Name: application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging of filamentous fungi
Uploaded: 2019-11-28T15:00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi at JoVE.com

Tack vare den tyrolska vetenskaps fonden (TWF) för att ge bidrag #256524 till AL, till Wien Science and Technology Fund (WWTF) för att ge bidrag #LS13-086 till SZ, och till Publikationsfond vid universitetet i Innsbruck för att stödja Open Access publikation. Författarna tackar också Institutionen för zoologi vid universitetet i Innsbruck för att tillhandahålla Leica TCS SP5 II konfokala laser scanning Mikroskop.

1. beredning av svamp prov
<ol><li>Svamp för kulturer<ol>
<li>Inokulera den önskade stammen på ett lämpligt fast agar medium, såsom potatis dextros agar (PDA) för Trichoderma atroviride eller Vogel ' s minimal medium (VMM) för neurospora crassa. Lägg till en lämplig markerings markör när du arbetar med transformerande stammar.</li>
		<li>Inkubera för kulturen på organismens optimala temperatur. Till exempel T. atroviride vid 25 ° c och N. crassa vid 30 ° c, och 12 h/12 h ljus/mörker cykler tills en sporbildare mycel har utvecklats men ännu inte nått kanten av plattan. På en standardstorlek petriskål (9,2 cm Ø), tar detta Wild-typ T. atroviride på 4 – 6 dagar genomsnitt, medan N. crassa Wild typ når detta skede efter 3 – 4 dagar i genomsnitt.</li>
	</ol></li>
	<li>Odling av svampkolonier<ol>
<li>Med hjälp av en steril skalpell, klippa en liten 3 mm x 3 mm agar block som transporterar icke-sporulerande mycel från kolonin kanten av för kulturen.</li>
		<li>Placera agarblocket i mitten av en ny solid mediumplåt för att Inokulera den experimentella kulturen.</li>
		<li>Inkubera den experimentella kulturen enligt det utvecklingsstadium som är avsett att undersökas. Till exempel kräver Wild-typ T. atroviride 20 – 22 timmar vid 25 ° c i mörkret för att utveckla kolonier med ca 2 cm i diameter på PDA, medan Wild-typ N. crassa når kolonin diametrar på ca 4 cm efter 14 – 16 h inkubering vid 30 ° c i mörkret på VMM. Obs: inkubering i mörker förhindrar bildandet av pigment som kan introducera autofluorescence. För att eliminera medium bakgrund fluorescens från den experimentella kulturen, ersätta agar med 1,5% w/v av en transparent stelnar agent (se tabellen av material), och alla komplexa medium med en definierad minimal medium.</li>
	</ol></li>
	<li>Odling av solida germling kulturer<ol>
<li>Använd 5 ml steril fysiologisk saltlösning (0,9% w/v NaCl) för att skörda spridnings sporer från för odlingsplattan och samla upp den resulterande spor suspensionen i ett 15 ml skruvlock rör.</li>
		<li>Blanda Spore suspensionen väl genom kraftig vortexa och därefter filtrera den över en 1 cm x 5 cm remsa av sterila filter tyg (se tabellen av material) lätt instoppad i en 1 ml pipett spets (både monterade och autoklaverade i förväg) i en ny steril tub.</li>
		<li>Bestäm spor tätheten med en cell räknings kammare och Förbered en 1 x 107 celler/ml Spore suspension med fysiologisk saltlösning. Spore-fjädringen kan hållas vid 4 ° c i upp till två veckor.</li>
		<li>Förbered en standardstorlek petriskål (9,2 cm Ø) med 20 mL fast medium och tillsätt 15 – 20 sterila glaspärlor (3 mm Ø) ovanpå.</li>
		<li>Pipettera 200 μL av Spore-fjädringen på medel plattan och fördela cellerna jämnt över hela plattan genom att skaka försiktigt. Samla glaspärlor i en bägare med 70% etanol för återanvändning.</li>
		<li>Inkubera den experimentella kulturen enligt det utvecklingsstadium som är avsett att undersökas. Exempelvis kräver T. atroviride Wild typ 5 – 6 h vid 25 ° c i mörkret för att utveckla spridnings germlings på PDA, medan N. crassa Wild Type utvecklar spridnings germlings efter 3 – 4 h inkubering vid 30 ° c i mörkret på VMM. Anmärkning: för att eliminera alla medel bakgrund fluorescens från experimentell kultur, ersätta agar med 1,5% w/v av en transparent stelnar agent, och alla komplexa medium med en definierad minimal medium.</li>
	</ol></li>
	<li>Odling av flytande germling kulturer<ol>
<li>Fyll 190 μL flytande odlingssubstrat i varje brunn i en 8-brunn kambered mikro-Slide.</li>
		<li>Tillsätt 10 μL av en 1 x 107 cells/ml Spore-lösning (bereds i steg 1.4.1 – 1.4.3) och blanda genom att försiktigt Pipettera upp och ned några gånger. Det resulterande totala antalet celler är 1 x 105 per brunn.</li>
		<li>Inkubera den experimentella kulturen enligt det utvecklingsstadium som är avsett att undersökas. Till exempel, den vilda typ T. atroviride kräver 5 – 6 h vid 25 ° c i mörker för att utveckla spridnings germlings i potatis dextros buljong (PDB), medan den vilda typ N. crassa utvecklar spridnings germlings efter 3 – 4 h inkubation vid 30 ° c i mörkret i flytande VMM.</li>
	</ol></li>
</ol>2. beredning av Dye arbetslösningar
<ol><li>För att garantera full löslighet av varje färgämne, Förbered 2 mM stamlösningar i dimetylsulfoxid (DMSO) genom att tillsätta lämplig mängd (se exakta vikter i tabell 1) till 1 ml 100% DMSO och blanda väl genom vortexing. FÖRSIKTIGHET: se till att ta DMSO från en septum försluten flaska; Det bör vara en klar transparent vätska. Vid kontakt med luft, DMSO blir brun-förmodligen på grund av oxidation av spår orenheter-och kan negativt påverka celltillväxt eller färga färgning.</li>
	<li>Filter sterilisera stamlösningen genom ett 0,2 μm spruta membranfilter till ett nytt sterilt 1,5 mL reaktionsrör. För att minimera färgblekning, Linda röret i aluminiumfolie. Anmärkning: färgämne stamlösning kan aliciteras i mindre volymer för att undvika upptinning/frysning cykler, och hålls vid 4 ° c i flera månader.</li>
	<li>Bered en arbetslösning på 20 μM vattenhaltiga färgämnen genom att lösa upp 2 μL färglager lösning i 198 μL sterilt destillerat vatten i ett färskt sterilt 1,5 mL reaktionsrör. För att minimera färgblekning, Linda röret i aluminiumfolie. Anmärkning: Dye arbetslösning bör förberedas nyligen på dagen för experimentet.</li>
	<li>Under prov monteringen (se avsnitt 3), kommer färgen arbetslösning att vara standardmässigt utspädd 1:10, vilket resulterar i en slutlig färgämnes koncentration på 2 μm och 0,1% w/v slutlig DMSO koncentration. Obs: välja olika utspädningsfaktorer genom att helt enkelt ändra volymförhållandet mellan Dye arbetslösning och monterings vätska, gör det möjligt att enkelt anpassa den önskade slutliga färgen koncentration. FÖRSIKTIGHET: för att förhindra oönskade effekter på grund av färg eller DMSO-toxicitet bör utspädningsfaktorn inte falla under 1:4 för att resultera i maximala slutliga koncentrationer på 5 μM färg och 0,4% w/v DMSO. Högre färgkoncentrationer kommer snabbt att mätta systemet och förhindra tillförlitlig signal kvantifiering, medan mer än 0,5% w/v (≥ 62,5 mM) DMSO kan försämra cell utveckling38.</li>
</ol>3. provberedning för mikroskopi
<ol><li>Montera prover från svampkolonier (steg 1,2) eller solida germlings kulturer (steg 1,3) med den inverterade agarblockmetoden.<ol>
<li>Håll en ren 24 mm x 60 mm glas täckslip (#1 = 0,13-0.16 mm tjocklek) klar och tillsätt 18 μL flytande minimalt medium (VMM eller M9) eller fysiologisk saltlösning på mitten.</li>
		<li>Tillsätt 2 μL av den 20 μM färg arbetslösningen till 18 μL vätska och blanda väl genom att Pipettera upp och ner flera gånger, samtidigt som man undviker produktionen av luftbubblor. Obs: när du arbetar med flera prover, är det lämpligt att förbereda en Master Mix av vätska-Dye lösning för alla för att säkerställa lika färg koncentration hela experimentet.</li>
		<li>Med en ren skalpell, skär ut en 15 mm x 15 mm prov från periferin av kolonin eller solid germling kultur och placera den vertikalt bredvid medellång droppe på locket slip.</li>
		<li>Använda skalpell för att stödja den övre kanten av blocket och ett finger för att hålla baksidan av blocket på plats, sakta sänka den sida som transporterar mycel eller germlings på vätskan. Provet är nu klart för överföring till Mikroskop stadiet. FÖRSIKTIGHET: det är viktigt att göra detta långsamt och mycket noggrant för att minimera mekanisk påfrestning på cellerna och för att undvika att luftbubblor fastnar mellan prov och täckslip.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montera flytande germling kulturer från steg 1,4. Obs: mest bekvämt, flytande germling kulturer i kamrar mikro-och diabilder kan överföras direkt och ytterligare manipuleras på mikroskopet skede.<ol>
<li>Tillsätt 22 μL färg arbetslösning till 200 μL flytande medium för att resultera i standard slutkoncentration på 2 μM färg och 0,1% w/v DMSO. Anmärkning: flytande germling kulturer har den stora fördelen att fluorescerande färgämnen (eller andra kemikalier, såsom hämmare) kan läggas till någon önskad tidpunkt av experimentet, även under inspelningen. I så fall måste särskild försiktighet iakttas för att administrera vätskan sjunker mycket långsamt för att inte störa cellerna. System vibrationer och Brownian motion kan redan introducera vissa cell rörelser.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. levande-cell Mikroskop
<ol><li>Justera de grundläggande bild anskaffnings inställningarna. Följande bild anskaffnings inställningar gör det möjligt att fånga färgdynamik i enskilda hyfer och är tillämpliga på båda följande analyser<ol>
<li>Applicera 5 – 10% lasereffekt på 20% av den fulla uteffekten hos enheten.</li>
		<li>Använd en plan APO 60x – 63x glycerol eller vatten nedsänkning mål med en hög numerisk bländare ≥ 1,2.</li>
		<li>Begränsa bild förvärvs området till konturen av hyfer genom att ställa in en bildstorlek på 1024 x 256 pixlar och med hjälp av en optisk zoomfaktor på 2 – 3.</li>
		<li>Använd dubbelriktad skanning med 400 Hz. Justera hålstorleken till 1 luftig enhet.</li>
		<li>Ställ in känsligheten för den känsligaste detektorn till 100%.</li>
		<li>För tid varv inspelning, starta bild förvärv med en bildruta var 15 s för att möjliggöra rimlig tidsupplösning utan att producera färgblekning eller foto stress.</li>
		<li>För 3D-inspelning, ange den övre och undre rumsliga gränsen till gränsen för hyfer och rymden optiska avsnitt 1 μm isär för att möjliggöra rimlig rumslig upplösning. Obs: på grund av den snabba tillväxten av hyfer, hög rumslig upplösning i Z-axeln har ofta offrats för hög temporala upplösning i X/Y-axeln eller tvärtom. Endast mycket moderna konfokala laserscanning Mikroskop är tillräckligt snabba för att tillfredsställa båda kraven.</li>
	</ol></li>
	<li>Endocytos upptag analyser<ol>
<li>Konsultera figur 1 och tabell 1 för att identifiera de bästa inställningarna för excitation/emission för FM 1-43 och/eller FM 4-64 som finns på mikroskopi-systemet och justera därefter. Anmärkning: med den rekommenderade 2 μM koncentrationen, införlivande av FM-färg i plasmamembranet är omedelbar i normala friska celler. Hela processen från initial plasmamembran färgning till färgämne utseende i tubulär vakuoler är vanligtvis avslutas inom 30 – 45 min vid rumstemperatur. Öka FM-färgkoncentrationen ökar S/N-förhållandet och därmed ger högre kontrast bilder snabbare. Emellertid, det snabbar också upp märkningsprocessen gör det svårare att skilja den kronologiska följden av organell färgning.</li>
		<li>Starta bildinspelning med de ovan rekommenderade grundläggande bild anskaffnings inställningarna och utvärdera resultaten.</li>
		<li>Optimera bild anskaffnings inställningarna till den rumsliga och temporala upplösningen som krävs för att fånga upp aspekten av plasmamembranet eller endocytos dynamik experimentet är fokuserat på.</li>
		<li>Till exempel, för att fånga mycket snabb dynamik i X/Y, minska den totala bildstorleken, bilden bara ett fokalplan och öka skanningshastigheten till 1 fps. För högre upplösning i Z-axeln, minska upplösningen i X/Y, minska bildstorleken och minska avståndet mellan optiska sektioner till 0,5 μm.</li>
	</ol></li>
	<li>Cell Väggs dynamik<ol>
<li>Konsultera figur 4 och tabell 1 för att identifiera de bästa excitation/utsläpp inställningar för tillämpad cell vägg färgämne som finns på mikroskopi systemet och justera därefter. Obs: på grund av deras breda emissions spektra är CFW och SPF inte väl lämpade för samtidig samavbildning med andra fluoroforer, övervägande GFP. Vissa restriktioner gäller även för sekventiell avbildning metoder med dessa färgämnen, och därmed måste optimeras individuellt.</li>
		<li>Starta bildinspelning med de ovan rekommenderade grundläggande bild anskaffnings inställningarna och utvärdera resultaten. Anmärkning: med den rekommenderade 2 μM koncentration, införlivande av färg i cellväggen är inte nödvändigtvis omedelbar men rimligen snabb. Hela processen med septumbildning, till exempel, tar i genomsnitt ca 5 – 7 min vid rumstemperatur20. Öka cellväggen färgämnes koncentrationen ökar S/N-förhållandet och därmed ger högre kontrast bilder snabbare. Men, det också snabbt introducerar artefakter på grund av inducerad cellväggen skador reparation.</li>
		<li>Optimera bild anskaffnings inställningarna till den rumsliga och temporala upplösningen som krävs för att fånga aspekten av cellvägg morfogenes experimentet är fokuserat på, som beskrivs i avsnitt 4.2.3.</li>
	</ol></li>
</ol>

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen och inget att avslöja.

Denna artikel fortsätter den banbrytande arbete som etablerat användningen av olika fluorescerande färgämnen som vitala organell markörer för trådformiga svampar i början av 2000-talet2,4,43, och försök att diskutera foto fysikaliska och cellbiologiska egenskaper av FM-färgämnen och valda cellväggen färgämnen i större detalj än tidigare. Särskilt när det gäller oönskade cellulära effekter, såsom membranmättnad eller skador cellväggen, som förekommer över vissa färgämnes koncentrationer. Det som tidigare ansetts vara giftfritt på cellnivå betraktas nu som giftigt på molekylär nivå. Även om dessa effekter kan vara mycket subtila och inte direkt framgår av uppenbara förändringar i organell eller cell beteende, alla möjliga störningar av färgämne ansökan än visualisering måste minimeras för utredning av infödda molekylära funktion. Lyckligtvis, förbättrad känslighet och Quantum effektivitet moderna detektorer, såsom Silicon Avalanche fotodiod detektorer (SI-APDS)44 eller airyscan område detektor45, underlätta användningen av ännu lägre färgämne belopp än tidigare. En annan viktig målsättning med artikeln är att exemplifiera Co-Imaging egenskaper hos dessa färgämnen med andra fluoroforer, viktigast av allt, de av GFP som den mest använda fluorescerande protein i biologi. Detta bör hjälpa utformningen av bild experiment som syftar till att korrelera den subcellulära lokalisering dynamiken i fluorescerande fusions proteiner till de av svamp cellväggen, plasmamembranet eller endo-och exocytos vägen etc.
Avbildning under naturliga och stressfria förhållanden är avgörande för förvärvet av tillförlitliga data. Några praktiska överväganden när det gäller odlingssubstrat och provberedning syftar till att ge en utgångspunkt för att hitta de optimala förhållanden som medger en artefakt-fri, lång tid observation av friska, ostressade celler med det högsta S/N-förhållandet möjligt för ett givet prov. Det finns inget universellt sätt att uppnå pålitliga och meningsfulla bildresultat. Det är inneboende i det tillvägagångssätt som biologisk variation av provet, subjektivitet och förväntningar microscopist, liksom bild efter bearbetning har betydande inflytande på datainsamling och tolkning, respektive. Därför, den praktiska erfarenheten av microscopist, hennes/hans intima kunskaper om cellbiologi av svampen under utredning, samt skicklig provberedning för att skapa förutsättningar som "naturliga" och ostörd som möjligt i en laboratoriemiljö, är av största vikt för att förvärva och utvärdera Imaging data som sanningsenligt återspeglar de studerade cellulära fenomen. Som en tumregel, förekomsten av oönskade biverkningar av fluorescerande färgämnen, allt från den subtila och därmed inte uppenbarligen synlig aktivering av plasmamembran eller cell Wall re-modellering stress reaktionsvägar till den enkla cytotoxiska induktion av cell autolysis, kan endast förhindras säkert genom att tillämpa låga färgkoncentrationer ≤ 2 μM.
Tillämpningen av fluorescerande färgämnen är enkel, men deras särdrag är dåligt kännetecknas. En viktig styrka med att använda fluorescerande färgämnen är den förberedande enkelheten i experimentella protokoll. Odling och provtagning av svampen, tillsats av färgämne (s), och montering på mikroskopet skede är (med praktiken) okomplicerad. Justering av grundläggande bildinställningar, inklusive excitation och emission våglängder, exponeringstider, inställningar tid kurs etc., följ enkla biofysiska regler för mikroskopet och biologiska regler för de använda fluorescerande färgämnen inuti cellerna. Tabell 1 avser att stödja identifieringen av den lämpligaste färg-eller färg kombinationen för experimenterande. Dessutom, fluorescerande färgämnen är rimligt prissatta, lätt tillgängliga med tillförlitlig hög kvalitet och därmed säkerställa mycket reproducerbara ansökan.
Två stora restriktioner för att använda membran eller cellväggen selektiva fluorescerande färgämnen är (ofta) begränsad kunskap om deras exakta färgning egenskaper, som i de flesta fall är icke-specifika på organell och molekylär nivå, och deras koncentrationsberoende oönskade biverkningar. FM-färgämnen är specifika för lipidbilayers som deltar i endo-och exocytos. Men exakt vilka subcellulära organeller blir successivt märkt under de testade förhållandena är inte omedelbart uppenbar och kräver jämförelse av olika FM-färgvarianter, och co-märkning med ytterligare organell-specifika markörer. Preferensen av FM 1-43 för mitokondriella membran, i jämförelse med FM 4-64, är ett exempel. Cellväggen selektiva färgämnen uppvisar varierande specificitet för de tre stora polymerer av svamp cellväggen. CFW tros vara en icke-specifik fläck för β-glukaner och Chitin, SPF tros vara mest selektiv för β-1, 4-glukaner, och CR tros vara mycket selektiv för α-och β-chitins. Information om den bindande specificiteten för PFS till svamp cells vägg polysackarider är inte tillgänglig för närvarande. Till vilket förhållande som svamp cellväggen polymer är mest effektivt märkt vid en viss färg koncentration i svamparter under utredning är inte lätt att besvara, och tillämpningen av detaljerade mätningar som förvärvats in vitro eller in vivo i andra organismer eller andra svamparter måste beaktas mycket noggrant. Tyvärr är denna information glesa och mycket utspridda i litteraturen35,42,46. Nyare poster som skulle följa på tidigare studier33 för att ge nya insikter i exakt färgning egenskaper av de utvalda färgämnen specifikt i svampar är inte tillgängliga för närvarande.
Imaging-kontroller är nödvändiga för att utvärdera infärgnings mönster och cellulära svar korrekt. Förmodligen den mest utmanande delen, dock, är att känna till cellbiologi av svampen så väl att de inspelade förändringarna i den subcellulära lokalisering av membran och cellväggen selektiv fluorescerande färgämnen, förändringar i cellulära arkitektur eller hyphal tillväxtmönster kan uteslutande och tryggt vara relaterade till de avsedda effekterna av experimentell behandling. För detta är det viktigt att ha bra kontroller tillsammans med alla nya Live-cell Imaging experiment. Dessa inkluderar obehandlad vildtyp som negativ avbildning kontroll för att utesluta bakgrund autofluorescence och detektor brus från den förvärvade bilden, och att ha en morfologisk komparator när man arbetar med mutanter. Dessutom är en positiv avbildning kontroll, till exempel en stam som uttrycker GFP eller RFP i cytoplasman eller annan välkänd fluorescerande markör protein, viktigt att ställa excitation ljusintensitet till det minimum som krävs och har en cell vitalitet kontroll. När dessa kontroller är inställda, är användningen av fluorescerande färgämnen inte begränsad till visualisering uppgifter endast, men deras koncentrationsberoende färgning dynamik, liksom koncentrationsberoende biverkningar kan analytiskt utnyttjas; till exempel, för att kvantitativt övervaka cell Väggs biosyntes i realtid eller för identifiering av mutantspecifika fenotyper i känslighetsanalyser47.
Förbättrade framtida tillämpningar beror på en detaljerad funktionell analys av färg färgning egenskaper. En stor pågående utmaning är att ytterligare förbättra och automatisera kvantitativa bildanalyser för att främja funktionell utvärdering av den subcellulära dynamiken i membran och cell Väggs selektiva fluorescerande färgämnen i trådformiga svampar. För denna, omfattande, kvantitativa Co-lokalisering studier av dessa färgämnen med kända organell och cellvägg polymer markörer i kombination med muterade stammar bristfällig i synnerhet transportvägar eller som saknar specifika strukturella komponenter krävs först. Flera endocytos markörer för jämförande analyser med FM-färgämnen finns tillgängliga48,49, och med avseende på de fortfarande dåligt karaktäriserade bindande särdragen hos cell Väggs färgämnen i svampar, kan tillämpningen av fluorescerande-märkta GLUCAN-specifika antikroppar50 ge en möjlighet att ta itu med denna fråga.

För tjugo år sedan, det sätt på vilket hyphal morfogenes och den underliggande molekylära cellbiologi kunde visualiseras i trådformiga svampar revolutionerades av tillämpningen av membranet selektiv fluorescerande FEI Mao Dye FM 4-641. Senare, fördelen med Chitin-bindande färgämne Calcofluor vit som vitala fluorescerande markör för svamp cell väggdynamik realiserades2. Sedan dess har både färgämnen och varianter därav blivit en naturlig del av levande cell avbildning analyser av organell dynamik i svampar, och fortsätter att ge oöverträffad insikt i den trådformiga svamp livsstil. Detta papper Detaljer tillämpningen av etablerade och mindre kända fluorescerande färgämnen för att spåra plasmamembran dynamik, endo-och exocytos och cellvägg morfogenes i trådformiga svampar. Endocytos tracking analyser möjliggör olika cellbiologiska frågor relaterade till den allmänna studien av endocytos som skall behandlas3. För detta, lokalisering, snabbhet och följd av färgade fack på FM Dye tillägg registreras av tidsfördröjning mikroskopi och kvantitativt jämfört mellan de testade svampstammar4. Cellväggen färgämnen avgränsa den yttre gränsen av cellen och tillåta spårning av morfogenetiska händelser, inklusive polariserad hyphal spets tillväxt2, hyphal förgrening5, hyphal fusion6,7 och septum formation8. Dessutom underlättar de kvantifieringen av lokaliserad cell vägg deposition och identifiering av defekter under cell Wall biogenes9. Eftersom detaljerad kunskap om de biokemiska och biofysiska egenskaperna hos någon fluorescerande markör är en grundläggande förutsättning för dess framgångsrika in vivo-applikation, sammanfattas dessa egenskaper först för de sex färgerna som visas i denna artikel.
Membran selektiva färgämnen FM (FEI Mao) styryl färgämnen är små amfifila molekyler som inte kan passera men reversibelt associera med den yttre broschyren av lipidbilayer av biologiska membran10. De är praktiskt taget icke-fluorescerande i vattenlösning, men blir intensivt fluorescerande på plasmamembran integration, genererar utmärkt signal-till-brus (S/N)-nyckeltal11. Dessa egenskaper gör dem idealiska för att visualisera plasmamembran och intracellulär organell dynamik, inklusive spårning av endo-och exocytos12. Den grön-fluorescerande FM 1-43 och den röd-fluorescerande FM 4-64 är de två mest använda fluorescerande membran markörer för dessa ändamål. SynaptoGreen C4 och Synapserade C2 är generiska molekyler från alternativa leverantörer som kan användas omväxlande i stället för FM 1-43 och FM 4-64, respektive.
Styryl färgämnen består av tre viktiga strukturella regioner: (1) den lipofila svansen som underlättar införandet av färgämnet i lipidbilayer, (2) den fluorophore kärna som bestämmer de spektrala egenskaperna hos färgämnet och utgörs av två aromatiska ringar sammankopplade med en till tre dubbelbindningar, och (3) positivt laddade hydrofila huvudet som förhindrar fullständig insättning och genomträngning av färg genom membranet (figur 1a).
Ju längre lipofila svans, den högre är Dye vattenavvisande egenskaper och därmed bindning samhörighet med membranet, men den lägre är dess vattenlöslighet och membran de-färgning hastighet. Följaktligen, olika FM-färgvarianter producera olika färgning dynamik och mönster. Den högre hydrofobicitet av den C4-tailed FM 1-43 ger en starkare och stabilare fluorescenssignal vid plasmamembran och inre organeller snabbare än den kortare C2-tailed FM 4-64, när den appliceras på ekvimolära koncentrationer (figur 2).
Viktigt, den konstanta och hög Association/dissociation priser av både FM färgämnen11 med genomsnittliga retentionstider på 1 – 6 s per individuell färg molekyl13 minska chanserna för lokaliserade störningar av membran funktion, till exempel genom modifiering av membran smidighet eller påtvingad permanent interaktion av membranproteiner. Detta är förmodligen den viktigaste anledningen till att dessa molekyler kan användas som vitala färgämnen. Icke desto mindre, fm Dye koncentrationer över 50 μm är giftiga för svamp-och växtceller2,14, och bevis från by-2 tobak protoplasts indikerar att mer än 20 μm FM färgämne leda till plasmamembran mättnad14. Det är därför tillrådligt att inte överskrida denna gräns, särskilt med tanke på att utmärkt avbildning har uppnåtts med så lite som 2 – 5 μm15,16.
Särskilt, de spektrala egenskaperna hos FM färgämnen varierar kraftigt beroende på den särskilda membran mikromiljö (omdömet14). Generellt, excitation och emission spektra av FM-färgämnen i ren lösningsmedels lösningar (som vanligtvis anges i produktinformationen) skiljer sig avsevärt från det i cellulära miljöer och kan i de flesta fall inte direkt konsulteras för att välja Live-cell Imaging inställningar. Excitation/emission Maxima av FM 1-43 och FM 4-64, till exempel, blir blåskiftade med 37/46 nm och 43/64 nm, respektive, när de är bundna till svamp membran i jämförelse med deras lösningar i metanol (tabell 1).
De banbrytande grunderna för användning av FM 4-64 och FM 1-43 för att spåra plasmamembran, endo-/exocytosis och organelledynamik, inklusive spitzenkörper och mitokonbenerna, har redan utförligt dokumenterats för ett brett spektrum av filamentösa svamparter tidigare2,4,17,18,19. Rekommenderade bildinställningar för både FM-färgämnen som fungerar i olika filamentösa svamparter avbildas i figur 1b. Tekniska begränsningar av tillgänglig utrustning eller särskilda cellulära och experimentella förhållanden, såsom odlingsmedium, pH eller temperatur, kan dock kräva vissa anpassningar. Lyckligtvis, FM färgämnen fungerar över ett brett spektralområde, och mycket bra bildresultat uppnås genom spännande FM 1-43 med 514 nm eller FM 4-64 med 488 nm. Därför måste de optimala bildinställningarna bestämmas individuellt för varje prov typ och avsedd tillämpning.
Den avsevärda Stoke förskjutning av mer än 135 Nm i FM 4-64 tillåter utmärkt, samtidig Co-avbildning med fluoroforer avger grönt ljus; detta utnyttjas ofta för att utvärdera den intracellulära lokalisering dynamik av grönt fluorescerande protein (GFP)-märkta fusions proteiner i förhållande till plasmamembranet och den rutt vägen9,20.
Cell Wall-selektiva färgämnen Calcofluor White M2R (CFW), även marknadsförs som fluorescerande Brightener 28, är förmodligen den mest kända fluorescerande färgämne som används för att färga cellväggarna av bakterier, svampar, alger, högre växter och insekter. Inledningsvis används som optisk Whitening agent i papper, textil-och tvättmedel industrin, dess fördelar för den kliniska diagnosen av svampinfektioner realiserades tidigt21,22. Eftersom CFW intercalates oåterkalleligt i begynnande Chitinen kedjan det stör normal Chitinen microfibril församling under cellväggen biogenes därigenom generera cell Wall stress23. Detta i sin tur utlöser en cell vägg skador reparationsmekanism som leder till lokalt förhöjd cellvägg deposition som ett resultat av glukan och Chitinen syntas aktiveringen24,25. Detta fenomen kan inträffa med någon färg som fungerar genom stabilt bindande för cellväggen polymerer, är koncentrationsberoende och är mest märkbar vid hyphal tips som representerar de mest produktiva växande och därmed känsligaste delarna av mycel (figur 3). En omfattande sammanfattning av den molekylära maskiner som reagerar på skador cellväggen har nyligen lämnats26.
Överdoserat färgämne i kombination med fototoxicitet kan leda till snabb cell Lys av hyphal fack (film 1). Icke desto mindre, ökad känslighet för färgämnes koncentrationer som är "vitala" i den vilda typen kan utnyttjas för att identifiera defekter i cellväggen biosyntes av gen förlust av funktion mutanter9. För CFW och Kongo-Brazzaville (CR), en annan textilfärg ämne även känd som Direct Red 28 och anställd som α-och β-Chitinen-specifik cell vägg fläcken för svampar och insekter27,28, tröskelkoncentrationer som starkt inducerar chitinsynthaser har fastställts med > 60 μm CFW och > 70 μm CR, medan koncentrationer <15 μm av antingen färg inte förändrar eller hämmar svamp tillväxt29,30,31. Hickey et al. placerade denna tröskelkoncentration för CFW vid 25 μM2. Därför är det tillrådligt att använda färgkoncentrationer ≤ 5 μm för att utesluta stressrelaterade artefakter och se till att använda dessa molekyler som verkligt "vitala fluorescerande färgämnen"2,32. Detta gäller lika för Solophenyl Flavine 7GFE 500 (SPF) och Pontamine fast Scarlet 4B (PFS), synonymt med direkt gul 86 och direkt röd 23, respektive, två andra användbara cellväggen färgämnen vars ansökan om svampar har rapporterats för första gången mer än ett decennium sedan33. Men trots deras anmärkningsvärda spektralegenskaper34,35, har användningen av båda färgerna sedan dess varit mycket begränsad36,37. Som tidigare visats för 1,5 μM CFW2, 2 μm SPF är tillräckliga för att lösa cellväggen dynamik under inhemska förhållanden med mycket hög temporala upplösning (film 2). Samma resultat kan erhållas med 2 μM CR eller PFS.
Tillsammans består dessa fyra färgämnen, CFW, SPF, PFS och CR, av en uppsättning cell Väggs selektiva fluorescerande markörer som täcker nästan hela synligt ljusspektrum (400 – 700 nm) som används på moderna fluorescerande Mikroskop (figur 4). Den signifikanta ökningen av fluorescensintensiteten vid bindning till cell Väggs polymerer är inneboende i alla fyra och genererar utmärkta S/N-nyckeltal. Detta i sin tur tillstånd att hålla färgämnes koncentrationer och excitation ljusintensitet mycket låg och gör det möjligt att utföra cellväggen färgning som "låg dos" Live-cell Imaging Technique2. Eftersom dessa cellväggen färgämnen är plasmamembran impermeable, de fungerar samtidigt som levande/döda fläckar. På grund av deras extremt breda utsläpps ljusspektrum måste vissa begränsningar i fråga om Co-Imaging-egenskaperna hos CFW och SPF med andra fluoroforer noga övervägas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BRAND cell counting chamber</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR718005</td>
			<td>Thoma format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White M2R</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3543</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td>water immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD07602</td>
			<td>water immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo Red</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6277</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>8,36,73,230</td>
			<td>organic solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 1-43</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6814</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6689</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>Rettberg</td>
			<td>1340691030</td>
			<td>3 mm glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BB02400600A113MNT0</td>
			<td>24 x 60 # 1 glass cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506353</td>
			<td>glycerol immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 Meta</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Minimal Medium</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td>generic fungal growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-slide 8-well</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>ibiTreat #1.5 polymer coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>polyester filtration material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>8,21,472</td>
			<td>92 x 16 mm culture dish w/o cams</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td>transparent gelling agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440762-9904-000</td>
			<td>oil immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pontamine Fast Scarlet 4B</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>212490</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>213400</td>
			<td>fungal growth medium for T. atroviride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Broth (PDB)</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>254920</td>
			<td>fungal growth medium for T. atroviride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706</td>
			<td>1.5 mL SafeSeal tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>5518016</td>
			<td>Cutfix sterile scalpel #23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>6,25,54,502</td>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solophenyl Flavine 7GFE 500</td>
			<td>CIBA</td>
			<td>1485385V6</td>
			<td>cell wall dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynaptoGreen C4</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>70020</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynaptoRed C2</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>70021</td>
			<td>membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe membrane filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>723-9945</td>
			<td>0.45 &#181;m SFCA syringe filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td>Leica</td>
			<td>custom configuration</td>
			<td>inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vogel&#39;s Minimal Medium (VMM)</td>
			<td>FGSC</td>
			<td>Fungal Genetics Stock Centre</td>
			<td>fungal growth medium for N. crassa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging of filamentous fungi

Tillämpningen av membran och cellvägg selektiva fluorescerande färgämnen för levande cell Imaging analyser av organell dynamik i svampceller startade för två decennier sedan och sedan dess fortsätter att bidra kraftigt till vår förståelse av trådformiga svamp Livsstil. Detta papper ger en praktisk vägledning för utnyttjande av de två membran färgämnen FM 1-43 och FM 4-64 och de fyra cellväggen fläckar Calcofluor vit M2R, Solofenyl Flavine 7GFE 500, Pontamin snabb Scarlet 48 och kongorött. Fokus ligger på deras lågdos applikation för att fastställa artefakter-fri färgning, deras co-Imaging egenskaper, och deras kvantitativa utvärdering. De presenterade metoderna är tillämpliga på alla filamentösa svamp prov som kan förberedas på de beskrivna sätten. De grundläggande infärgnings metoderna kan tjäna som utgångspunkt för anpassningar till arter som kan kräva olika odlingsförhållanden. Första, biofysiska och biokemiska egenskaper granskas eftersom deras förståelse är avgörande för att använda dessa färgämnen som verkligt viktiga fluorescerande fläckar. För det andra, steg-för-steg-protokoll presenteras som detalj utarbetandet av olika svamp provtyper för fluorescerande levande cell avbildning. Slutligen illustrerar exempel experiment olika metoder för att: (1) identifiera defekter i den spatiala-temporal organisationen av endocytos i genetiska mutanter, (2) jämförelsevis karakterisera delad och distinkt samlokalisering av GFP-märkta målproteiner i den endocytiska vägen, (3) identifiera morfogenetiska cellvägg defekter i en genetisk Mutant, och (4) Monitor cell Wall biogenes i realtid.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi at JoVE.com

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

Vitala fluorescerande färgämnen är viktiga verktyg för levande-cell Imaging analyser i modern svamp cellbiologi. Detta papper Detaljer tillämpningen av etablerade och mindre kända fluorescerande färgämnen för att spåra plasmamembran dynamik, endo-/exocytos och cellvägg morfogenes i trådformiga svampar.

Applicering av membran och cellvägg selektiva fluorescerande färgämnen för levande cell avbildning av trådformiga svampar

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

Membran och cellvägg selektiv fluorescerande färgämnen är viktiga verktyg för analys av organelldynamik och levande svampceller. Våra protokoll ger väsentliga teoretiska bakgrund och praktiska riktlinjer för tillämpningen av ett urval av dessa färgämnen som verkligt vitala fläckar. Den viktigaste punkten för detta är att använda mycket låga färgämne koncentrationer som inte orsakar cellulära artefakter relaterade till mättnad eller färgämne toxicitet samtidigt som goda signal till brus nyckeltal för hög kvalitet, långsiktiga levande cell avbildning.Med kollegor från institutionen för nukleärmedicin vid det medicinska universitetet, använde vi nyligen dessa färgning tekniker för att utveckla en ny metod för bild-guidad diagnos av aapergillos. Förmågan att övervaka membran och cell vägg strukturer i realtid var avgörande för att bestämma upptagningsdynamiken i den experimentella läkemedelsföreningen. För att börja detta förfarande, först erhålla en beredd prekultur.Använd en steril skalpell för att skära ett litet agarblock som bär icke-sporulerande mycel från kolonikanten av förkulturen. Placera agarblocket i mitten av en fräsch, fast medeltallrik för att inokulera den experimentella kulturen. Inkubera den experimentella kulturen enligt utvecklingsstadiet som är avsett att inkuberas.Provförberedelse är något delikat och optimering av bild förvärv inställningar är ganska komplex. Visuell demonstration av båda förfarandena tillsammans med verbal förklaring underlättar kraftigt replikerbarhet. För att montera proverna, hålla en ren 24 av 60 millimeter glaslock slip redo och tillsätt 18 mikroliter av vätska minimal medium eller fysiologiska saltlösning på mitten.Tillsätt två mikroliter av den förberedda 20 mikromolarfärgen arbetslösning till vätskan i mitten av locket slip och blanda väl genom pipettering upp och ner flera gånger samtidigt som man undviker produktion av luftbubblor. Med hjälp av en ren skalpell, skär ut en 15 av 15 millimeter prov från periferin av kolonin och placera den vertikalt bredvid mediet droppe på omslaget slip. Använd skalpellen för att stödja blockets övre kant och ett finger för att hålla den bakre sidan av blocket på plats.Sänk sedan långsamt den sida som bär mycelen på vätskan. Montera det beredda provet på mikroskopstadiet. Justera först de grundläggande inställningarna för bildförvärv för att fånga upp stående dynamik i individuell hyfer enligt textprotokollet.För endocytosupptagsanalyserna, konsultera figur ett och tabell ett av textprotokollet för att identifiera de bästa excitations- och emissionsinställningarna för FM 143 eller FM 464 som finns på mikroskopisystemet och justera dessa inställningar i systemet i enlighet med detta. Starta bildinspelning med hjälp av de tidigare justerade inställningarna och utvärdera resultatet. Sedan optimera bilden förvärv inställningar till den rumsliga och tidsmässiga upplösning som krävs för att fånga aspekten av plasmamembran eller endocytos dynamik experimentet är inriktat på.För cellväggsdynamik, konsultera figur fyra och tabell ett av textprotokollet för att identifiera de bästa excitation och utsläppsinställningarna för det tillämpade cellväggsfärgämnet och justera inställningarna på mikroskopisystemet i enlighet med detta. Starta bildinspelning med hjälp av de tidigare justerade inställningarna och utvärdera resultatet. Sedan, optimera bilden förvärv inställningar till den rumsliga och tidsmässiga upplösning som krävs för att fånga aspekten av cellvägg morfogenes experimentet är inriktat på.Förutom att bara visualisera cellulära processer, tillåter live cell imaging utvinning av kvantitativ information från de registrerade data. I ett exempel på upptagningsanalyserna FM 464 odlas svampprover som kolonier och monteras av den inverterade agarblockmetoden. Analyserna identifierade defekter i spatio-tidsmässiga organisationen av endocytos i genen borttagning och gen över-uttrycker mutanter av svamp specifika proteinet SFP 2 av trichoderma atroviride.Exempel på FM 464 co-färgning av fluorescerande fusionsproteiner riktade till endocytiska fack visas här. Denna co-färgning är anställd för att relatera subcellulära fördelningen av de två förbättrade gröna fluorescerande protein taggade transmembrane proteiner, SFP 2 och GPR 1, till endocytic utbildningsavsnittet i trichoderma atroviride. Ett exempel på FM 464 co-färgning för identifiering av morfogogenetiska skillnader visar att denna co-färgning tillåter ytterligare relation av subcellulära lokalisering dynamiken i flourescently märkt BUD-6 polarism komplext protein till slutet av vissa trafficking-beroende processer såsom bildandet av septa och polariserad hyphal spets tillväxt.Det kännetecknar också skillnader i subcellulär organisation och hyphal arkitektur mellan vild typ och mutanta stammar av neurospora crassa. Representativ cell vägg färgning visar att de olika interaktionsegenskaperna hos calcofluor vit, solofenyl flavine och kongorött med cellväggens polymerer belysa morfogetiska skillnader mellan delta SFP 2 mutant och vild typ stam av trichoderma atroviride. Öka cellväggen stress som orsakas av förhöjda färgämne koncentrationer sker snabbare och är mer uttalad i mutanten jämfört med vildtyp.Dessutom samma bilder möjliggör kvantifiering av morfogenetiska skillnader avseende hyphal diameter och septal avstånd mellan båda stammarna. Representativ realtime övervakning av cellväggen biosyntesen indikerar att den mycket låga calcofluor vit koncentration förhindrar mättnad av cellväggen med färgämne molekyler och tillåter kvantitativa realtime övervakning av cellväggen biosyntes. Detta avslöjar att nedfallet av nya cellvägg material är inte enhetlig, men svarar mycket snabbt på lokaliserade fysiska påfrestningar som följer av den relativa förskjutningen av en cell på cell-till-cell fastsättning före dermalinfusion i neurospora crassa.Mindre är mer. Använd så lite färgämne som möjligt för att hindra störningar av fluorescerande markör med cellulära processer. Efter detta förfarande, flourescence återvinning efter foto-blekning experiment kunde utföras för att kvantifiera transport och biogenes kinetik.Den banbrytande introduktionen av membran och cellvägg färgning i fintrådiga svampar i början av årtusendet gjorde bokstavligen revolutionera hur vi ser på svampar. Calcofluor vit kan orsaka ögonirritationer och är en klassificerad cancerigen. Kongorött är cancerigen och teratogent, så använd ögon- och hudskydd när du hanterar dessa färgämnen.

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Märkning stamceller med fluorescerande färger för icke-invasiv Detection med optisk avbildning

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Selektiv Märkning av proteiner på cellernas ytor med hjälp av CyDye Dige Fluor Minimal Färgämnen

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Levande cell imaging av F-aktin Dynamics via Fluorescent Speckle Mikroskopi (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Fluorescerande märkning av COS-7 uttrycka SNAP-tagg fusionsproteiner för levande cell imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Levande cell imaging av Early autophagy Evenemang: Omegasomes och Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravital Mikroskopi för Imaging subcellulära strukturer i levande möss som uttrycker fluorescerande proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G-protein-selektiva GPCR konforma mäts med hjälp av FRET sensorer i en levande cell Suspension Fluorometer analys

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studera Protein system för kvalitetskontroll<em&gt; D. discoideum</em&gt; Använda Temperaturstyrd levande cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Live-cellbildning av blodplättdiplanering och utsöndring under flöde

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Superupplösning Live Cell Imaging av subcellulära strukturer

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...