Name: quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry
Uploaded: 2020-03-08T15:00:00
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Nous sommes reconnaissants aux membres actuels et anciens du laboratoire Titorenko pour les discussions. Nous remercions le Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry et le Centre for Structural and Functional Genomics (tous deux de l’Université Concordia) pour leurs services exceptionnels. Cette étude a été appuyée par des subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie (NSERC) du Canada (RGPIN 2014-04482) et du Fonds de la chaire de l’Université Concordia (CC0113). K.M. a reçu l’appui du Prix du mérite de l’Université Concordia.

1. Préparation de supports stériles pour la culture de la levure
<ol><li>Préparer 90 ml d’un milieu VP complet qui contient 1% (w/v) extrait de levure et 2% (w/v) bactopeptone.</li>
	<li>Préparer 90 ml d’un milieu synthétique minimal de la BNNB contenant 0,67 % (w/v) base d’azote de levure sans acides aminés, 20 mg/L L-histidine, 30 mg/L L-leucine,30 mg/L L-lysine et 20 mg/L uracil. </li>
	<li>Répartir 90 ml du support total YP également en deux flacons Erlenmeyer de 250 ml (soi...

<ol>
	<li>Bou Khalil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+era:+accomplishments+and+challenges.">Lipidomics era: accomplishments and challenges.</a> Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).</li><li>Shevchenko, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+coming+to+grips+with+lipid+diversity.">Lipidomics: coming to grips with lipid diversity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).</li><li>Br&#252;gger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+analysis+of+the+lipid+composition+of+cells+and+subcellular+organelles+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).</li><li>Zechner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAT+SIGNALS+-+lipases+and+lipolysis+in+lipid+metabolism+and+signaling.">FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling.</a> Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).</li><li>Eisenberg, T., B&#252;ttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+and+cell+death+in+yeast.">Lipids and cell death in yeast.</a> FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).</li><li>Richard, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+liponecrosis,+a+distinct+mode+of+programmed+cell+death.">Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death.</a> Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).</li><li>Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+the+discovery+of+anti-tumor+pharmaceuticals:+searching+for+activators+of+liponecrosis.">A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis.</a> Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).</li><li>M&#229;rtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+lipids+on+mitochondrial+functions.">Effects of lipids on mitochondrial functions.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).</li><li>Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-bilayer+phospholipids+in+mitochondrial+structure+and+function.">The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function.</a> FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).</li><li>Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+membrane+turnover+by+phosphatidic+acid:+cellular+functions+and+disease+implications.">Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).</li><li>Goldberg, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+of+lipid+droplets+in+regulating+longevity.">A novel function of lipid droplets in regulating longevity.</a> Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).</li><li>Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obese+and+anorexic+yeasts:+experimental+models+to+understand+the+metabolic+syndrome+and+lipotoxicity.">Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).</li><li>Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+metabolism+and+cellular+aging.">Peroxisome metabolism and cellular aging.</a> Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).</li><li>Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+regulation+of+glycerolipids+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).</li><li>Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+peroxisomes:+key+players+in+cellular+lipid+homeostasis+or+a+matter+of+fat--store+'em+up+or+burn+'em+down.">Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down.</a> Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).</li><li>Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+topology+and+regulation+of+cardiolipin+biosynthesis+and+remodeling+in+yeast.">The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).</li><li>Dimmer, K. S., Rapaport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+contact+sites+as+platforms+for+phospholipid+exchange.">Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).</li><li>Csord&#225;s, G., Weaver, D., Hajn&#243;czky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contactology:+structure+and+signaling+functions.">Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions.</a> Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).</li><li>Mitrofanova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+and+transport+define+longevity+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).</li><li>Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+contact+zones+as+sites+for+lipid+transfer.">Organelle contact zones as sites for lipid transfer.</a> Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).</li><li>Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).</li><li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast:+an+experimental+organism+for+21st+Century+biology.">Yeast: an experimental organism for 21st Century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li><li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+for+budding+geneticists:+a+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system.">Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li><li>Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+surrogate+and+chemical+genetics+in+model+organisms+can+suggest+therapies+for+human+genetic+diseases.">How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases.</a> Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).</li><li>Zimmermann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+tool+to+identify+anti-aging+compounds.">Yeast as a tool to identify anti-aging compounds.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).</li><li>Ejsing, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+yeast+lipidome+by+quantitative+shotgun+mass+spectrometry.">Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).</li><li>Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+lipid+analysis+and+quantification+by+mass+spectrometry.">Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry.</a> Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).</li><li>Guan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+membrane+lipidomics+during+Drosophila+development.">Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development.</a> Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).</li><li>Klose, C., Tarasov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+yeast+lipids+by+shotgun+lipidomics.">Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).</li><li>Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+advances+in+shotgun+lipidomics+for+biology+and+medicine.">Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine.</a> Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).</li><li>Sud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMSD:+LIPID+MAPS+structure+database.">LMSD: LIPID MAPS structure database.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).</li><li>Pauling, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposal+for+a+common+nomenclature+for+fragment+ions+in+mass+spectra+of+lipids.">Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids.</a> PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).</li></ol>

Les précautions suivantes sont importantes pour la mise en œuvre réussie du protocole décrit ici :
1. Le chloroforme et le méthanol sont toxiques. Ils extraient efficacement diverses substances des surfaces, y compris la plasticware de laboratoire et votre peau. Par conséquent, manipuler ces solvants organiques avec prudence en évitant l’utilisation de plastiques dans les étapes qui impliquent le contact avec le chloroforme et / ou le méthanol, en utilisant des pipettes en verre bor...

Un ensemble de preuves indique que les lipides, l’une des principales classes de biomolécules, jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus vitaux au sein d’une cellule eucaryote. Ces processus comprennent l’assemblage de bilayers lipidiques qui constituent la membrane plasmatique et les membranes entourant les organites cellulaires, le transport de petites molécules à travers les membranes cellulaires, la réponse aux changements de l’environnement extracellulaire et la transduction intracellulaire du signal, la production et le stockage de l’énergie, l’importation et l’exportation de protéines confinées à différents organites, le trafic vésicular des protéines dans le système endomémbrane et la sécrétion de protéines, et plusieurs modes de la cellule de mort réglementée1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
La levure en herbe S. cerevisiae, un organisme eucaryote unicellulaire, a été utilisé avec succès pour découvrir certains des mécanismes sous-jacents aux rôles essentiels des lipides dans ces processus cellulaires vitaux4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae est un organisme modèle précieux pour découvrir ces mécanismes parce qu’il est favorable à la biochimie complète, génétique, biologique cellulaire, biologique chimique, biologique du système biologique, et microfluidique dissection analyses21,22,23,24,25. D’autres progrès dans la compréhension des mécanismes par lesquels le métabolisme lipidique et le transport intracellulaire contribuent à ces processus cellulaires vitaux nécessite des technologies sensibles de spectrométrie de masse pour la caractérisation quantitative du lipidome cellulaire, la compréhension de la complexité moléculaire lipidome, et l’intégration de lipidomiques quantitatifs dans une plate-forme multidisciplinaire de biologie des systèmes1,2,3,26, 27,28,29,30.
Les méthodes actuelles pour la lipidomique quantitative de masse assistée par spectrométrie des cellules et des cellules de levure d’autres organismes eucaryotes ne sont pas suffisamment polyvalentes, robustes ou sensibles. En outre, ces méthodes actuellement utilisées sont incapables de différencier diverses espèces de lipides isobariques ou isomériques les unes des autres. Ici, nous décrivons une méthode polyvalente, robuste et sensible qui permet l’utilisation de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem (LC-MS/MS) pour l’analyse quantitative des lipides cellulaires majeurs de S. cerevisiae.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>05-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>60180A-SV9-1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A9554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 series LC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1312A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent1100 Wellplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1367A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A470-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiolipin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>750332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centra CL2 clinical centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramide</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C297-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSH C18 VanGuard</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006944</td>
			<td>Pre-column system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free fatty acid (19:0)</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (acid-washed, 425-600 &#956;M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Search software (V4.1)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V4.1</td>
			<td>LC-MS/MS analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylglycerol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylserine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse-phase column CSH C18</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingosine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Orbitrap Velos MS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ETD-10600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricylglycerol</td>
			<td>Larodan, Malmo</td>
			<td>TAG Mixed FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0919-15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strain BY4742</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>YSC1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

Les lipides sont des molécules amphipathiques structurellement diverses qui sont insolubles dans l’eau. Les lipides sont des facteurs essentiels à l’organisation et à la fonction des membranes biologiques, du stockage et de la production d’énergie, de la signalisation cellulaire, du transport vésiculaire des protéines, de la biogenèse d’organelle et de la mort cellulaire réglementée. Parce que la levure naissante Saccharomyces cerevisiae est un eucaryote unicellulaire favorable à des analyses moléculaires approfondies, son utilisation comme un organisme modèle a aidé à découvrir des mécanismes reliant le métabolisme des lipides et le transport intracellulaire à des processus biologiques complexes dans les cellules eucaryote. La disponibilité d’une méthode d’analyse polyvalente pour l’évaluation quantitative robuste, sensible et précise des grandes classes de lipides au sein d’une cellule de levure est cruciale pour obtenir des connaissances approfondies sur ces mécanismes. Ici, nous présentons un protocole pour utiliser la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem (LC-MS/MS) pour l’analyse quantitative des lipides cellulaires principaux de S. cerevisiae. La méthode LC-MS/MS décrite est polyvalente et robuste. Il permet l’identification et la quantification de nombreuses espèces (y compris différentes formes isobariques ou isomériques) dans chacune des 10 classes de lipides. Cette méthode est sensible et permet l’identification et la quantitation de certaines espèces lipidiques à des concentrations aussi basses que 0,2 pmol/L. La méthode a été appliquée avec succès à l’évaluation des lipidomes des cellules entières de levure et de leurs organites purifiés. L’utilisation d’additifs alternatifs de phase mobile pour la spectrométrie de masse d’ionisation électrospray dans cette méthode peut augmenter l’efficacité de l’ionisation pour certaines espèces lipidiques et peut donc être utilisée pour améliorer leur identification et leur quantitation.

Notre méthode pour une évaluation quantitative des lipides cellulaires principaux dans une cellule de levure avec l’aide de LC-MS/MS était polyvalente et robuste. Il nous a permis d’identifier et de quantifier 10 différentes classes de lipides dans les cellules de la Cérévisiae de S. cultivées dans le milieu minimal synthétique de YNB contenant initialement 2% de glucose. Ces classes de lipides comprennent les acides gras gratuits (non stérilisés) (FFA), CL, phytoce...

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Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Nous présentons un protocole utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem pour identifier et quantifier les lipides cellulaires principaux dans saccharomyces cerevisiae. La méthode décrite pour une évaluation quantitative des classes lipidiques majeures dans une cellule de levure est polyvalente, robuste et sensible.

Analyse quantitative du lipidome cellulaire de Saccharomyces Cerevisiae à l’aide de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Ce protocole fournit une méthode précise et reproductible pour quantifier dix classes lipidiques différentes de Saccharomyces cerevisiae à l’aide d’une méthode d’extraction unique et d’une seule méthode LC-MS. Cette méthode permet la détection et la quantification d’espèces lipidiques isobariques et isomériques ayant des propriétés chimiques et physiques différentes. Pour la culture des cerevisiae saccharomyces, ajoutez d’abord 5 ml de solution stérile de stock de glucose à chacune des deux flacons Erlenmeyer contenant du milieu stérile YNB à une concentration finale de 2 % de glucose.Ensuite, utilisez une pipette stérile pour transférer un volume d’une culture de levure de nuit contenant cinq fois dix à la septième cellule de levure dans chaque flacon et la culture des flacons pendant au moins 24 heures à 30 degrés Celsius avec rotation secouant à 200 révolutions par minute. Pour l’extraction des lipides, déterminer le nombre total de cellules de levure par millilitre de culture et transférer cinq fois dix à la septième cellule dans un tube centrifugeuse de 15 ml. Ajouter de l’eau nano-pure glacée pour porter le volume total jusqu’à 15 ml et recueillir les cellules par centrifugation.Suspendre à nouveau la pastille de levure dans 15 ml de tampon de bicarbonate d’ammonium iso-tonique glacé pour une deuxième centrifugation et suspendre à nouveau la pastille dans 1,5 ml de solution de bicarbonate d’ammonium glacé frais. À la fin de la centrifugation, conserver la pastille à 80 degrés Celsius jusqu’à l’extraction. Pour commencer l’extraction des lipides, décongeler la pastille cellulaire sur la glace avant de suspendre à nouveau les cellules dans 200 microlitres d’eau glacée nano-pure.Dans une hotte à vapeur, transférer la suspension cellulaire dans un verre à haute résistance de 15 ml, visser le tube de centrifugeuse avec un bouchon doublé de polytétrafluoroéthylène et ajouter 25 microlitres d’un mélange interne de normes lipidiques, préparé en méthanol chloroforme 2:1. 100 microlitres de 425 à 600 perles de verre lavées à l’acide micromolaire et 600 microlitres d’un méthanol chloroforme 17:1 au tube. Vortex le tube à grande vitesse pendant cinq minutes à température ambiante pour perturber les cellules.Suivi d’un vortex d’une heure à basse vitesse à température ambiante pour faciliter l’extraction des lipides. À la fin de l’extraction, incuber l’échantillon pendant 15 minutes sur la glace, afin de favoriser les précipitations protéiques et la séparation des phases aqueuse et organique. À la fin de l’incubation, centrifugeuse de l’échantillon pour séparer davantage la phase aqueuse supérieure de la phase organique inférieure et, dans le capot de fumée, utiliser une pipette en verre borosilicate pour transférer la phase organique inférieure à un nouveau tube centrifugeuse supérieure à vis en verre de 15 ml de haute résistance avec un bouchon doublé de polytétrafluoroéthylène.Placez la phase organique inférieure sous l’écoulement du gaz azoté et, dans le capot des vapeurs, ajoutez 300 microlitres d’un mélange de méthanol chloroforme 2:1 à la phase aqueuse supérieure restante. Pour faciliter l’extraction de phosphatidicacid, phosphatidylserine, phosphatidylinositol et extraction cardio-lipidique vortex le tube vigoureusement pendant cinq minutes à température ambiante avant de centrifuger l’échantillon. Utilisez une pipette en verre borosilicate pour transférer la phase organique inférieure dans la phase organique inférieure sous azote et évaporer le solvant dans les phases organiques combinées dans le capot de fumée.Ensuite, fermez les tubes de film lipidique sous le flux de gaz azoté et stockez les échantillons à 80 degrés Celsius. Pour la chromatographie liquide, séparation des lipides extraits à 500 microlitres d’un mélange d’eau nano-pure de 63:35:5 aceto-nitrile-2-propanol au tube du film lipidique et du vortex trois fois pendant dix secondes par vortex à température ambiante. Soumettons le contenu du tube à la sonication ultrasonique pendant 15 minutes avant de vortexer le tube trois fois pendant dix secondes par vortex comme vient de le démontrer.Transférer 100 microlitres de l’échantillon dans un flacon de verre avec un insert utilisé pour une plaque de puits 24 et éliminer les bulles dans l’insert. Placez l’insert dans un puits d’une plaque de puits de 24 puits et chargez une colonne CSH de phase C18 inversée couplée à une pré-colonne dans le système de chromatographie liquide. Réglez la température de la colonne à 55 degrés Celsius et le débit à 300 microlitres par minute.Lorsque tous les paramètres ont été définis, chargez dix microlitres d’une extraction vierge avant de charger le premier échantillon. Ensuite, séparez les différentes espèces lipidiques en utilisant le gradient chromatographie liquide, comme indiqué. Un chromatogramme total représentatif d’ion des données de LC-MS pour les lipides extraits des cellules sera généré.Pour l’analyse spectrométrique de masse des lipides extraits, chargez les échantillons sur un spectromètre de masse équipé d’une source d’ionisation par électro-pulvérisation chauffée et définissez les paramètres d’analyse tels qu’ils sont décrits dans le tableau. Utilisez l’analyseur Fourier Transform pour détecter les ions parent MS-1 à une résolution de 60 000 et dans la plage de masse de 150-2000 daltons. Ensuite, détectez les ions secondaires MS-2 à l’aide des paramètres indiqués dans le tableau.Pour identifier et quantifier les différents lipides des fichiers LC-MS en tandem, recherchez gratuitement les fichiers bruts LC-MS contenant des données MS-1 complètes et des données MS-2 dépendantes des données, acides gras non stérilisés, cardio-lipides, phytocerimide, phytosphyngocène, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatydlglycérol, phosphatydlinositol, phosphatydlserine et triacylglycérol classes lipidiques en utilisant une masse divisée par tolérance de charge de cinq parties par million pour les ions précurseurs et dix parties par million pour les ions produits. Ensuite, suivez les instructions fournies dans le manuel de l’utilisateur du logiciel pour identifier les normes lipidiques internes et les espèces lipidiques avec des compositions inhabituelles en acides gras. Cette méthode sensible en tandem LC-MS permet l’identification et la quantification d’espèces moléculaires de lipides à des concentrations aussi faibles que 0,165 picomolaire par microlitre.Cette limite de quantification diffère des différentes classes lipidiques dans un large éventail de concentrations. Cette méthode peut être utilisée pour augmenter l’efficacité de l’ionisation des lipides en utilisant des additifs de phase mobiles alternatifs pour la spectrométrie de masse d’ionisation électrospray. Chacun de ces additifs de phase mobiles alternatifs peut être utilisé à la fois pour la phase normale et les colonnes LC de phase inverse.La méthode de dissociation induite par collision est bénéfique si elle est utilisée en combinaison avec l’additif de phase mobile d’acétium pour le mode négatif d’ionisation électro-pulvérisation de spectrométrie de masse, car, dans ces conditions, il permet l’augmentation de l’efficacité de la fragmentation des ion lipidiques MS-1 en produits MS-2. En revanche, la méthode de dissociation collisionnelle à haute énergie est favorable si elle est utilisée en combinaison avec l’additif de phase mobile formate ammonium pour le mode positif de spectrométrie de masse d’ionisation par électro-pulvérisation car dans ces conditions, elle permet une augmentation de l’efficacité de la fragmentation des ion lipidiques MS-1 dans les produits MS-2. Ne mélangez pas les phases lors de la collecte de la phase organique.Fermer les tubes sous l’écoulement du gaz azoté. Éliminez toute bulle dans l’insert et connectez la colonne dans la bonne direction. Si l’identité d’un pic ne peut être déterminée par la LC-MS, MS-NMR peut être utilisé pour déduire la structure de cette molécule.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

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Recherche

Biochimie

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A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Une approche fondée Spectrométrie liquide tandem chromatographie-masse pour l&#39;analyse des Métabolite<em&gt; Staphylococcus aureus</em

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Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...