Prepare uma solução de trabalho de tine aquosa de 20 μM dissolvendo 2 μL de solução de estoque de tinuoso em 198 μL de água destilada estéril em um tubo de reação estéril fresco de 1,5 mL. Para minimizar o branqueamento de corantes, envolva o tubo em folha de alumínio. NOTA: A solução de trabalho do tintendência deve ser preparada recentemente no dia da experiência.</li>
	<li>Durante a montagem da amostra (ver seção 3), a solução de trabalho de tinuoso será diluída de forma padrão 1:10, resultando em uma concentração final de tine de 2 μM e 0,1% w/v concentração final do DMSO. NOTA: Escolher diferentes fatores de diluição simplesmente alterando a relação de volume entre a solução de trabalho de corante e o líquido de montagem, permite adaptar facilmente a concentração de corante final desejada. CUIDADO: Para evitar efeitos indesejados devido à tintura ou toxicidade DMSO, o fator de diluição não deve cair abaixo de 1:4 para resultar concentrações finais máximas de 5 μM corante e 0,4% w/v DMSO. Concentrações mais elevadas de tintura saturarão rapidamente o sistema e evitarão quantificação de sinal confiável, enquanto mais de 0,5% w/v (≥ 62,5 mM) DMSO pode prejudicar o desenvolvimento celular38.</li>
</ol>3. Preparação da amostra para a microscopia
<ol><li>Amostras da montagem das colônias fungosas (etapa 1.2) ou das culturas germling contínuas (etapa 1.3) pelo método invertido do bloco do ágar.<ol>
<li>Mantenha um deslizamento limpo da tampa de vidro de 24 mm x 60 mm (#1 = espessura de 0.13-0.16 mm) pronto e adicione 18 μL do meio mínimo líquido (VMM ou M9) ou da solução fisiológica do sal no centro.</li>
		<li>Adicione 2 μL da solução de trabalho de tine de 20 μM para os 18 μL de líquido e misture bem por pipetting cima e para baixo várias vezes, evitando a produção de bolhas de ar. NOTA: Ao trabalhar com várias amostras, é aconselhável preparar uma mistura mestra de solução de tinudura líquida para todos, a fim de garantir a concentração de tine igual durante todo o experimento.</li>
		<li>Com um bisturi limpo, corte uma amostra de 15 mm x 15 mm da periferia da colônia ou cultura de germe sólido e coloque-a verticalmente ao lado da queda média no deslizamento de cobertura.</li>
		<li>Usando o bisturi para suportar a borda superior do bloco e um dedo para segurar o lado traseiro do bloco no lugar, lentamente abaixe o lado carregando o micélio ou germes sobre o líquido. A amostra está agora pronta para transferência para o estágio do microscópio. CUIDADO: É essencial fazer isso lenta e com muito cuidado, a fim de minimizar o estresse mecânico nas células e evitar que as bolhas de ar sejam presas entre a amostra e a cobertura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monte as culturas germantes líquidas a partir do passo 1.4. NOTA: Mais convenientemente, culturas germantes líquidos em lâminas de micropoço com câmara podem ser diretamente transferidas e manipuladas ainda mais no estágio do microscópio.<ol>
<li>Adicione 22 μL de solução de trabalho de tinuoso a 200 μL de médio líquido para resultar em concentrações finais padrão de 2 μM tine e 0,1% w/v DMSO. NOTA: As culturas germantes líquidas têm a grande vantagem de que corantes fluorescentes (ou outros produtos químicos, como inibidores) podem ser adicionados em qualquer ponto de tempo desejado do experimento, também durante o registro. Nesse caso, é preciso tomar cuidados especiais para administrar as gotas líquidas muito lentamente, a fim de não perturbar as células. As vibrações do sistema e o movimento browniano já podem introduzir algum movimento celular.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Microscopia de células vivas
<ol><li>Ajuste as configurações básicas de aquisição de imagem. As seguintes configurações de aquisição de imagem permitem capturar a dinâmica de coloração em hífens individuais e são aplicáveis a ambos os seguintes ensaios<ol>
<li>Aplique 5-10% de potência laser de 20% da potência de saída total do dispositivo.</li>
		<li>Use um plano Apo 60x-63x glicerol ou objetivo de imersão de água com uma alta abertura numérica ≥ 1.2.</li>
		<li>Restrinja a área de aquisição de imagem ao contorno da pasta, definindo um tamanho de imagem de 1024 x 256 pixels e usando um fator de zoom óptico de 2-3.</li>
		<li>Use a varredura bidirecional com 400 Hz. Ajuste o tamanho do pinhole a 1 unidade airy.</li>
		<li>Definir o ganho do detector mais sensível para 100%.</li>
		<li>Para a gravação de voltas de tempo, iniciar a aquisição de imagem com um quadro a cada 15 s para permitir uma resolução temporal razoável, sem produzir corante branqueamento ou estresse fotográfico.</li>
		<li>Para a gravação 3D, ajuste o limite espacial superior e mais baixo ao limite das seções óticas da hifa e do espaço 1 μm distante para permitir a definição espacial razoável. NOTA: Devido ao rápido crescimento da pasta, alta resolução espacial no eixo Z tem sido muitas vezes sacrificada por alta resolução temporal no eixo X/Y ou o contrário. Somente os microscópios confocal muito modernos da exploração do laser são rápidos bastante satisfazer ambas as demandas.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaios de captação de endocitose<ol>
<li>Consulte a Figura 1 e a Tabela 1 para identificar as melhores configurações de excitação/emissão para FM 1-43 e/ou FM 4-64 disponíveis no sistema de microscopia e ajustar em conformidade. NOTA: Com a concentração recomendada de 2 μM, a incorporação de tinência DE FM na membrana plasmática é instantânea em células saudáveis normais. Todo o processo de coloração inicial da membrana plasmática até a aparência de corante em vacuoles tubulares geralmente é concluído dentro de 30-45 min à temperatura ambiente. Aumentar a concentração da tintendência de FM aumenta a relação S/N e, portanto, produz imagens de maior contraste mais rapidamente. No entanto, também acelera o processo de rotulagem, tornando mais difícil diferenciar a sucessão cronológica da coloração de organelas.</li>
		<li>Comece a gravação de imagem usando as configurações de aquisição básicas de imagem acima recomendadas e avalie os resultados.</li>
		<li>Otimizar as configurações de aquisição de imagem para a resolução espacial e temporal necessária para capturar o aspecto da membrana plasmática ou da dinâmica da endocitose em que o experimento está focado.</li>
		<li>Por exemplo, a fim de capturar dinâmicas muito rápidas em X/Y, diminuir o tamanho geral da imagem, imagem apenas um plano focal e aumentar a taxa de digitalização para 1 fps. Para maior resolução no eixo Z, diminua a resolução em X/Y, diminua o tamanho da imagem e diminua a distância entre seções ópticas para 0,5 μm.</li>
	</ol></li>
	<li>Dinâmica da parede celular<ol>
<li>Consulte a Figura 4 e a Tabela 1 para identificar as melhores configurações de excitação/emissão para o tintura de parede de celular aplicada disponível no sistema de microscopia e ajustar em conformidade. NOTA: Devido aos seus espectros de emissão ampla, CFW e FpS não são bem adequados para co-imagem simultânea com outros fluorofosforos, predominantemente GFP. Algumas restrições até se aplicam a abordagens sequenciais de imagem com esses corantes e, portanto, precisam ser otimizadas individualmente.</li>
		<li>Comece a gravação de imagem usando as configurações de aquisição básicas de imagem acima recomendadas e avalie os resultados. NOTA: Com a concentração recomendada de 2 μM, a incorporação de tinência na parede celular não é necessariamente instantânea, mas razoavelmente rápida. Todo o processo de formação de septo, por exemplo, leva em média cerca de 5-7 min à temperatura ambiente20. Aumentar a concentração da tintendência da parede celular aumenta a relação S/N e, portanto, produz imagens de maior contraste mais rapidamente. No entanto, ele também introduz rapidamente artefatos devido ao reparo induzido de danos na parede celular.</li>
		<li>Otimizar as configurações de aquisição de imagem para a resolução espacial e temporal necessária para capturar o aspecto da morgênese da parede celular em que o experimento está focado, conforme descrito na seção 4.2.3.</li>
	</ol></li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes e nada a divulgar.

Este artigo continua o trabalho inovador que estabeleceu o uso de vários corantes fluorescentes como marcadores vitais organela para fungos filamentosos no início dos anos 20002,4,43, e tenta discutir as propriedades fotofísicas e celulares biológicas de corantes FM e corantes de parede celular selecionados em maior detalhe do que antes. Especialmente no que diz respeito aos efeitos celulares indesejados, como a saturação da membrana ou danos na parede celular, que ocorrem acima de certas concentrações de corantes. O que anteriormente tem sido considerado não tóxico no nível celular é agora considerado tóxico no nível molecular. Mesmo que estes efeitos possam ser muito sutis e não diretamente evidentes por mudanças óbvias no comportamento organela ou celular, qualquer possível interferência da aplicação de tinativo que não seja a visualização tem que ser minimizada para a investigação da função molecular nativa. Felizmente, a sensibilidade melhorada e a eficiência quântica dos detectores modernos, como detectores de fotodiodo de avalanche de silício (Si-APDs)44 ou o detector de área airyscan45,facilitam o uso de quantidades de tintura ainda menores do que antes. Outro objetivo fundamental do artigo é exemplificar as propriedades de co-imagem desses corantes com outros fluorofosforos, mais importante, os da GFP como a proteína fluorescente mais utilizada na biologia. Isso deve ajudar o projeto de experimentos de imagem que visam correlacionar a dinâmica de localização subcelular de proteínas de fusão fluorescente com as da parede de células fúngicas, a membrana plasmática ou a via de endôtee e exocitose etc.
A imagem de imagem em condições naturais e livres de estresse é fundamental para a aquisição de dados confiáveis. Algumas considerações práticas em relação ao meio de cultura e preparação de amostras visam fornecer um ponto de partida para encontrar as condições ideais que permitem a observação de células saudáveis e espontícias com a maior relação S/N possível para qualquer amostra. Não há nenhuma maneira universal de alcançar resultados de imagem confiáveis e significativos. É inerente à abordagem que a variação biológica da amostra, subjetividade e expectativas do microscopista, bem como o processamento pós-imagem têm influência significativa na aquisição e interpretação de dados, respectivamente. Assim, a experiência prática do microscopista, seu conhecimento íntimo sobre a biologia celular do fungo investigação, bem como a preparação de amostras hábil para criar condições como natural e imperturbável possível em um ambiente de laboratório, são primordiais para adquirir e avaliar dados de imagem que refletem verdadeiramente os fenômenos celulares estudados. Como regra geral, a ocorrência de efeitos colaterais indesejados de corantes fluorescentes, que vão desde a ativação sutil e, portanto, não obviamente visível da membrana plasmática ou parede celular remodelando as vias de resposta ao estresse até a indução citotóxica direta da autolipise celular, só pode ser seguramente impedida aplicando baixas concentrações de corante ≤2 μM.
A aplicação de corantes fluorescentes é simples, mas suas especificidades são mal caracterizadas. Uma força chave do uso de corantes fluorescentes é a simplicidade preparae dos protocolos experimentais. O cultivo e a amostragem do fungo, a adição do tine (s), e a montagem no estágio do microscópio são (com prática) diretos. O ajuste das configurações básicas de imagem, incluindo excitação e comprimentos de onda de emissão, tempos de exposição, configurações de curso de tempo, etc., siga as regras biofísicas simples do microscópio e as regras biológicas dos corantes fluorescentes usados dentro das células. A tabela 1 pretende apoiar a identificação da combinação de tintura ou tintura mais adequada para experimentação. Além disso, os corantes fluorescentes têm preços razoáveis, prontamente disponíveis com alta qualidade confiável e, assim, garantem a plicação altamente reproduzível.
Duas limitações principais de usar a membrana ou as tinturas fluorescentes seletivas da parede de pilha são (frequentemente) conhecimento limitado de suas propriedades precisas da coloração, que na maioria dos casos são non-specific no organelle e no nível molecular, e seus efeitos secundários não desejados concentração-dependentes. Os corantes de FM são específicos para bilayers lipídicos que participam na endo- e exocitose. No entanto, precisamente quais organelas subcelulares se tornam sucessivamente rotulados as condições testadas não é imediatamente evidente e requer comparação de diferentes variantes de corante FM, e co-rotulagem com marcadores específicos de organela adicionais. A preferência de FM 1-43 para membranas mitocondriais, em comparação com FM 4-64, é um exemplo. As tinturas seletivas da parede de pilha indicam a especificidade de variação para os três polímeros principais da parede fungosa da pilha. CFW é pensado para ser uma mancha não específica para β-glucans e chitina, FpS é pensado para ser mais seletivo para β-1,4-glucans, e CR é pensado para ser altamente seletivo para α- e β-chitins. Atualmente, não estão disponíveis informações sobre a especificidade vinculativa da PFS para polisacarídeos de parede de células fúngicas. Para que razão qual polímero de parede de células fúngicas é mais efetivamente rotulado em uma determinada concentração de tinativo nas espécies fúngicas investigação não é facilmente respondida, e a aplicação de medições detalhadas adquiridas in vitro ou in vivo em outros organismos ou outras espécies fúngicas deve ser considerada com muito cuidado. Infelizmente, esta informação é escassa e altamente dispersa na literatura35,42,46. Registros mais recentes que se seguiriam em estudos anteriores33 para fornecer novos insights sobre as propriedades precisas de coloração dos corantes em destaque especificamente em fungos atualmente não estão disponíveis.
Os controles de imagem são essenciais para avaliar padrões de coloração e respostas celulares com precisão. Provavelmente a parte mais desafiadora, no entanto, é conhecer a biologia celular do fungo tão bem que as mudanças registradas na localização subcelular de corantes fluorescentes seletivos de membrana e parede celular, alterações na arquitetura celular ou no padrão de crescimento do hílogo podem estar relacionadas exclusivamente e com confiança aos efeitos pretendidos do tratamento experimental. Para isso, é crucial ter bons controles ao lado de qualquer novo experimento de imagem de células vivas. Estes incluem o tipo selvagem não tratado como controle de imagem negativo para excluir a autofluorescência de fundo e o ruído do detector da imagem adquirida, e ter um comparador morfológico ao trabalhar com mutantes. Além disso, um controle positivo de imagem, por exemplo, uma cepa que expressa GFP ou RFP no citoplasma ou outra proteína marcador fluorescente bem conhecida, é essencial para definir a intensidade da luz de excitação ao mínimo exigido e ter um controle de vitalidade celular. Uma vez que esses controles são definidos, o uso de corantes fluorescentes não se restringe apenas a tarefas de visualização, mas sua dinâmica de coloração dependente de concentração, bem como efeitos colaterais dependentes da concentração, pode ser explorada analiticamente; por exemplo, para monitorar quantitativamente a biossíntese da parede celular em tempo real ou para a identificação de fenótipos específicos de mutantes na suscetibilidade ensaios47.
Aplicações futuras melhoradas dependem de uma análise funcional detalhada de propriedades de coloração de coloração. Um grande desafio contínuo é melhorar ainda mais e automatizar análises quantitativas de imagem, a fim de avançar a avaliação funcional da dinâmica subcelular da membrana e da parede celular, corantes fluorescentes seletivos, fungos filamentosos. Para isso, extensos estudos de co-localização quantitativa desses corantes com marcadores conhecidos de organela e polímero de parede celular em combinação com cepas mutantes deficientes em vias de transporte particulares ou que carecem de componentes estruturais específicos são necessários. Vários marcadores de endocitose para análises comparativas com corantes FM estão disponíveis48,49,e com relação às especificidades de ligação ainda mal caracterizadas de corantes de parede celular em fungos, a aplicação de anticorpos específicos glucanos fluorescente-rotulados50 pode fornecer uma possibilidade de resolver esta questão.

Vinte anos atrás, a maneira pela qual a morgênese hipocificana e a biologia celular molecular subjacente poderiam ser visualizadas em fungos filamentosos foi revolucionada pela aplicação da membrana seletiva fluorescente Fei Mao dye FM 4-641. Mais tarde, o benefício da corante de ligação à quitina Calcofluor White como marcador fluorescente vital da dinâmica da parede celular fúngica foi realizado2. Desde então, tanto os corantes quanto as variantes dos mesmos tornaram-se uma parte inerente das análises de imagens de células vivas da dinâmica da organela em fungos e continuam a fornecer insights sem precedentes sobre o estilo de vida fúngico filamentous. Este artigo detalha a aplicação de corantes fluorescentes estabelecidos e menos conhecidos para rastrear a dinâmica da membrana plasmática, endo- e exocitose e mordogênese da parede celular em fungos filamentous. Os ensaios de rastreamento de endocitose permitem que várias questões biológicas celulares relacionadas ao estudo geral da endocitose sejam abordadas3. Para isso, a localização, velocidade e sucessão de compartimentos manchados após a adição de corante FM é registrada por microscopia de lapso de tempo e quantitativamente comparada entre as cepas de fungos testadas4. As tinturas da parede da pilha delineam o limite exterior da pilha e permitem o seguimento de eventos morfogenéticos, incluindo o crescimento polarizado da ponta do hyphal2,hyphal que ramifica5,fusão6,7 do hyphal e formação8do septo. Além disso, facilitam a quantificação da deposição localizada da parede celular e a identificação de defeitos durante a biogênese da parede celular9. Como o conhecimento detalhado das propriedades bioquímicas e biofísicas de qualquer marcador fluorescente é um pré-requisito fundamental para sua aplicação in vivo bem-sucedida, essas características são resumidas pela primeira vez para os seis corantes apresentados neste artigo.
Corantes seletivos da membrana FM (Fei Mao) corantes de estilingue são pequenas moléculas anfofílicas que não podem passar, mas reversivelmente associar com o folheto externo do bicamada lipídica de membranas biológicas10. Eles são praticamente não fluorescentes em solução aquosa, mas tornam-se intensamente fluorescentes sobre a integração da membrana plasmática, gerando excelentes relações de sinal para ruído (S/N)11. Estas propriedades torná-los ideais para visualizar a membrana plasmática e dinâmica organela intracelular, incluindo o rastreamento de endo- e exocitose12. O FM verde-fluorescente 1-43 e o FM vermelho-fluorescente 4-64 são os dois marcadores fluorescentes os mais extensamente usados da membrana para estas finalidades. SynaptoGreen C4 e SynaptoRed C2 são moléculas genéricas de fornecedores alternativos que podem ser usadas alternadamente em vez de FM 1-43 e FM 4-64, respectivamente.
Os corantes de estilingue compreendem três regiões estruturais chaves: (1) a cauda lipophilic que facilita a inserção da tintura no bilayer lipídico, (2) o núcleo do fluoroforre que determina as propriedades espectrais da tintura e é constituído por dois anéis aromáticos conectados por um a três ligações duplas, e (3) a cabeça hidrofílica positivamente carregada que impede a inserção e permeação completa do corante através da membrana (Figura 1A).
Quanto mais tempo a cauda lipofílica, maior é a hidrofóbica do tintura e, assim, aafinidade de ligação com a membrana, mas menor é a sua solubilidade da água e taxa de descoloração da membrana. Consequentemente, diferentes variantes de corante FM produzem diferentes dinâmicas de coloração e padrões. A maior hidrofóbica da FM 1-43 com cauda C4 fornece um sinal de fluorescência mais forte e mais estável nas membranas plasmáticas e organelas internas mais rapidamente do que a FM 4-64 de cauda C2 mais curta, quando aplicada em concentrações equimolares (Figura 2).
É importante ressaltar que as taxas constantes e altas de associação/dissociação de ambos os corantes FM11 com tempos médios de retenção de 1-6 s por molécula de corantes individuais13 reduzem as chances de ruptura localizada da função da membrana, por exemplo, através da modificação da fluidez da membrana ou interação permanente forçada de proteínas de membrana. Esta é provavelmente a principal razão pela qual essas moléculas podem ser usadas como corantes vitais. No entanto, as concentrações de tintura de FM acima de 50 μM são tóxicas para as células fúngicas e vegetais2,14,e evidências de protoplastos de tabaco BY-2 indicam que mais de 20 μM FM tintura levam à saturação da membrana plasmática14. Assim, é aconselhável não exceder esse limite, especialmente tendo em conta o fato de que excelente imagem foi alcançada com tão pouco quanto 2-5 μM15,16.
Notavelmente, as propriedades espectrais de corantes FM variam muito dependendo do microambiente de membrana particular (revisado14). Geralmente, os espectros de excitação e emissão de corantes FM em soluções solventes puras (como geralmente fornecidos nas informações do produto) diferem significativamente do que em ambientes celulares e podem, na maioria dos casos, não ser consultados diretamente para a seleção de configurações de imagem de células vivas. A máxima de excitação/emissão de FM 1-43 e FM 4-64, por exemplo, torna-se azul-deslocado por 37/46 nm e 43/64 nm, respectivamente, quando vinculado a membranas fúngicas em comparação com suas soluções em metanol (Tabela 1).
Os fundamentos inovadores para o uso de FM 4-64 e FM 1-43 para rastreamento de membrana plasmática, endo-/exocitose dinâmica, incluindo o Spitzenkörper e mitocôndrias, já foram amplamente documentados para uma ampla gama de espécies fúngicas filamentosas anteriormente2,4,17,18,19. Configurações recomendadas de imagem para ambos os corantes FM que funcionam em várias espécies fúngicas filamentosas são retratadas na Figura 1B. Limitações técnicas do equipamento disponível ou determinadas condições celulares e experimentais, como meio de cultura, pH ou temperatura, no entanto, podem exigir algumas adaptações. Felizmente, os corantes FM operam-se sobre uma escala espectral larga, e os resultados muito bons da imagem latente são conseguidos por FM emocionante 1-43 com 514 nm ou FM 4-64 com 488 nm. Consequentemente, as configurações de imagem ideais devem ser determinadas individualmente para cada tipo de amostra e aplicação pretendida.
A mudança considerável stoke de mais de 135 nm de FM 4-64 permite excelente, co-imagem simultânea com fluorofóbicos emitindo luz verde; isto é frequentemente explorado para avaliar a dinâmica de localização intracelular de proteínas de fusão rotuladas por proteínas de fusão rotuladas por proteínas de fusão rotuladas por proteínas de fusão rotuladas por proteínas de fusão rotuladas por proteínas de fusão em relação à membrana plasmática e à via endócitica9,20.
Corantes seletivos da parede celular Calcofluor White M2R (CFW), também comercializado como Fluorescent Brightener 28, é provavelmente o corante fluorescente mais conhecido usado para manchar as paredes celulares de bactérias, fungos, algas, plantas mais altas e insetos. Inicialmente utilizado como agente de clareamento óptico na indústria de papel, têxteis e detergentes, seus benefícios para o diagnóstico clínico de infecções fúngicas foi realizado no iníciode 21,22. Porque CFW intercalates irreversivelmente na cadeia de chitinas nascente que perturba a montagem normal de microfibrila chitina durante a biogênese da parede celular, gerando assim o estresse da parede celular23. Isso, por sua vez, desencadeia um mecanismo de reparo de danos na parede celular levando à deposição da parede celular localmente elevada como resultado da ativação de glucana e sintetina dechitin24,25. Este fenômeno pode ocorrer com qualquer corante que opera por evigoração de polímeros de parede celular, é dependente da concentração e é mais perceptível em pontas de hílgolo que representam o crescimento mais prolífico e, portanto, as partes mais sensíveis do micélio (Figura 3). Um resumo abrangente da maquinaria molecular que responde aos danos na parede celular foi recentemente fornecido26.
Tinecomum de overdose em combinação com fototoxicidade pode levar a lyse celular rápida de compartimentos de hílmo (Filme 1). No entanto, o aumento da sensibilidade às concentrações de tine que são "vitais" no tipo selvagem pode ser explorado para identificar defeitos na biossíntese da parede celular de mutantes de perda de função de genes9. Para CFW e Congo Red (CR), outro colorante têxtil também conhecido como Red Direto 28 e empregado como α- e β-chitin-specific mancha de parede celular para fungos e insetos27,28, concentrações limiar que induzem fortemente synthases quitina foram determinadas com > 60 μM CFW e > 70 μM CR, respectivamente, enquanto as concentrações <15 μM de qualquer tinqüeta não alterarou ou inibir o crescimento fúngico29,30,31. Hickey et al. colocaram essa concentração limite para CFW em 25 μM2. Portanto, é aconselhável usar concentrações de corante≤ 5 μM para excluir artefatos relacionados ao estresse e garantir o uso dessas moléculas como verdadeiramente "corantes fluorescentes vitais"2,32. Isso se aplica igualmente a Solophenyl Flavine 7GFE 500 (FpS) e Pontamine Fast Scarlet 4B (PFS), sinônimo de Direct Yellow 86 e Direct Red 23, respectivamente, dois outros corantes de parede celular útil cuja aplicação de fungos foi relatada pela primeira vez há mais de uma década33. Mas, apesar de suas notáveis propriedades espectrais34,35, o uso de ambos os corantes tem sido, desde então, muito limitado36,37. Como mostrado anteriormente para 1,5 μM CFW2,2 μM FpS são suficientes para resolver a dinâmica da parede celular em condições nativas com resolução temporal muito alta(Filme 2). Os mesmos resultados podem ser obtidos com 2 μM CR ou PFS.
Juntos, esses quatro corantes, CFW, FpS, PFS e CR, compreendem um conjunto de marcadores fluorescentes seletivos de parede celular que cobrem quase o espectro completo de luz de emissão visível (400-700 nm) utilizado em microscópios fluorescentes modernos (Figura 4). O aumento significativo na intensidade da fluorescência em cima do obrigatório aos polímeros da parede de pilha é inerente a todos os quatro e gera excelentes rácios S/N. Isso, por sua vez, permite manter as concentrações de corante e a intensidade da luz de excitação muito baixa e permite realizar a coloração da parede celular como técnica de imagem de células vivas de "baixa dose"2. Porque estes corantes da parede da pilha são membrana do plasma impermeável, funcionam simultaneamente como manchas vivas/inoperantes. Notavelmente, devido aos seus espectros de luz de emissão extremamente ampla, algumas limitações em relação às propriedades de co-imagem da CFW e SPF com outros fluorofônicos precisam ser cuidadosamente consideradas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BRAND cell counting chamber</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR718005</td>
			<td>Thoma format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White M2R</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3543</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td>water immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td>water immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo Red</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6277</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>8,36,73,230</td>
			<td>organic solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 1-43</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6814</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6689</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>Rettberg</td>
			<td>1340691030</td>
			<td>3 mm glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BB02400600A113MNT0</td>
			<td>24 x 60 # 1 glass cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506353</td>
			<td>glycerol immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 Meta</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Minimal Medium</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td>generic fungal growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-slide 8-well</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>ibiTreat #1.5 polymer coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>polyester filtration material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>8,21,472</td>
			<td>92 x 16 mm culture dish w/o cams</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td>transparent gelling agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440762-9904-000</td>
			<td>oil immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pontamine Fast Scarlet 4B</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>212490</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>213400</td>
			<td>fungal growth medium for T. atroviride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Broth (PDB)</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>254920</td>
			<td>fungal growth medium for T. atroviride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706</td>
			<td>1.5 mL SafeSeal tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>5518016</td>
			<td>Cutfix sterile scalpel #23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>6,25,54,502</td>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solophenyl Flavine 7GFE 500</td>
			<td>CIBA</td>
			<td>1485385V6</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynaptoGreen C4</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>70020</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynaptoRed C2</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>70021</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe membrane filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>723-9945</td>
			<td>0.45 &#181;m SFCA syringe filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td>Leica</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vogel&#39;s Minimal Medium (VMM)</td>
			<td>FGSC</td>
			<td>Fungal Genetics Stock Centre</td>
			<td>fungal growth medium for N. crassa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging of filamentous fungi

A aplicação de corantes fluorescentes seletivos da membrana e da parede celular para análises de imagem de células vivas da dinâmica de organela em células fúngicas começou há duas décadas e, desde então, continua a contribuir muito para a nossa compreensão do fungo filamentou Vida. Este artigo fornece um guia prático para a utilização dos dois corantes de membrana FM 1-43 e FM 4-64 e as manchas de parede de quatro células Calcofluor White M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 e Congo Red. O foco está em sua aplicação de baixa dose para verificar a coloração livre de artefatos, suas propriedades de co-imagem e sua avaliação quantitativa. Os métodos apresentados são aplicáveis a todas as amostras fúngicas filamentosas que podem ser preparadas das formas descritas. As abordagens fundamentais de coloração podem servir como pontos de partida para adaptações a espécies que podem exigir diferentes condições de cultivo. Primeiramente, as propriedades biofísicas e bioquímicas são revistas porque sua compreensão é essencial para usar estas tinturas como manchas fluorescentes verdadeiramente vitais. Em segundo lugar, são apresentados protocolos passo a passo que detalham a preparação de vários tipos de amostra fúngica para imagens fluorescentes de células vivas. Finalmente, experimentos de exemplo ilustram diferentes abordagens para: (1) identificar defeitos na organização espaço-temporal da endocitose em mutantes genéticos, (2) caracterizam comparativamente a co-localização compartilhada e distinta de proteínas-alvo rotuladas por GFP na via endócitica, (3) identificar defeitos de parede de células morfogenéticas em um mutante genético, e (4) monitorar a biogênese da parede celular em tempo real.

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Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

Corantes fluorescentes vitais são ferramentas essenciais para análises de imagens de células vivas na biologia moderna das células fúngicas. Este artigo detalha a aplicação de corantes fluorescentes estabelecidos e menos conhecidos para rastrear a dinâmica da membrana plasmática, endo-/exocitose e mordogênese da parede celular em fungos filamentous.

Aplicação de corantes fluorescentes seletivos da membrana e da parede de pilha para a imagem latente da Viver-pilha de fungos de Filamentous

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

Corantes fluorescentes seletivos de membrana e parede celular são ferramentas importantes para a análise da dinâmica organela e das células fúngicas vivas. Nossos protocolos fornecem fundamentais de fundo teórico e diretrizes práticas para a aplicação de uma seleção desses corantes como manchas verdadeiramente vitais. O ponto chave para isso é usar concentrações de corante muito baixas que não causam artefatos celulares relacionados à saturação ou toxicidade de corantes, ao mesmo tempo em que fornecem boas relações de sinal para ruído para imagens de células vivas de alta qualidade e de longo prazo.Com colegas do Departamento de Medicina Nuclear da universidade médica, recentemente usamos essas técnicas de coloração para desenvolver uma nova abordagem para o diagnóstico guiado por imagens da aapergillose. A capacidade de monitorar estruturas de membrana e parede celular em tempo real foi crucial para determinar a dinâmica de absorção do composto experimental da droga. Para iniciar este procedimento, primeiro obtenha uma pré-cultura preparada.Use um bisturi estéril para cortar um pequeno bloco de ágar que carrega micélio não esporulento da borda da colônia da précultura. Coloque o bloco de ágar no centro de uma placa média fresca e sólida para inocular a cultura experimental. Incubar a cultura experimental de acordo com o estágio de desenvolvimento destinado a ser incubado.A preparação da amostra é um pouco delicada e a otimização das configurações de aquisição de imagens é bastante complexa. A demonstração visual de ambos os procedimentos acompanhados de explicação verbal facilita muito a replicabilidade. Para montar as amostras, mantenha um deslizamento limpo de 24 por 60 milímetros de tampa de vidro pronto e adicione 18 microliters de solução líquida de sal médio ou fisiológico no centro.Adicione dois microliters da solução de trabalho de 20 micromolares preparados ao líquido no centro da tampa e misture bem, encobrindo e descendo várias vezes, evitando a produção de bolhas de ar. Usando um bisturi limpo, corte uma amostra de 15 por 15 milímetros da periferia da colônia e coloque-a verticalmente ao lado da gota média no deslizamento da tampa. Use o bisturi para apoiar a borda superior do bloco e um dedo para segurar a parte traseira do bloco no lugar.Em seguida, abaixe lentamente o lado carregando o micélio para o líquido. Monte a amostra preparada no estágio do microscópio. Primeiro, ajuste as configurações básicas de aquisição de imagens para capturar dinâmicas permanentes em hifas individuais, conforme descrito no protocolo de texto.Para os ensaios de absorção da endocitose, consulte a figura um e a tabela um protocolo de texto para identificar as melhores configurações de excitação e emissão para FM 143 ou FM 464 que estão disponíveis no sistema de microscopia e ajustar essas configurações no sistema em conformidade. Inicie a gravação de imagens usando as configurações previamente ajustadas e avalie os resultados. Em seguida, otimize as configurações de aquisição de imagem para a resolução espacial e temporal necessária para capturar o aspecto da membrana plasmática ou da dinâmica da endocitose em que o experimento está focado.Para a dinâmica da parede celular, consulte a figura quatro e a tabela um protocolo de texto para identificar as melhores configurações de excitação e emissão para o corante da parede celular aplicada e ajustar as configurações do sistema de microscopia em conformidade. Inicie a gravação de imagens usando as configurações previamente ajustadas e avalie os resultados. Em seguida, otimize as configurações de aquisição de imagem para a resolução espacial e temporal necessária para capturar o aspecto da morfogênese da parede celular em que o experimento está focado.Além de apenas visualizar processos celulares, a imagem celular viva permite a extração de informações quantitativas a partir dos dados registrados. Em um exemplo dos ensaios de absorção FM 464, as amostras fúngicas são cultivadas como colônias e montadas pelo método de bloco de ágar invertido. Os ensaios identificaram defeitos na organização espócica-temporal da endocitose na exclusão genética e mutantes super-expressantes genéticos da proteína específica fúngica SFP 2 do trichoderma atroviride.Exemplos de fm 464 co-coloração de proteínas de fusão fluorescente direcionadas a compartimentos endocíticos é mostrado aqui. Esta co-coloração é empregada para relacionar a distribuição subcelular das duas proteínas fluorescentes verdes aprimoradas marcadas proteína transmembrana, SFP 2 e GPR 1, à via endocítica no trichoderma atroviride. Um exemplo de co-coloração FM 464 para a identificação de diferenças morfogenéticas mostra que essa co-coloração permite uma maior relação com a dinâmica de localização subcelular da proteína do polarismo BUD-6 rotulada para o fim de alguns processos dependentes do tráfico, como a formação de septa e crescimento de pontas de higifismo polarizada.Também caracteriza diferenças na organização subcelular e arquitetura hiphal entre tipo selvagem e cepas mutantes de crassa neurospora. A coloração representativa da parede celular mostra que as diferentes propriedades de interação do branco calcofluor, flavine solofenil e vermelho congo com polímeros de parede celular destacam diferenças morfogenéticas entre o mutante delta SFP 2 e a cepa do tipo selvagem de trichoderma atroviride. O aumento do estresse da parede celular infligido por concentrações elevadas de corante ocorre mais rapidamente e é mais pronunciado no mutante em comparação com o tipo selvagem.Além disso, as mesmas imagens permitem a quantificação de diferenças morfogenéticas em relação ao diâmetro hifál e distância septal entre ambas as cepas. O monitoramento representativo em tempo real da biossíntese da parede celular indica que a concentração branca de calcofluor muito baixa impede a saturação da parede celular com moléculas de corante e permite o monitoramento quantitativo em tempo real da biossíntese da parede celular. Isso revela que a deposição de novo material de parede celular não é uniforme, mas responde muito rapidamente a tensões físicas localizadas resultantes do deslocamento relativo de uma célula sobre o apego célula-célula antes da dermalinfusão na crassa neurospora.Menos é mais. Use o mínimo de corante possível para impedir a interferência do marcador fluorescente com processos celulares. Após este procedimento, a recuperação da flourescência após experimentos de branqueamento fotográfico poderia ser realizada para quantificar o transporte e a cinética da biogênese.A introdução pioneira da coloração da membrana e da parede celular em fungos filamentosos no início do milênio literalmente revolucionou a maneira como olhamos para os fungos. Calcofluor branco pode causar irritações oculares e é um cancerígeno classificado. O vermelho congolês é cancerigênico e teratogênico, por isso, por favor, use proteção ocular e de pele ao manusear esses corantes.

Research

JoVE Journal

Biology

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