Name: quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry
Uploaded: 2020-03-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

Vi er taknemmelige over for nuværende og tidligere medlemmer af Titorenko-laboratoriet for drøftelser. Vi anerkender Center for Biologisk Anvendelse af Massespektrometri og Center for Strukturel og Funktionel Genomics (begge på Concordia University) for fremragende ydelser. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) i Canada (RGPIN 2014-04482) og Concordia University Chair Fund (CC0113). K.M. blev støttet af Concordia University Merit Award.

1. Forberedelse af sterile medier til dyrkning gær
<ol><li>Der fremstilles 90 ml af et komplet YP-medie, der indeholder 1% (w/v) gærekstrakt og 2% (w/v) bactopeptone.</li>
	<li>Der fremstilles 90 ml af et syntetisk minimalt YNB-medium, der indeholder 0,67% (w/v) nitrogenbase uden aminosyrer, 20 mg/l L-histidin, 30 mg/l L-leucin, 30 mg/l L-lysin og 20 mg/l uracil.</li>
	<li>Opdel 90 ml af det komplette YP-medium ligeligt i to 250 ml Erlenmeyerkolber (dvs. 45 ml hver).</li>
	<li>Opdel 90 ml a...

<ol>
	<li>Bou Khalil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+era:+accomplishments+and+challenges.">Lipidomics era: accomplishments and challenges.</a> Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).</li><li>Shevchenko, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+coming+to+grips+with+lipid+diversity.">Lipidomics: coming to grips with lipid diversity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).</li><li>Br&#252;gger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+analysis+of+the+lipid+composition+of+cells+and+subcellular+organelles+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).</li><li>Zechner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAT+SIGNALS+-+lipases+and+lipolysis+in+lipid+metabolism+and+signaling.">FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling.</a> Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).</li><li>Eisenberg, T., B&#252;ttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+and+cell+death+in+yeast.">Lipids and cell death in yeast.</a> FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).</li><li>Richard, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+liponecrosis,+a+distinct+mode+of+programmed+cell+death.">Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death.</a> Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).</li><li>Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+the+discovery+of+anti-tumor+pharmaceuticals:+searching+for+activators+of+liponecrosis.">A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis.</a> Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).</li><li>M&#229;rtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+lipids+on+mitochondrial+functions.">Effects of lipids on mitochondrial functions.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).</li><li>Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-bilayer+phospholipids+in+mitochondrial+structure+and+function.">The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function.</a> FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).</li><li>Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+membrane+turnover+by+phosphatidic+acid:+cellular+functions+and+disease+implications.">Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).</li><li>Goldberg, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+of+lipid+droplets+in+regulating+longevity.">A novel function of lipid droplets in regulating longevity.</a> Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).</li><li>Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obese+and+anorexic+yeasts:+experimental+models+to+understand+the+metabolic+syndrome+and+lipotoxicity.">Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).</li><li>Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+metabolism+and+cellular+aging.">Peroxisome metabolism and cellular aging.</a> Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).</li><li>Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+regulation+of+glycerolipids+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).</li><li>Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+peroxisomes:+key+players+in+cellular+lipid+homeostasis+or+a+matter+of+fat--store+'em+up+or+burn+'em+down.">Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down.</a> Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).</li><li>Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+topology+and+regulation+of+cardiolipin+biosynthesis+and+remodeling+in+yeast.">The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).</li><li>Dimmer, K. S., Rapaport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+contact+sites+as+platforms+for+phospholipid+exchange.">Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).</li><li>Csord&#225;s, G., Weaver, D., Hajn&#243;czky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contactology:+structure+and+signaling+functions.">Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions.</a> Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).</li><li>Mitrofanova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+and+transport+define+longevity+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).</li><li>Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+contact+zones+as+sites+for+lipid+transfer.">Organelle contact zones as sites for lipid transfer.</a> Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).</li><li>Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).</li><li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast:+an+experimental+organism+for+21st+Century+biology.">Yeast: an experimental organism for 21st Century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li><li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+for+budding+geneticists:+a+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system.">Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li><li>Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+surrogate+and+chemical+genetics+in+model+organisms+can+suggest+therapies+for+human+genetic+diseases.">How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases.</a> Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).</li><li>Zimmermann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+tool+to+identify+anti-aging+compounds.">Yeast as a tool to identify anti-aging compounds.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).</li><li>Ejsing, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+yeast+lipidome+by+quantitative+shotgun+mass+spectrometry.">Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).</li><li>Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+lipid+analysis+and+quantification+by+mass+spectrometry.">Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry.</a> Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).</li><li>Guan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+membrane+lipidomics+during+Drosophila+development.">Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development.</a> Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).</li><li>Klose, C., Tarasov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+yeast+lipids+by+shotgun+lipidomics.">Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).</li><li>Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+advances+in+shotgun+lipidomics+for+biology+and+medicine.">Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine.</a> Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).</li><li>Sud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMSD:+LIPID+MAPS+structure+database.">LMSD: LIPID MAPS structure database.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).</li><li>Pauling, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposal+for+a+common+nomenclature+for+fragment+ions+in+mass+spectra+of+lipids.">Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids.</a> PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).</li></ol>

Følgende forholdsregler er vigtige for en vellykket gennemførelse af den protokol, der er beskrevet her:
1. Chloroform og methanol er giftige. De effektivt udtrække forskellige stoffer fra overflader, herunder laboratorium plastudstyr og din hud. Derfor håndteredisse organiske opløsningsmidler med forsigtighed ved at undgå brug af plast i trin, der involverer kontakt med chloroform og / eller methanol, ved hjælp af borosilikat glas pipetter til disse trin, og skylning disse pipetter med...

En mængde beviser tyder på, at lipider, en af de store klasser af biomolekyler, spiller væsentlige roller i mange vitale processer inden for en eukaryote celle. Disse processer omfatter samling af lipid bilag, der udgør plasmamembranen og membraner omkring cellulære organeller, transport af små molekyler på tværs af cellemembraner, reaktion på ændringer i det ekstracellulære miljø og intracellulære signal transduktion, produktion og lagring af energi, import og eksport af proteiner begrænset til forskellige organeller, vesikulær handel med proteiner i endomembranen system og protein sekretion, og flere former for reguleret celledød1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Den spirende gær S. cerevisiae, en encellulær eukaryote organisme, er med succes blevet brugt til at afdække nogle af demekanismer,der ligger til grund for de væsentlige roller lipider i disse vitale cellulære processer4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae er en værdifuld model organisme til afdækning af disse mekanismer, fordi det er modtagelige for omfattende biokemiske, genetiske, cellebiologiske, kemiske biologiske, system biologiske, og mikrofluidisk dissektion analyser21,22,23,24,25. Yderligere fremskridt i forståelsen mekanismer, hvorigennem lipid metabolisme og intracellulære transport bidrager til disse vitale cellulære processer kræver følsomme masse spektrometri teknologier til kvantitativ karakterisering af cellulære lipidome, forståelse af lipidom molekylære kompleksitet, og integrere kvantitative lipidomics i en tværfaglig platform af systemer biologi1,2,3,26, 27,28,29,30.
De nuværende metoder for massespektrometriassisterede kvantitative lipidomik i gærceller og celler fra andre eukaryote organismer er ikke tilstrækkeligt alsidige, robuste eller følsomme. Desuden er disse metoder, der anvendes i øjeblikket, ikke i stand til at skelne mellem forskellige isobariske eller isomeriske lipidarter fra hinanden. Her beskriver vi en alsidig, robust og følsom metode, der tillader brug af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri (LC-MS/MS) til kvantitativ analyse af større cellulære lipider af S. cerevisiae.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>05-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>60180A-SV9-1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A9554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 series LC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1312A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent1100 Wellplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1367A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A470-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiolipin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>750332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centra CL2 clinical centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramide</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C297-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSH C18 VanGuard</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006944</td>
			<td>Pre-column system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free fatty acid (19:0)</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (acid-washed, 425-600 &#956;M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Search software (V4.1)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V4.1</td>
			<td>LC-MS/MS analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylglycerol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylserine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse-phase column CSH C18</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingosine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Orbitrap Velos MS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ETD-10600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricylglycerol</td>
			<td>Larodan, Malmo</td>
			<td>TAG Mixed FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0919-15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strain BY4742</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>YSC1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

Lipider er strukturelt forskellige ampelagiske molekyler, der er uopløselige i vand. Lipider er væsentlige bidragydere til organiseringen og funktionen af biologiske membraner, energilagring og produktion, cellulære signalering, vesikulær transport af proteiner, organelle biogenese, og reguleret celledød. Fordi den spirende gær Saccharomyces cerevisiae er en encellet eukaryote modtagelig for grundige molekylære analyser, dens anvendelse som en model organisme hjalp afdække mekanismer, der forbinder lipid metabolisme og intracellulær transport til komplekse biologiske processer i eukaryote celler. Tilgængeligheden af en alsidig analysemetode til den robuste, følsomme og præcise kvantitative vurdering af større klasser af lipider i en gærcelle er afgørende for at få dyb indsigt i disse mekanismer. Her præsenterer vi en protokol til at bruge flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri (LC-MS/MS) til kvantitativ analyse af større cellulære lipider af S. cerevisiae. Den beskrevne LC-MS/MS-metode er alsidig og robust. Det gør det muligt at identificere og kvantificere mange arter (herunder forskellige isobariske eller isomeriske former) inden for hver af de 10 lipidklasser. Denne metode er følsom og gør det muligt at identificere og kvantificere visse lipidarter ved koncentrationer helt ned til 0,2 pmol/μL. Metoden er med succes blevet anvendt til vurdering af lipidomer af hele gærceller og deres rensede organeller. Brugen af alternative mobile fase tilsætningsstoffer til elektrospray ionisering massespektrometri i denne metode kan øge effektiviteten af ionisering for nogle lipid arter og kan derfor bruges til at forbedre deres identifikation og kvantificering.

Vores metode til en kvantitativ vurdering af større cellulære lipider i en gærcelle ved hjælp af LC-MS/MS var alsidig og robust. Det gav os mulighed for at identificere og kvantificere 10 forskellige lipidklasser i S. cerevisiae celler dyrket i den syntetiske minimal YNB medium oprindeligt indeholder 2% glukose. Disse lipidklasser omfatter frie (unesterified) fedtsyrer (FFA), CL, phytoceramid (PHC), phytosphingosine (PHS), PC, PE, PG, PI, PS og TAG (Supplerende tabel ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Vi præsenterer en protokol ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri at identificere og kvantificere større cellulære lipider i Saccharomyces cerevisiae. Den beskrevne metode til en kvantitativ vurdering af større lipidklasser i en gærcelle er alsidig, robust og følsom.

Kvantitativ analyse af cellulære lipidom af Saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Denne protokol giver en nøjagtig og reproducerbar metode til kvantificering af ti forskellige lipidklasser af Saccharomyces cerevisiae ved hjælp af en enkelt ekstraktionsmetode og en enkelt LC-MS-metode. Denne metode gør det muligt at detektion og kvantificering af isobiske og isomeric lipidic arter med forskellige kemiske og fysiske egenskaber. For Saccharomyces cerevisiae-kultur tilsættes først 5 ml steril 20% glukosestrømopløsning til hver af to Erlenmeyerkolber, der indeholder sterilt YNB-medium, til en endelig koncentration på 2 % glukose.Brug derefter en steril pipette til at overføre et volumen af en gærkultur fra den ene dag til den anden, der indeholder fem gange ti til den syvende gærceller, i hver kolbe og kultur kolberne i mindst 24 timer ved 30 grader Celsius med rotationsrystrejning ved 200 omdrejninger i minuttet. Ved lipidekstraktion bestemmes det samlede antal gærceller pr. milliliter kultur og overføres fem gange ti til de syvende celler i et 15 ml centrifugerør. Tilsæt iskoldt nano-rent vand for at bringe det samlede volumen op til 15 ml og opsaml cellerne ved centrifugering.Gærpelllen skal suspenderes igen i 15 ml iskold iso-tonic ammoniumbikarbonat buffer for endnu en centrifugering, og pelleten suspenderes igen i 1,5 ml frisk isøde ammoniumbikarbonatopløsning. Ved afslutningen af centrifugering, opbevare pellet ved 80 grader celsius, indtil ekstraktionen. For at begynde lipidekstraktionen skal cellepilleren tøs på is, før cellerne i 200 mikroliter iskoldt nano-rent vand suspenderes igen.I en røghætte overføres cellesuspensionen til en 15 ml glas med høj styrke, skruetopcentrifugerør med en polytetrafluorethylenforet hætte og der tilsættes 25 mikroliter af en blanding af interne lipiderstandarder, fremstillet i 2:1 chloroform methanol. 100 mikroliter af 425 til 600 mikromolarsyre vasket glasperler og 600 mikroliter af en 17:1 chloroform methanol til røret. Vortex røret ved høj hastighed i fem minutter ved stuetemperatur for at forstyrre cellerne.Efterfulgt af vortexing i en time ved lav hastighed ved stuetemperatur for at lette lipid ekstraktion. Ved ekstraktionens afslutning inkuberes prøven i 15 minutter på is for at fremme proteinudfældning og adskillelsen af de vandige og organiske faser. Ved inkubationens afslutning centrifugeres prøven for yderligere at adskille den øvre vandige fase fra den nedre organiske fase og i røghætten anvende en borosilikatglaspipette til at overføre den nedre organiske fase til et nyt 15 ml glasskruecentrifugerør med en polytetrafluorethylenforet hætte.Den nederste organiske fase bestemmes under strømmen af nitrogengas, og der tilsættes 300 mikroliter af en chloroform methanolblanding i røghætten til den resterende øvre vandige fase. For at lette fosfatidicacid, phosphatidyserin, phosphatidylinositol og cardio-lipid ekstraktion vortex røret kraftigt i fem minutter ved stuetemperatur før centrifugering prøven. Brug en borosilikatglaspipette til at overføre den nederste organiske fase ind i den nederste organiske fase under nitrogen og fordampe opløsningsmidlet i de kombinerede organiske faser i røghætten.Luk derefter rørene af lipidfilm under strømmen af nitrogengas og opbevar prøverne ved 80 grader celsius. For flydende kromatografi, adskillelse af de ekstraherede lipider på 500 mikroliter af en 63:35:5 aceto-nitrile-2-propanol nano-rent vand blanding til røret af lipid film og vortex tre gange i ti sekunder pr vortex ved stuetemperatur. Motiv røret indholdet til ultralyd sonikering i 15 minutter, før vortexing røret tre gange i ti sekunder pr vortex som netop påvist.Overfør 100 mikroliter af prøven i et glashætteglas med en indsats, der anvendes til en 24 brøndplade, og eventuelle bobler i skæret fjernes. Indsæt i en brønd på en 24 brøndplade, og læg en omvendt fase C18 kolonne CSH koblet til en forkolonne i det flydende kromatografisystem. Indstil kolonnetemperaturen til 55 grader celsius og strømmen til 300 mikroliter i minuttet.Når alle parametrene er indstillet, skal der indlæses ti mikroliter af en ekstraktionsdyr, før den første prøve indlæses. Derefter adskilles de forskellige lipidarter ved hjælp af den flydende kromatografigradient, som angivet. Der genereres et repræsentativt totalionkromatogram fra LC-MS-dataene for lipiderne udvundet fra cellerne.Til massespektrometrisk analyse af de ekstraherede lipider indlæses prøverne på et massespektrometer udstyret med en opvarmet elektrosprayionionkilde, og analyseparametrene som beskrevet i tabellen angives. Brug Fourier Transform Analyzer til at registrere MS-1-overordnede ioner med en opløsning på 60.000 og inden for masseområdet på 150-2000 dalton. Detekter derefter de sekundære MS-2-ioner ved hjælp af indstillingerne som angivet i tabellen.For at identificere og kvantificere forskellige lipider fra brede tandem LC-MS-filer skal du søge i LC-MS-rå filer, der indeholder komplette SCANNINGs-MS-1-data og dataafhængige MS-2-data gratis, uesterificerede fedtsyrer, kardio-lipid, phytocerimide, phytosphyngocene, phosphatidylcholin, phosphatidylethanolamin, phosphatydlglycerol, phosphatydlinositol, phosphatydlserine og triacylglycerol lipid klasser ved hjælp af en masse divideret med afgift tolerance på fem dele per million for prækursorerioner og ti dele per million for produktioner. Følg derefter instruktionerne i softwarebrugervejledningen for at identificere interne lipidstandarder og lipidarter med usædvanlige fedtsyresammensætninger. Denne følsomme tandem LC-MS-metode gør det muligt at identificere og kvantificere molekylære arter af lipider ved koncentrationer helt ned til 0,165 picomolar pr. mikroliter.Denne kvantificeringsgrænse adskiller sig fra forskellige lipidklasser inden for en lang række koncentrationer. Denne metode kan bruges til at øge effektiviteten af ionisering for lipider ved hjælp af alternative mobile fase tilsætningsstoffer til elektrosprayionisering massespektrometri. Hver af disse alternative mobile fasetilsætningsstoffer kan bruges til både den normale fase og omvendte fase LC kolonner.Kollisionsinduceret dissociationsmetode er gavnlig, hvis den anvendes i kombination med ammoniumacetatmobilfasetilsætningsstoffet til den negative massespektrometriform for elektrosprøjtning, da den under disse omstændigheder gør det muligt at øge effektiviteten af MS-1 lipidionfragmentering i MS-2-produkter. I modsætning hertil er den høje energi, kollisionsspaltningsmetode gunstig, hvis den anvendes i kombination med ammoniumformate mobilfasetilsætningsstof til elektrosprayioniseringen positiv massespektrometriform, da den under disse forhold muliggør en forøgelse af effektiviteten af MS-1 lipidionfragmentering i MS-2-produkter. Bland ikke faserne under opsamling af den organiske fase.Luk rørene under strømmen af nitrogengas. Eliminer enhver boble i indsatsen, og tilslut kolonnen i den rigtige retning. Hvis identiteten af en top ikke kan bestemmes af LC-MS, kan MS-NMR bruges til at udlede strukturen af det pågældende molekyle.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

En Tandem væskekromatografi-massespektrometri-baseret tilgang til Metabolit Analyse af<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolation for Kvantitativ massespektrometri Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Glycoproteomics af den ekstracellulære matrix: En metode til Intakt glycopeptid analyse ved hjælp massespektrometri

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Dyb proteomet profilering af Isobar mærkning, omfattende væskekromatografi, massespektrometri og Software-assisteret kvantificering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identifikation af inositol fosfat eller Phosphoinositide interagerende proteiner ved affinitets kromatografi koblet til Western blot eller massespektrometri

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolut kvantificering af celle frit protein syntese metabolisme ved omvendt fase-væskekromatografi-massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flydende kromatografi-massespektrometri-baserede metabolomiske analyse af hvedekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...