Name: quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry
Uploaded: 2020-03-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

Wir danken aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Titorenko-Labors für Diskussionen. Wir würdigen das Zentrum für biologische Anwendungen der Massenspektrometrie und das Zentrum für Strukturelle und Funktionelle Genomik (beide an der Concordia University) für herausragende Leistungen. Diese Studie wurde durch Stipendien des Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) kanadas (RGPIN 2014-04482) und des Concordia University Chair Fund (CC0113) unterstützt. K.M. wurde vom Concordia University Merit Award unterstützt.

1. Herstellung steriler Medien zur Hefekultierung
<ol><li>Bereiten Sie 90 ml eines vollständigen YP-Mediums vor, das 1% (w/v) Hefeextrakt und 2% (w/v) Bactopepton enthält.</li>
	<li>Bereiten Sie 90 ml eines synthetischen minimalen YNB-Mediums vor, das 0,67 % (w/v) Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren, 20 mg/L L-Histidin, 30 mg/L L-Leucin,30 mg/L L-Lysinund 20 mg/L Uracil enthält. </li>
	<li>90 ml des gesamten YP-Mediums gleichmäßig in zwei 250 ml Erlenmeyerkolben (d.h. je 45 ml) aufteil...

<ol>
	<li>Bou Khalil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+era:+accomplishments+and+challenges.">Lipidomics era: accomplishments and challenges.</a> Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).</li><li>Shevchenko, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+coming+to+grips+with+lipid+diversity.">Lipidomics: coming to grips with lipid diversity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).</li><li>Br&#252;gger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+analysis+of+the+lipid+composition+of+cells+and+subcellular+organelles+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).</li><li>Zechner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAT+SIGNALS+-+lipases+and+lipolysis+in+lipid+metabolism+and+signaling.">FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling.</a> Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).</li><li>Eisenberg, T., B&#252;ttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+and+cell+death+in+yeast.">Lipids and cell death in yeast.</a> FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).</li><li>Richard, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+liponecrosis,+a+distinct+mode+of+programmed+cell+death.">Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death.</a> Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).</li><li>Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+the+discovery+of+anti-tumor+pharmaceuticals:+searching+for+activators+of+liponecrosis.">A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis.</a> Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).</li><li>M&#229;rtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+lipids+on+mitochondrial+functions.">Effects of lipids on mitochondrial functions.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).</li><li>Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-bilayer+phospholipids+in+mitochondrial+structure+and+function.">The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function.</a> FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).</li><li>Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+membrane+turnover+by+phosphatidic+acid:+cellular+functions+and+disease+implications.">Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).</li><li>Goldberg, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+of+lipid+droplets+in+regulating+longevity.">A novel function of lipid droplets in regulating longevity.</a> Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).</li><li>Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obese+and+anorexic+yeasts:+experimental+models+to+understand+the+metabolic+syndrome+and+lipotoxicity.">Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).</li><li>Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+metabolism+and+cellular+aging.">Peroxisome metabolism and cellular aging.</a> Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).</li><li>Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+regulation+of+glycerolipids+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).</li><li>Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+peroxisomes:+key+players+in+cellular+lipid+homeostasis+or+a+matter+of+fat--store+'em+up+or+burn+'em+down.">Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down.</a> Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).</li><li>Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+topology+and+regulation+of+cardiolipin+biosynthesis+and+remodeling+in+yeast.">The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).</li><li>Dimmer, K. S., Rapaport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+contact+sites+as+platforms+for+phospholipid+exchange.">Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).</li><li>Csord&#225;s, G., Weaver, D., Hajn&#243;czky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contactology:+structure+and+signaling+functions.">Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions.</a> Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).</li><li>Mitrofanova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+and+transport+define+longevity+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).</li><li>Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+contact+zones+as+sites+for+lipid+transfer.">Organelle contact zones as sites for lipid transfer.</a> Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).</li><li>Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).</li><li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast:+an+experimental+organism+for+21st+Century+biology.">Yeast: an experimental organism for 21st Century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li><li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+for+budding+geneticists:+a+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system.">Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li><li>Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+surrogate+and+chemical+genetics+in+model+organisms+can+suggest+therapies+for+human+genetic+diseases.">How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases.</a> Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).</li><li>Zimmermann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+tool+to+identify+anti-aging+compounds.">Yeast as a tool to identify anti-aging compounds.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).</li><li>Ejsing, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+yeast+lipidome+by+quantitative+shotgun+mass+spectrometry.">Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).</li><li>Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+lipid+analysis+and+quantification+by+mass+spectrometry.">Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry.</a> Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).</li><li>Guan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+membrane+lipidomics+during+Drosophila+development.">Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development.</a> Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).</li><li>Klose, C., Tarasov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+yeast+lipids+by+shotgun+lipidomics.">Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).</li><li>Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+advances+in+shotgun+lipidomics+for+biology+and+medicine.">Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine.</a> Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).</li><li>Sud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMSD:+LIPID+MAPS+structure+database.">LMSD: LIPID MAPS structure database.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).</li><li>Pauling, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposal+for+a+common+nomenclature+for+fragment+ions+in+mass+spectra+of+lipids.">Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids.</a> PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).</li></ol>

Die folgenden Vorsichtsmaßnahmen sind wichtig für die erfolgreiche Implementierung des hier beschriebenen Protokolls:
1. Chloroform und Methanol sind giftig. Sie extrahieren effizient verschiedene Substanzen von Oberflächen, einschließlich Labor-Kunststoffundzeug und Ihre Haut. Behandeln Sie daher diese organischen Lösungsmittel mit Vorsicht, indem Sie die Verwendung von Kunststoffen in Schritten vermeiden, die den Kontakt mit Chloroform und/oder Methanol beinhalten, Borosilikatglaspipett...

Eine Reihe von Beweisen zeigt, dass Lipide, eine der wichtigsten Klassen von Biomolekülen, spielen wesentliche Rolle in vielen lebenswichtigen Prozessen innerhalb einer eukaryotischen Zelle. Diese Prozesse umfassen die Montage von Lipid-Doppelschichten, die die Plasmamembran und Membranen umgebenden Zellorganellen bilden, den Transport kleiner Moleküle über Zellmembranen, die Reaktion auf Veränderungen in der extrazellulären Umgebung und intrazelluläre Signaltransduktion, die Erzeugung und Speicherung von Energie, den Import und Export von Proteinen, die auf verschiedene Organellen beschränkt sind, vesikulären Handel mit Proteinen innerhalb des Endomembransystems und der Proteinsekretion sowie verschiedene Arten des regulierten Zelltodes1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Die angehende Hefe S. cerevisiae, ein einzelliger eukaryotischer Organismus, wurde erfolgreich verwendet, um einige der Mechanismen zu entdecken, die den wesentlichen Rollen von Lipiden in diesen lebenswichtigen zellulären Prozessen zugrundeliegen 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae ist ein wertvoller Modellorganismus für die Aufdeckung dieser Mechanismen, weil er für umfassende biochemische, genetische, zellbiologische, chemische, biologische, systembiologische und mikrofluidische Dissektionsanalysen21,22,23,24,25zugänglich ist. Weitere Fortschritte beim Verständnis von Mechanismen, durch die der Fettstoffwechsel und der intrazelluläre Transport zu diesen lebenswichtigen zellulären Prozessen beitragen, erfordern empfindliche Massenspektrometrietechnologien für die quantitative Charakterisierung des zellulären Lipidoms, das Verständnis der molekularen Lipidkomplexität und die Integration der quantitativen Lipidomik in eine multidisziplinäre Plattform der Systembiologie1,2,3,26, 27,28,29,30.
Aktuelle Methoden für die Massenspektrometrie-unterstützte quantitative Lipidomik von Hefezellen und Zellen anderer eukaryotischer Organismen sind nicht ausreichend vielseitig, robust oder empfindlich. Darüber hinaus sind diese derzeit verwendeten Methoden nicht in der Lage, verschiedene isobarische oder isomerische Lipidarten voneinander zu unterscheiden. Hier beschreiben wir eine vielseitige, robuste und empfindliche Methode, die den Einsatz von Flüssigchromatographie in Verbindung mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) für die quantitative Analyse der wichtigsten zellulären Lipide von S. cerevisiaeermöglicht.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>05-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>60180A-SV9-1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A9554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 series LC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1312A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent1100 Wellplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1367A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A470-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiolipin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>750332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centra CL2 clinical centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramide</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C297-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSH C18 VanGuard</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006944</td>
			<td>Pre-column system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free fatty acid (19:0)</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (acid-washed, 425-600 &#956;M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Search software (V4.1)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V4.1</td>
			<td>LC-MS/MS analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylglycerol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylserine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse-phase column CSH C18</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingosine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Orbitrap Velos MS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ETD-10600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricylglycerol</td>
			<td>Larodan, Malmo</td>
			<td>TAG Mixed FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0919-15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strain BY4742</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>YSC1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

Lipide sind strukturell vielfältige amphipathische Moleküle, die in Wasser unlöslich sind. Lipide sind wesentliche Beiträge zur Organisation und Funktion biologischer Membranen, Energiespeicherung und -produktion, zelluläre Signalisierung, vesikulärer Transport von Proteinen, Organellebiogenese und regulierter Zelltod. Da die aufkeimende Hefe Saccharomyces cerevisiae ein einzelliges Eukaryoten ist, das für gründliche molekulare Analysen zugänglich ist, half seine Verwendung als Modellorganismus, Mechanismen aufzudecken, die den Fettstoffwechsel mit dem intrazellulären Transport mit komplexen biologischen Prozessen innerhalb eukaryotischer Zellen verbinden. Die Verfügbarkeit einer vielseitigen Analysemethode für die robuste, empfindliche und genaue quantitative Bewertung wichtiger Lipidklassen innerhalb einer Hefezelle ist entscheidend, um tiefe Einblicke in diese Mechanismen zu erhalten. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verwendung der Flüssigchromatographie in Verbindung mit der Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS) für die quantitative Analyse der wichtigsten zellulären Lipide von S. cerevisiae vor. Die beschriebene LC-MS/MS-Methode ist vielseitig und robust. Es ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung zahlreicher Arten (einschließlich verschiedener isobarer oder isomerischer Formen) innerhalb jeder der 10 Lipidklassen. Diese Methode ist empfindlich und ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung einiger Lipidarten in Konzentrationen von bis zu 0,2 pmol/l. Die Methode wurde erfolgreich angewendet, um Lipidome ganzer Hefezellen und ihrer gereinigten Organellen zu bewerten. Der Einsatz alternativer mobiler Phasenadditive für die Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie bei dieser Methode kann die Ionisationseffizienz bei einigen Lipidarten erhöhen und kann daher zur Verbesserung ihrer Identifizierung und Quantifizierung eingesetzt werden.

Unsere Methode zur quantitativen Bewertung wichtiger zellulärer Lipide innerhalb einer Hefezelle mit Hilfe von LC-MS/MS war vielseitig und robust. Es ermöglichte uns, 10 verschiedene Lipidklassen in S. cerevisiae Zellen zu identifizieren und zu quantifizieren, die im synthetischen minimalen YNB-Medium kultiviert wurden, das zunächst 2% Glukose enthielt. Diese Lipidklassen umfassen freie (unesterifizierte) Fettsäuren (FFA), CL, Phytoceramid (PHC), Phytosphingosin (PHS), PC, PE...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Wir präsentieren ein Protokoll mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie, um wichtige zelluläre Lipide in Saccharomyces cerevisiaezu identifizieren und zu quantifizieren. Die beschriebene Methode zur quantitativen Bewertung wichtiger Lipidklassen innerhalb einer Hefezelle ist vielseitig, robust und empfindlich.

Quantitative Analyse des Zelllipidoms von Saccharomyces Cerevisiae mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Dieses Protokoll bietet eine genaue und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung von zehn verschiedenen Lipidklassen von Saccharomyces cerevisiae mit einer einzigen Extraktionsmethode und einer einzigen LC-MS-Methode. Diese Methode ermöglicht den Nachweis und die Quantifizierung von isobarischen und isomerischen Lipidarten mit unterschiedlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften. Für Saccharomyces cerevisiae Kultur, fügen Sie zuerst 5 ml sterile 20%Glukose-Stammlösung zu jedem von zwei Erlenmeyer-Flaschen mit sterilem YNB-Medium bis zu einer Endkonzentration von 2%Glukose.Dann verwenden Sie eine sterile Pipette, um ein Volumen einer über Nacht Hefekultur mit fünf mal zehn bis siebten Hefezellen in jeden Kolben und Kultur die Kolben für mindestens 24 Stunden bei 30 Grad Celsius mit Rotationsschütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute zu übertragen. Für die Lipidextraktion bestimmen Sie die Gesamtzahl der Hefezellen pro Milliliter Kultur und übertragen sie fünfmal zehn in die siebte Zelle in ein 15 ml Zentrifugenrohr. Fügen Sie eiskaltes nanoreines Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf bis zu 15 ml zu erhöhen und die Zellen durch Zentrifugation zu sammeln.Das Hefepellet in 15 ml eiskaltem isotonischem Ammoniumbicarbonatpuffer für eine zweite Zentrifugation wieder aufsetzen und das Pellet in 1,5 ml frischer eiskalter Ammoniumbicarbonatlösung wieder aufhängen. Am Ende der Zentrifugation das Pellet bei 80 Grad Celsius bis zur Extraktion lagern. Um die Lipidextraktion zu beginnen, tauen Sie das Zellpellet auf Eis auf, bevor Sie die Zellen in 200 Mikroliter eiskaltes nanoreines Wasser wieder aufhängen.In einer Dunstabzugshaube die Zellsuspension in ein 15 ml, hochfestes Glas, Schraube Oben Zentrifugenrohr mit einer Polytetrafluorethylen gefüttertkappe übertragen und 25 Mikroliter eines internen Lipid-Standardgemisches hinzufügen, in 2:1 Chlorform-Methanol hergestellt. 100 Mikroliter 425 bis 600 Mikromolarsäure gewaschen Glasperlen und 600 Mikroliter eines 17:1 Chloroform Methanol in die Röhre. Wirbeln Sie die Röhre mit hoher Geschwindigkeit für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu stören.Gefolgt von Wirbeln für eine Stunde bei niedriger Geschwindigkeit bei Raumtemperatur, um die Lipidextraktion zu erleichtern. Am Ende der Extraktion die Probe 15 Minuten lang auf Eis bebrüten, um die Proteinfällung und die Trennung der wässrigen und organischen Phasen zu fördern. Zentrifugieren Sie am Ende der Inkubation die Probe, um die obere wässrige Phase weiter von der unteren organischen Phase zu trennen, und verwenden Sie in der Rauchhaube eine Borosilikatglaspipette, um die untere organische Phase auf ein neues 15 ml hochfestes Glasschnecken-Spitzenzentrifugenrohr mit einer mit Polytetrafluorethylen gefütterten Kappe zu übertragen.Die untere organische Phase unter den Fluss von Stickstoffgas stellen und in der Dunstabzugshaube 300 Mikroliter eines 2:1 Chloroform-Methanol-Gemischs in die verbleibende obere wässrige Phase geben. Um Phosphatidsäure, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol und Kardio-Lipid-Extraktionswirbel die Röhre kräftig für fünf Minuten bei Raumtemperatur vor zentrifugieren der Probe zu erleichtern. Verwenden Sie eine Borosilikat-Glaspipette, um die untere organische Phase unter Stickstoff in die untere organische Phase zu übertragen und das Lösungsmittel in den kombinierten organischen Phasen in der Dunstabzugshaube zu verdampfen.Schließen Sie dann die Rohre von Lipidfolie unter dem Fluss von Stickstoffgas und speichern Sie die Proben bei 80 Grad Celsius. Für die Flüssigchromatographie die Trennung der extrahierten Lipide bei 500 Mikrolitern eines 63:35:5 Aceto-Nitrile-2-Propanol Nano-Reinenwassergemisches in die Röhre von Lipidfilm und Wirbel dreimal für zehn Sekunden pro Wirbel bei Raumtemperatur. Unterziehen Sie den Rohrinhalt 15 Minuten lang einer Ultraschallbeschallung, bevor Sie das Rohr dreimal für zehn Sekunden pro Wirbel wirbeln lassen, wie gerade gezeigt.100 Mikroliter der Probe in eine Glasflasche mit einem Einsatz für eine 24-Well-Platte geben und Blasen innerhalb des Einsatzes beseitigen. Legen Sie den Einsatz in einen Brunnen einer 24-Well-Platte und laden Sie eine Reverse-Phase C18-Säule CSH gekoppelt an eine Vorsäule in das Flüssigchromatographie-System. Stellen Sie die Säulentemperatur auf 55 Grad Celsius und den Durchfluss auf 300 Mikroliter pro Minute ein.Wenn alle Parameter festgelegt sind, laden Sie zehn Mikroliter eines Extraktionsrohlings, bevor Sie die erste Probe laden. Trennen Sie dann die verschiedenen Lipidarten mit dem flüssigen Chromatographiegradienten, wie angegeben. Es wird ein repräsentatives Gesamtionenchromatogramm aus den LC-MS-Daten für die aus den Zellen extrahierten Lipide erzeugt.Für die massenspektrometrische Analyse der extrahierten Lipide laden Sie die Proben auf ein Massenspektrometer, das mit einer beheizten Elektro-Sprüh-Ionen-Ionenquelle ausgestattet ist, und legen Sie die in der Tabelle beschriebenen Analyseparameter fest. Verwenden Sie den Fourier Transform Analyzer, um MS-1-Elternionen mit einer Auflösung von 60 000 und im Massenbereich von 150-2000 Daltons zu erkennen. Erkennen Sie dann die MS-2-Sekundärionen mithilfe der in der Tabelle angegebenen Einstellungen.Um verschiedene Lipide aus breiten Tandem-LC-MS-Dateien zu identifizieren und zu quantifizieren, suchen Sie LC-MS-Rohdateien mit vollständigen Scan-MS-1-Daten und datenabhängigen MS-2-Daten kostenlos, unesterifizierte Fettsäuren, Cardio-Lipid, Phytocerimid, Phytosphyngocen, Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatydlglycerol, Phosphatydlinositol, Phosphatydlserin und Triacylglycerol Lipidklassen unter Verwendung einer Masse geteilt durch Ladungstoleranz von fünf Teilen pro Million für Vorläuferionen und zehn Teile pro Million für Produktionen. Folgen Sie dann den Anweisungen in der Bedienungsanleitung der Software, um interne Lipidstandards und Lipidarten mit ungewöhnlichen Fettsäurezusammensetzungen zu identifizieren. Diese empfindliche Tandem-LC-MS-Methode ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung molekularer Lipidarten in Konzentrationen von bis zu 0,165 Picomolar pro Mikroliter.Diese Quantifizierungsgrenze unterscheidet sich von verschiedenen Lipidklassen innerhalb eines breiten Konzentrationsspektrums. Diese Methode kann verwendet werden, um die Effizienz der Ionisation für Lipide durch den Einsatz alternativer mobiler Phasenadditive für die Elektrospray-Ionisationsmassenspektrometrie zu erhöhen. Jeder dieser alternativen mobilen Phasenadditive kann sowohl für die normale Phase als auch für die Reverse-Phase-LC-Säulen verwendet werden.Die kollisionsinduzierte Dissoziationsmethode ist vorteilhaft, wenn sie in Kombination mit dem mobilen Ammoniumacetat-Phasenadditiv für die Elektro-Spray-Ionisation sentolische negative Art der Massenspektrometrie verwendet wird, da sie unter diesen Bedingungen die Effizienz der MS-1 Lipidionenfragmentierung in MS-2-Produkte ermöglicht. Im Gegensatz dazu ist die hochenergetische, kollisionsfreie Dissoziationsmethode günstig, wenn sie in Kombination mit dem ammoniumformate mobilen Phasenadditiv für die Elektro-Sprühion-positive Art der Massenspektrometrie verwendet wird, da sie unter diesen Bedingungen eine Effizienzsteigerung der MS-1 Lipidionenfragmentierung in MS-2-Produkte ermöglicht. Mischen Sie die Phasen nicht beim Sammeln der organischen Phase.Schließen Sie die Rohre unter dem Stickstoffgasstrom. Beseitigen Sie eine Blase innerhalb des Inserts und verbinden Sie die Spalte in die richtige Richtung. Wenn die Identität eines Peaks nicht durch LC-MS bestimmt werden kann, kann MS-NMR verwendet werden, um die Struktur dieses Moleküls abzuleiten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Forschung

Biochemie

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Ein Tandem-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierter Ansatz zur Analyse von Metabolit<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Glycoproteomics der extrazellulären Matrix: eine Methode zur Intact Glycopeptidthioestern Analyse unter Verwendung von Massenspektrometrie

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identifizierung von Inositolphosphat oder Phosphoinositid-Wechselwirkungsproteinen durch Affinitätschromatographie gekoppelt an Western Blot oder Massenspektrometrie

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolute Quantifizierung des zellfreien Proteinsynthesestoffwechsels durch Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Ungezielte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierte Metabolomik-Analyse von Weizengetreide

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...