Name: quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry
Uploaded: 2020-03-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

ونحن ممتنون للأعضاء الحاليين والسابقين في مختبر تيتورينكو لإجراء المناقشات. ونحن نقدر مركز التطبيقات البيولوجية للقياس الطيفي الكتلي ومركز الجينوم الهيكلي والوظيفي (وكلاهما في جامعة كونكورديا) على الخدمات المتميزة. تم دعم هذه الدراسة من خلال منح من مجلس البحوث الطبيعية والهندسية (NSERC) في كندا (RGPIN 2014-04482) وصندوق كرسي جامعة كونكورديا (CC0113). وحاز ك. م. على دعم من جائزة الجدارة في جامعة كونكورديا.

1. إعداد وسائل الإعلام العقيمة لعبادة الخميرة
<ol><li>إعداد 90 مل من وسط YP كاملة تحتوي على 1٪ (ث / v) استخراج الخميرة و 2٪ (ث / v) bactopeptone.</li>
	<li>إعداد 90 مل من متوسط YNB الاصطناعية الحد الأدنى التي تحتوي على 0.67٪ (ث / v) قاعدة النيتروجين الخميرة دون الأحماض الأمينية، 20 ملغ / لتر-الهستيدين، 30 ملغ / لتر</e...

<ol>
	<li>Bou Khalil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+era:+accomplishments+and+challenges.">Lipidomics era: accomplishments and challenges.</a> Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).</li><li>Shevchenko, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+coming+to+grips+with+lipid+diversity.">Lipidomics: coming to grips with lipid diversity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).</li><li>Br&#252;gger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+analysis+of+the+lipid+composition+of+cells+and+subcellular+organelles+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).</li><li>Zechner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAT+SIGNALS+-+lipases+and+lipolysis+in+lipid+metabolism+and+signaling.">FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling.</a> Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).</li><li>Eisenberg, T., B&#252;ttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+and+cell+death+in+yeast.">Lipids and cell death in yeast.</a> FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).</li><li>Richard, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+liponecrosis,+a+distinct+mode+of+programmed+cell+death.">Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death.</a> Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).</li><li>Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+the+discovery+of+anti-tumor+pharmaceuticals:+searching+for+activators+of+liponecrosis.">A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis.</a> Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).</li><li>M&#229;rtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+lipids+on+mitochondrial+functions.">Effects of lipids on mitochondrial functions.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).</li><li>Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-bilayer+phospholipids+in+mitochondrial+structure+and+function.">The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function.</a> FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).</li><li>Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+membrane+turnover+by+phosphatidic+acid:+cellular+functions+and+disease+implications.">Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).</li><li>Goldberg, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+of+lipid+droplets+in+regulating+longevity.">A novel function of lipid droplets in regulating longevity.</a> Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).</li><li>Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obese+and+anorexic+yeasts:+experimental+models+to+understand+the+metabolic+syndrome+and+lipotoxicity.">Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).</li><li>Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+metabolism+and+cellular+aging.">Peroxisome metabolism and cellular aging.</a> Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).</li><li>Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+regulation+of+glycerolipids+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).</li><li>Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+peroxisomes:+key+players+in+cellular+lipid+homeostasis+or+a+matter+of+fat--store+'em+up+or+burn+'em+down.">Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down.</a> Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).</li><li>Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+topology+and+regulation+of+cardiolipin+biosynthesis+and+remodeling+in+yeast.">The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).</li><li>Dimmer, K. S., Rapaport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+contact+sites+as+platforms+for+phospholipid+exchange.">Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).</li><li>Csord&#225;s, G., Weaver, D., Hajn&#243;czky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contactology:+structure+and+signaling+functions.">Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions.</a> Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).</li><li>Mitrofanova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+and+transport+define+longevity+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).</li><li>Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+contact+zones+as+sites+for+lipid+transfer.">Organelle contact zones as sites for lipid transfer.</a> Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).</li><li>Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).</li><li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast:+an+experimental+organism+for+21st+Century+biology.">Yeast: an experimental organism for 21st Century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li><li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+for+budding+geneticists:+a+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system.">Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li><li>Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+surrogate+and+chemical+genetics+in+model+organisms+can+suggest+therapies+for+human+genetic+diseases.">How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases.</a> Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).</li><li>Zimmermann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+tool+to+identify+anti-aging+compounds.">Yeast as a tool to identify anti-aging compounds.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).</li><li>Ejsing, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+yeast+lipidome+by+quantitative+shotgun+mass+spectrometry.">Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).</li><li>Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+lipid+analysis+and+quantification+by+mass+spectrometry.">Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry.</a> Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).</li><li>Guan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+membrane+lipidomics+during+Drosophila+development.">Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development.</a> Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).</li><li>Klose, C., Tarasov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+yeast+lipids+by+shotgun+lipidomics.">Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).</li><li>Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+advances+in+shotgun+lipidomics+for+biology+and+medicine.">Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine.</a> Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).</li><li>Sud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMSD:+LIPID+MAPS+structure+database.">LMSD: LIPID MAPS structure database.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).</li><li>Pauling, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposal+for+a+common+nomenclature+for+fragment+ions+in+mass+spectra+of+lipids.">Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids.</a> PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).</li></ol>

الاحتياطات التالية مهمة للتنفيذ الناجح للبروتوكول الموصوف هنا:
1. الكلوروفورم والميثانول سامة. أنها استخراج بكفاءة مواد مختلفة من الأسطح، بما في ذلك البلاستيك المختبري ة وبشرتك. لذلك ، تعامل مع هذه المذيبات العضوية بحذر عن طريق تجنب استخدام البلاستيك في الخطوات التي تنطوي ...

تشير مجموعة من الأدلة إلى أن الدهون ، وهي واحدة من الفئات الرئيسية للجزيئات الحيوية ، تلعب أدوارًا أساسية في العديد من العمليات الحيوية داخل خلية eukaryotic. وتشمل هذه العمليات تجميع ثنائيات الدهون التي تشكل غشاء البلازما والأغشية المحيطة العضيات الخلوية، ونقل جزيئات صغيرة عبر أغشية الخلايا، والاستجابة للتغيرات في البيئة خارج الخلية ونقل إشارة داخل الخلايا، وتوليد وتخزين الطاقة، واستيراد وتصدير البروتينات تقتصر على العضيات المختلفة، والاتجار بالمركبات من البروتينات داخل نظام الغشاء الداخلي وإفراز البروتين، وعدة طرق من موت الخلية المنظمة1 ،2،3،4،5،6،7،8،9،10.
الخميرة الناشئة S. cerevisiae، كائن eukaryotic وحيدة الخلية ، وقد استخدمت بنجاح للكشف عن بعض الآليات الكامنة وراء الأدوار الأساسية للدهون في هذه العمليات الخلوية الحيوية4،5،6،7،8،9،10،11،12،13،14،15 ،16،17،18،19،20. S. cerevisiae هو كائن حي نموذجي قيم للكشف عن هذه الآليات لأنه قابل للتحليلات الشاملة الكيميائية الحيوية والوراثية والخلايا البيولوجية والبيولوجية الكيميائية والبيولوجية النظامية والدقيقة السوائل تشريحالتحاليل 21،22،23،24،25. مزيد من التقدم في آليات فهم الدهون التي من خلالها التمثيل الغذائي للدهون والنقل داخل الخلايا المساهمة في هذه العمليات الخلوية الحيوية يتطلب تقنيات قياس الطيف الكتلي الحساسة للتوصيف الكميللدهون الخلوية، وفهم التعقيد الجزيئي للدهون، ودمج الدهون الكمية في منصة متعددة التخصصات للأنظمة البيولوجيا1،2،3،26، 27،28،29،30.
الأساليب الحالية لقياس الطيف الكتلي بمساعدة الدهون الكمية من خلايا الخميرة وخلايا الكائنات الحية eukaryotic الأخرى ليست متعددة بما فيه الكفاية، قوية، أو حساسة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الأساليب المستخدمة حاليا غير قادرة على التمييز بين مختلف أنواع الدهون الأيزوباروية أو الأيزوميريك ية عن بعضها البعض. هنا نصف طريقة متعددة الاستخدامات وقوية وحساسة تسمح باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادفي (LC-MS/MS) للتحليل الكمي للدهون الخلوية الرئيسية لـ S. cerevisiae.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>05-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>60180A-SV9-1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A9554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 series LC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1312A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent1100 Wellplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1367A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A470-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiolipin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>750332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centra CL2 clinical centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramide</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C297-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSH C18 VanGuard</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006944</td>
			<td>Pre-column system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free fatty acid (19:0)</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (acid-washed, 425-600 &#956;M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Search software (V4.1)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V4.1</td>
			<td>LC-MS/MS analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylglycerol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylserine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse-phase column CSH C18</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingosine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Orbitrap Velos MS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ETD-10600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricylglycerol</td>
			<td>Larodan, Malmo</td>
			<td>TAG Mixed FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0919-15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strain BY4742</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>YSC1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

الدهون هي جزيئات أمفيباثيك متنوعة هيكليا التي هي غير قابلة للذوبان في الماء. الدهون هي المساهمين الأساسيين في تنظيم وظيفة الأغشية البيولوجية، وتخزين الطاقة والإنتاج، والإشارات الخلوية، والنقل المركبات من البروتينات، والتكوين الحيوي organelle، والموت الخلايا المنظمة. لأن الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae هو eukaryote أحادي الخلية قابلة للتحليلات الجزيئية الشاملة، وساعد استخدامه ككائن حي نموذجي في الكشف عن آليات ربط استقلاب الدهون والنقل داخل الخلايا إلى العمليات البيولوجية المعقدة داخل الخلايا eukaryotic. إن توفر طريقة تحليلية متعددة الاستخدامات للتقييم الكمي القوي والحساس والدقيق للفئات الرئيسية من الدهون داخل خلية الخميرة أمر بالغ الأهمية للحصول على رؤى عميقة في هذه الآليات. هنا نقدم بروتوكولا لاستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي المترادف (LC-MS/MS) للتحليل الكمي للدهون الخلوية الرئيسية لـ S. cerevisiae. طريقة LC-MS/MS الموصوفة متعددة الاستخدامات وقوية. وهو يتيح تحديد وقياس كمية العديد من الأنواع (بما في ذلك أشكال مختلفة من الايزوباريك أو الايزوميري) داخل كل فئة من فئات الدهون العشرة. وهذه الطريقة حساسة وتسمح بتحديد وكمية بعض أنواع الدهون بتركيزات منخفضة إلى 0.2 pmol/μL. وقد تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح لتقييم الدهون من خلايا الخميرة الكاملة والعضيات المنقى. ويمكن أن يؤدي استخدام إضافات المرحلة المتنقلة البديلة لقياس الطيف الكتلي للرذاذ الكهربائي في هذه الطريقة إلى زيادة كفاءة التأيين بالنسبة لبعض أنواع الدهون، وبالتالي يمكن استخدامه لتحسين تحديدها وكميتها.

كانت طريقتنا للتقييم الكمي للدهون الخلوية الرئيسية داخل خلية الخميرة بمساعدة LC-MS/MS متعددة الاستخدامات وقوية. سمح لنا لتحديد وتحديد كمية 10 فئات الدهون المختلفة في S. cerevisiae الخلايا المستزرعة في المتوسط الاصطناعية الحد الأدنى YNB التي تحتوي في البداية 2٪ الجلوكوز. وتشمل ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

نقدم بروتوكولا باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب لتحديد وقياس الدهون الخلوية الرئيسية في saccharomyces cerevisiae. الطريقة الموصوفة للتقييم الكمي لفئات الدهون الرئيسية داخل خلية الخميرة متعددة الاستخدامات وقوية وحساسة.

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

يوفر هذا البروتوكول طريقة دقيقة وقابلة للتكرار لتحديد كمي عشر فئات مختلفة من الدهون من Saccharomyces cerevisiae باستخدام طريقة استخراج واحدة وطريقة واحدة LC-MS. هذه الطريقة تسمح الكشف عن و كمية الأنواع الدهنية الأيوبريكية و isomeric لها خصائص كيميائية وفيزيائية مختلفة. لثقافة Saccharomyces cerevisiae، أولا إضافة 5 مل من محلول مخزون الجلوكوز 20٪ العقيمة لكل من اثنين من قارورة إرلينميير التي تحتوي على وسيط YNB العقيمة إلى تركيز نهائي من 2٪ الجلوكوز.ثم، استخدام ماصة معقمة لنقل حجم من ثقافة الخميرة بين عشية وضحاها تحتوي على خمسة أضعاف عشرة إلى خلايا الخميرة السابعة في كل قارورة والثقافة القارورة لمدة 24 ساعة على الأقل في 30 درجة مئوية مع اهتزاز التناوب في 200 الثورات في الدقيقة الواحدة. لاستخراج الدهون، وتحديد العدد الإجمالي للخلايا الخميرة لكل ملليلتر من الثقافة ونقل خمسة أضعاف عشرة إلى الخلايا السابعة في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. إضافة الجليد الباردة نانو نقية المياه لتحقيق حجم يصل إلى 15 مل وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.إعادة تعليق بيليه الخميرة في 15 مل من الجليد البارد ايزو منشط بيكربونات العازلة للطرد المركزي الثاني وإعادة تعليق بيليه في 1.5 مل من الجليد الطازج الباردة الأمونيوم بيكربونات الحل. في نهاية الطرد المركزي، وتخزين بيليه في 80 درجة مئوية حتى استخراج. لبدء استخراج الدهون، ذوبان بيليه الخلية على الجليد قبل إعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولترات من الماء البارد نانو نقية الجليد.في غطاء الدخان، ونقل تعليق الخلية إلى 15 مل، وارتفاع قوة الزجاج، المسمار أعلى أنبوب الطرد المركزي مع غطاء مبطنة polytetraflufluoroethylene وإضافة 25 ميكرولترات من خليط معايير الدهون الداخلية، أعدت في 2:1 الميثانول الكلوروفورم. 100 ميكرولتر من 425 إلى 600 حمض micromolar غسلها الخرز الزجاجي و 600 ميكرولترات من الميثانول الكلوروفورم 17:1 إلى الأنبوب. دوامة الأنبوب بسرعة عالية لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتعطيل الخلايا.تليها دوامة لمدة ساعة واحدة في سرعة منخفضة في درجة حرارة الغرفة لتسهيل استخراج الدهون. في نهاية الاستخراج، احتضان العينة لمدة 15 دقيقة على الجليد، لتعزيز هطول البروتين وفصل مراحل مائي وعضوية. في نهاية الحضانة، الطرد المركزي العينة إلى مزيد من فصل المرحلة العليا مائي من المرحلة العضوية السفلى، و, في غطاء الدخان, استخدام ماصة الزجاج البوروسيليات لنقل المرحلة العضوية السفلى إلى جديد 15 مل الزجاج عالية القوة برغي أنبوب أعلى الطرد المركزي مع غطاء مبطنة البوليتيتروفلورا.ضع المرحلة العضوية السفلية تحت تدفق غاز النيتروجين، وفي غطاء الدخان، أضف 300 ميكرولترات من خليط الميثانول الكلوروفورم 2:1 إلى المرحلة مائي العليا المتبقية. لتسهيل فوسفاتيديكازيليسيني، فوسفاتيديلسرين، فوسفاتيديلينوسيتول والقلب والدهون استخراج دوامة الأنبوب بقوة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل الطرد المركزي للعينة. استخدام ماصة زجاجية البورسليكات لنقل المرحلة العضوية السفلى إلى المرحلة العضوية السفلى تحت النيتروجين وتتبخر المذيبات في المراحل العضوية مجتمعة في غطاء محرك الدخان.ثم، إغلاق أنابيب من فيلم الدهون تحت تدفق غاز النيتروجين وتخزين العينات في 80 درجة مئوية. بالنسبة لكلورية اللونية السائلة، فصل الدهون المستخرجة عند 500 ميكرولترات من 63:35:5 أسيتو-نيتريل-2-بروبانول نانو نقية خليط المياه إلى أنبوب من الدهون ولفيلم دوامة ثلاث مرات لمدة عشر ثوان في دوامة في درجة حرارة الغرفة. تخضع محتويات الأنبوب لصوتينيشن بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة قبل دوامة الأنبوب ثلاث مرات لمدة عشر ثوان في دوامة كما هو موضح للتو.نقل 100 ميكرولترers من العينة في قارورة الزجاج مع إدراج تستخدم ل24 لوحة جيدا والقضاء على أي فقاعات داخل إدراج. ضع الإدراج في بئر واحد من 24 بئراً وحمّل عمود CSH في المرحلة العكسية C18 مقروناً بعمود ما قبلي في نظام الكروماتوغرافيا السائل. تعيين درجة حرارة العمود إلى 55 درجة مئوية وتدفق إلى 300 ميكرولترس في الدقيقة الواحدة.عندما يتم تعيين كافة المعلمات، قم بتحميل عشرة ميكرولترات من استخراج فارغة قبل تحميل العينة الأولى. ثم، فصل الأنواع الدهنية المختلفة باستخدام التدرج اللوني السائل، كما هو مبين. سيتم إنشاء مخطط كروماتوات مجموع تمثيلي من بيانات LC-MS للدهون المستخرجة من الخلايا.بالنسبة للتحليل الطيفي الكتلي للدهون المستخرجة، قم بتحميل العينات على مطياف الكتلة المجهز بمصدر أيونات كهربائي ساخن، وحدد معلمات التحليل كما هو موضح في الجدول. استخدم محلل فورييه Transform Analyzer للكشف عن الأيونات الأصلية لـ MS-1 بدقة 60,000 وضمن النطاق الشامل للدالتون 150-2000. ثم، الكشف عن الأيونات الثانوية MS-2 باستخدام الإعدادات كما هو مبين في الجدول.لتحديد وقياس الدهون المختلفة من ملفات LC-MS ذات الترادف العريض، ابحث في الملفات الخام LC-MS التي تحتوي على بيانات مسح كامل MS-1 وبيانات MS-2 المعتمدة للحصول على أحماض دهنية مجانية غير مُستَهدَرة، القلب والدهون، phytocerimide، phytosphyngocene، فوسفاتيديلكولين، فوسفاتيديليهولامين، phosphatydlglycerol، فوسفاتيتيدلينوليول، فوسفاتيدلسينوسيل وtriacylgcerol فئات الدهون باستخدام كتلة مقسمة على تحمل خمسة أجزاء في المليون للأيونات السلائف وعشرة أجزاء في المليون لليونات المنتج. ثم، اتبع الإرشادات الواردة في دليل المستخدم البرمجيات لتحديد معايير الدهون الداخلية وأنواع الدهون مع تكوينات الأحماض الدهنية غير عادية. هذه الطريقة الحساسة LC-MS الترادف تمكن من تحديد و كمية الأنواع الجزيئية من الدهون بتركيزات منخفضة إلى 0.165 picomolar لكل ميكرولتر.هذا الحد من القياس الكمي يختلف عن فئات الدهون المختلفة ضمن مجموعة واسعة من التركيزات. ويمكن استخدام هذه الطريقة لزيادة كفاءة التأين للدهون باستخدام إضافات المرحلة المتنقلة البديلة لقياس الطيف الكتلي المؤين للرذاذ الكهربائي. ويمكن استخدام كل من هذه الإضافات المرحلة المتنقلة البديلة لكل من المرحلة العادية وأعمدة LC المرحلة العكسية.طريقة التفكيك الناجم عن الاصطدام مفيدة إذا استخدمت في تركيبة مع الأمونيوم المحمول خلات المرحلة المضافة لرش الكهربائية الوضع السلبي للتجريف الطيفي الشامل، كما، في ظل هذه الظروف، فإنه يسمح بزيادة في كفاءة تجزئة الدهون MS-1 إلى منتجات MS-2. في المقابل، فإن الطاقة العالية، وطريقة انفصال تصادمي مواتية إذا استخدمت في تركيبة مع الأمونيوم formate المحمول المرحلة المضافة لوسيلة إيجابية التيونية الكهربائية من القياس الطيفي الشامل كما في ظل هذه الظروف، فإنه يتيح زيادة في كفاءة تجزئة الدهون MS-1 في منتجات MS-2. لا تخلط المراحل أثناء جمع المرحلة العضوية.إغلاق الأنابيب تحت تدفق غاز النيتروجين. القضاء على أي فقاعة داخل إدراج وربط العمود في الاتجاه الصحيح. إذا كان لا يمكن تحديد هوية أي قمة بواسطة LC-MS، يمكن استخدام MS-NMR لاستنتاج بنية هذا الجزيء.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

النهج القائم على الطيف، جنبا إلى جنب السائل اللوني الكتلة لتحليل المستقلب من<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

الدهون عزل القطرة عن التحليل الكمي الطيف الكتلي

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Glycoproteomics من مصفوفة خارج الخلية: منهج في تحليل سكري سليمة عن طريق قياس الطيف الكتلي

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

التنميط البروتين العميق بوسم إيسوباريك وواسعة النطاق اللوني السائل والطيف الكتلي وساعدت برامج القياس الكمي

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

تحديد فوسفات الإينوزيتول أو فوسفوينوسيتيد التفاعل البروتينات عن طريق الكروماتوغرافيا التقارب إلى جانب اللطخة الغربية أو قياس الطيف الكتلي

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

التحديد الكمي المطلق لاستقلاب تخليق البروتين الخالي من الخلايا بواسطة الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

تحليل الموجات الاختزالية السائلة غير المستهدفة - قياس الطيف الشامل - Metabolomics من حبوب القمح

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...