Name: quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry
Uploaded: 2020-03-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

אנו אסירי תודה לחברים הנוכחיים ולשעבר של מעבדת טיטורנקו לדיונים. אנו מכירים את המרכז ליישומים ביולוגיים של המסה ספקטרומטריה והמרכז לגנומיקה מבנית ופונקציונלית (הן באוניברסיטת קונקורדיה) עבור שירותים יוצאי דופן. מחקר זה היה נתמך על ידי מענקים מדעי הטבע והמועצה למחקר הנדסי (NSERC) של קנדה (RGPIN 2014-04482) ו האוניברסיטה האוניברסיטאי קונקורדיה קרן (CC0113). ק היה נתמך על ידי פרס הצטיינות באוניברסיטת קונקורדיה.

1. הכנת מדיה סטרילית לשמרים מפני שמרים
<ol><li>להכין 90 mL של מדיום מלאה YP המכיל 1% (w/v) תמצית שמרים 2% (w/v) bactopeptone.</li>
	<li>הכינו 90 mL של בינוני סינתטי מינימלי YNB המכיל 0.67% (w/v) שמרים חנקן בסיס ללא חומצות אמינו, 20 מ"ג/L l-histidine, 30 מ"ג/l l-leucine, 30 מ"ג/l ל-ליזין, ו 20 מ"ג/l uracil.</li>
	<li>חילוק 90 mL של מדיום מלאה YP ...

<ol>
	<li>Bou Khalil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+era:+accomplishments+and+challenges.">Lipidomics era: accomplishments and challenges.</a> Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).</li><li>Shevchenko, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+coming+to+grips+with+lipid+diversity.">Lipidomics: coming to grips with lipid diversity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).</li><li>Br&#252;gger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+analysis+of+the+lipid+composition+of+cells+and+subcellular+organelles+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).</li><li>Zechner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAT+SIGNALS+-+lipases+and+lipolysis+in+lipid+metabolism+and+signaling.">FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling.</a> Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).</li><li>Eisenberg, T., B&#252;ttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+and+cell+death+in+yeast.">Lipids and cell death in yeast.</a> FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).</li><li>Richard, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+liponecrosis,+a+distinct+mode+of+programmed+cell+death.">Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death.</a> Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).</li><li>Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+the+discovery+of+anti-tumor+pharmaceuticals:+searching+for+activators+of+liponecrosis.">A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis.</a> Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).</li><li>M&#229;rtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+lipids+on+mitochondrial+functions.">Effects of lipids on mitochondrial functions.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).</li><li>Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-bilayer+phospholipids+in+mitochondrial+structure+and+function.">The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function.</a> FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).</li><li>Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+membrane+turnover+by+phosphatidic+acid:+cellular+functions+and+disease+implications.">Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).</li><li>Goldberg, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+of+lipid+droplets+in+regulating+longevity.">A novel function of lipid droplets in regulating longevity.</a> Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).</li><li>Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obese+and+anorexic+yeasts:+experimental+models+to+understand+the+metabolic+syndrome+and+lipotoxicity.">Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).</li><li>Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+metabolism+and+cellular+aging.">Peroxisome metabolism and cellular aging.</a> Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).</li><li>Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+regulation+of+glycerolipids+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).</li><li>Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+peroxisomes:+key+players+in+cellular+lipid+homeostasis+or+a+matter+of+fat--store+'em+up+or+burn+'em+down.">Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down.</a> Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).</li><li>Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+topology+and+regulation+of+cardiolipin+biosynthesis+and+remodeling+in+yeast.">The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).</li><li>Dimmer, K. S., Rapaport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+contact+sites+as+platforms+for+phospholipid+exchange.">Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).</li><li>Csord&#225;s, G., Weaver, D., Hajn&#243;czky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contactology:+structure+and+signaling+functions.">Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions.</a> Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).</li><li>Mitrofanova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+and+transport+define+longevity+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).</li><li>Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+contact+zones+as+sites+for+lipid+transfer.">Organelle contact zones as sites for lipid transfer.</a> Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).</li><li>Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).</li><li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast:+an+experimental+organism+for+21st+Century+biology.">Yeast: an experimental organism for 21st Century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li><li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+for+budding+geneticists:+a+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system.">Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li><li>Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+surrogate+and+chemical+genetics+in+model+organisms+can+suggest+therapies+for+human+genetic+diseases.">How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases.</a> Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).</li><li>Zimmermann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+tool+to+identify+anti-aging+compounds.">Yeast as a tool to identify anti-aging compounds.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).</li><li>Ejsing, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+yeast+lipidome+by+quantitative+shotgun+mass+spectrometry.">Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).</li><li>Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+lipid+analysis+and+quantification+by+mass+spectrometry.">Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry.</a> Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).</li><li>Guan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+membrane+lipidomics+during+Drosophila+development.">Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development.</a> Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).</li><li>Klose, C., Tarasov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+yeast+lipids+by+shotgun+lipidomics.">Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).</li><li>Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+advances+in+shotgun+lipidomics+for+biology+and+medicine.">Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine.</a> Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).</li><li>Sud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMSD:+LIPID+MAPS+structure+database.">LMSD: LIPID MAPS structure database.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).</li><li>Pauling, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposal+for+a+common+nomenclature+for+fragment+ions+in+mass+spectra+of+lipids.">Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids.</a> PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).</li></ol>

אמצעי הזהירות הבאים חשובים ליישום המוצלח של הפרוטוקול המתואר כאן:
1. כלורופורם ומתנול רעילים. הם מחלצים ביעילות חומרים שונים ממשטחים, כולל פלסטלינה, מעבדה ועור. לכן, לטפל אלה ממיסים אורגני עם זהירות על ידי הימנעות השימוש בפלסטיק בשלבים הכרוכים במגע עם כלורופורם ו/או מתנול, ב?...

גוף של ראיות מציין כי שומנים, אחת המחלקות הגדולות של biomolecules, לשחק תפקידים חיוניים בתהליכים חיוניים רבים בתוך תא איקריוטית. תהליכים אלה כוללים את ההרכבה של bilayers השומנים המהווים את קרום פלזמה וממברנות המקיפים אורגלים סלולריים, הובלה של מולקולות קטנות על פני ממברנות התא, תגובה שינויים בסביבה החילוץ והתמרה האות תאיים, הדור והאחסון של אנרגיה, ייבוא וייצוא של חלבונים מוגבלים אורגלים שונים, סחר בסמים של חלבונים בתוך מערכת endomembrane הפרשת חלבון, ומספר מצבים של מוות תא מוסדר1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10
שמרים שלהניצנים, האורגניזם איקריוטית, בהצלחה בשימוש כדי לחשוף חלק מהמנגנונים המשמשים את התפקידים החיוניים של שומנים בתהליכים סלולריים חיוניים אלה4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,12/10/4, 19 ,16,17,18,19,20. ס. cerevisiae ס הוא אורגניזם מודל יקר לחשיפת מנגנונים אלה משום שהוא מוכן לטיפול מקיף ביוכימיים, גנטי, תא ביולוגי, ביולוגי כימי, מערכת ביולוגית, וניתוח מיקרופלואידיג21,22,23,24,25. התקדמות נוספת בהבנת מנגנונים שדרכם מטבוליזם השומנים והתחבורה התאיים תורמים לתהליכים הסלולריים החיוניים הללו מחייב טכנולוגיות מורכבות של ספקטרומטר המסה עבור האפיון הכמותי של lipidome הסלולר, הבנת המורכבות המולקולרית של lipidome ושילוב lipidomics כמותי לתוך פלטפורמת רב תחומיתשל מערכותביולוגיה1,2 27,28,29,30.
שיטות נוכחיות של המיקרופרומטריה כמותית בסיוע lipidomics של תאים שמרים ותאים של אורגניזמים אחרים איקריוטית אינם מספיק רב-תכליתי, חזק, או רגיש. יתר על כן, אלה שיטות בשימוש כרגע אינם יכולים להבדיל מינים שונים isobaric או איזואריק השומנים אחד מהשני. כאן נתאר שיטה רב-תכליתית, איתנה ורגישה המאפשרת שימוש בכרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטר מסה דו-מושביים (LC-MS/MS) לניתוח כמותי של שומנים סלולאריים מרכזיים של S. cerevisiae ס.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>05-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>60180A-SV9-1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A9554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 series LC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1312A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent1100 Wellplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1367A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A470-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiolipin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>750332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centra CL2 clinical centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramide</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C297-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSH C18 VanGuard</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006944</td>
			<td>Pre-column system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free fatty acid (19:0)</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (acid-washed, 425-600 &#956;M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Search software (V4.1)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V4.1</td>
			<td>LC-MS/MS analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylglycerol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylserine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse-phase column CSH C18</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingosine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Orbitrap Velos MS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ETD-10600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricylglycerol</td>
			<td>Larodan, Malmo</td>
			<td>TAG Mixed FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0919-15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strain BY4742</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>YSC1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

ליפידים הם מולקולות אמפיפתיים מגוונות האינן משונות במים. שומנים הם תורמים חיוניים לארגון ולתפקוד של ממברנות ביולוגיים, אחסון אנרגיה וייצור, איתות סלולרי, הובלה והעברה של חלבונים, ארגונית biogenesis, מוסדרות מוות תאים. בגלל שמרים להתחש סכביסים cerevisiae ס הוא חד חד-תאי איקריוטים לניתוח מולקולרי יסודית, השימוש בו כאורגניזם מודל עזר לחשוף מנגנונים המקשרים חילוף החומרים ליפיד ותחבורה תאיים לתהליכים ביולוגיים מורכבים בתוך תאים איקריוטית. הזמינות של שיטה אנליטית רב-תכליתית להערכה הכמותית האיתנה, הרגישה והמדויקת של מחלקות שומנים גדולות בתוך תא שמרים, חיונית לקבלת תובנות עמוקות במנגנונים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול להשתמש כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטר מסה מאסיבית (LC-MS/MS) עבור ניתוח כמותי של שומנים סלולריים מרכזיים של S. cerevisiae. שיטת LC-MS/MS המתוארת היא מגוונת ואיתנה. היא מאפשרת זיהוי וקוונפיקציה של מינים רבים (כולל צורות isobaric או איזואריק שונים) בתוך כל אחד 10 שיעורי השומנים. שיטה זו היא רגישה ומאפשרת זיהוי וכימות של כמה מינים שומנים בריכוזים נמוך כמו 0.2 pmol/μL. השיטה הוחלה בהצלחה על הערכת כיפות של תאי שמרים שלמים והאורגלים הטהרה שלהם. השימוש בתוספים אלטרנטיביים בשלב הנייד עבור הספקטרומטר ההמוני הגדול בשיטה זו יכול להגביר את יעילות האינון עבור מינים מסוימים של השומנים, ולכן ניתן להשתמש בהם כדי לשפר את הזיהוי והכמת שלהם.

השיטה שלנו להערכה כמותית של שומנים סלולריים מרכזיים בתוך תא שמרים בעזרת LC-MS/MS היה רב-תכליתי וחסון. זה איפשר לנו לזהות ולכמת 10 שיעורים שונים ליפיד בתאי S. cerevisiae ס תרבותי במדיום הסינתטי מינימלי ynb מכיל בתחילה 2% גלוקוז. שיעורי השומנים הללו כוללים חומצות שומן בחינם (FFA), קלר...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

אנו מציגים פרוטוקול באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטר מסה דו-מושביים כדי לזהות ולכמת ליפידים סלולריים עיקריים ב סכביסים cerevisiae ס. השיטה המתוארת להערכה כמותית של שיעורי השומנים העיקריים בתוך תא שמרים הוא רב-תכליתי, חסון ורגיש.

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

פרוטוקול זה מספק שיטה מדויקת לשחזור לכמת עשר מחלקות שומנים שונות של Saccharomyces cerevisiae באמצעות שיטת מיצוי אחת ושיטת LC-MS אחת. שיטה זו מאפשרת איתור וכמות של מינים איזובריים איזובריים ושומנים איזומטריים בעלי תכונות כימיות ופיזיות שונות. לתרבות Saccharomyces cerevisiae, הוסיפו תחילה 5 מ"ל של תמיסת מלאי סטרילית של 20% גלוקוז לכל אחד משני בקבוקוני ארלנאמאייר המכילים מדיום YNB סטרילי לריכוז סופי של 2% גלוקוז.לאחר מכן, השתמש פיפטה סטרילית להעביר נפח של תרבות שמרים לילה המכיל חמש פעמים עשרה לתאי השמרים השביעי לתוך כל בקבוק ולתרבת את flasks לפחות 24 שעות ב 30 מעלות צלזיוס עם רעידות סיבוב ב 200 מהפכות לדקה. עבור שאיבת שומנים, לקבוע את המספר הכולל של תאי שמרים למיליליטר של תרבות ולהעביר חמש פעמים עשר לתאים השביעי לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל. מוסיפים מים קרים כקרח ננו טהורים כדי להביא את הנפח הכולל עד 15 מ"ל ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.להשעות מחדש את גלולת שמרים ב 15 מ"ל של קרח קר iso-טוניק אמוניום ביקרבונט חיץ עבור צנטריפוגה שנייה להשעות מחדש את גלולה ב 1.5 מ"ל של קר קרח קר אמוניום bicarbonate פתרון. בסוף הצנטריפוגה, לאחסן את גלולה ב 80 מעלות צלזיוס עד החילוץ. כדי להתחיל את מיצוי השומנים, להפשיר את גלולת התא על קרח לפני השעיית התאים מחדש ב 200 microliters של קרח קר ננו טהור מים.במכסה המנוע אדים, להעביר את ההשעיה התא 15 מ"ל, זכוכית בעוצמה גבוהה, בורג צינור צנטריפוגה העליון עם כובע מצופה polytetrafluoroethylene ולהוסיף 25 microliters של תערובת סטנדרטים שומנים פנימיים, מוכן 2:1 מתנול כלורופורם. 100 מיקרוליטרים של 425 עד 600 חומצה מיקרומולרית שטפו בחנוזי זכוכית ו-600 מיקרוליטרים של מתנול כלורופורם 17:1 לצינור. מערבולת הצינור במהירות גבוהה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לשבש את התאים.ואחריו מערבולת במשך שעה במהירות נמוכה בטמפרטורת החדר כדי להקל על מיצוי השומנים. בסוף החילוץ, הדגירה את המדגם במשך 15 דקות על הקרח, כדי לקדם משקעים חלבון ואת ההפרדה של שלבים מיווים ואורגניים. בסוף הדגירה, צנטריפוגה המדגם כדי להפריד עוד יותר את השלב הממימי העליון מהשלב האורגני התחתון, במכסה המנוע של האדים, להשתמש פיפטה זכוכית borosilicate להעביר את השלב האורגני התחתון חדש 15 מיליליטר זכוכית חוזק גבוה בורג צינור צנטריפוגה העליון עם כובע מצופה polytetrafluoroethylene.מניחים את השלב האורגני התחתון תחת זרימת גז חנקן, במכסה המנוע של האדים, מוסיפים 300 מיקרוליטרים של תערובת מתנול כלורופורם 2:1 לשלב המימי העליון הנותר. כדי להקל על פוספטידיקאציד, פוספטידילסרין, פוספטידילינוזיטול ומערבולת מיצוי לב-שומנים הצינור במרץ במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לפני צנטריפוגה המדגם. השתמש פיפטה זכוכית borosilicate להעביר את השלב האורגני התחתון לתוך השלב האורגני התחתון תחת חנקן ולאדות את הממס בשלבים האורגניים המשולבים במכסה המנוע אדים.לאחר מכן, לסגור את הצינורות של סרט השומנים תחת זרימת גז חנקן ולאחסן את הדגימות ב 80 מעלות צלזיוס. עבור כרומטוגרפיה נוזלית, הפרדת השומנים המופקים ב 500 microliters של 63:35:5 אצטו ניטריל-2-פרופנול ננו טהור תערובת מים לצינור של סרט השומנים ומערבולת שלוש פעמים במשך עשר שניות למערבולת בטמפרטורת החדר. נושא תוכן הצינור sonication קולי במשך 15 דקות לפני מערבולת הצינור שלוש פעמים במשך עשר שניות לכל מערבולת כפי שהוכח רק.להעביר 100 microliters של המדגם לתוך בקבוקון זכוכית עם הכנס המשמש עבור צלחת 24 גם לחסל את כל הבועות בתוך הכנס. מניחים את ההוספה לתוך באר אחת של צלחת 24 באר טען שלב הפוך C18 עמודה CSH יחד לעמודה מראש לתוך מערכת כרומטוגרפיה נוזלית. הגדר את טמפרטורת העמוד ל 55 מעלות צלזיוס ואת הזרימה ל 300 microliters לדקה.כאשר כל הפרמטרים נקבעו, לטעון עשרה microliters של חילוץ ריק לפני טעינת המדגם הראשון. לאחר מכן, להפריד את מיני השומנים השונים באמצעות שיפוע כרומטוגרפיה נוזלי, כפי שצוין. כרומטוגרמת יון כוללת מייצגת מנתוני LC-MS עבור השומנים שחולצו מהתאים תיווצר.לניתוח ספקטרומטרי מסה של השומנים שחולצו, לטעון את הדגימות על ספקטרומטר מסה מצויד במקור יון יינון אלקטרו-ספריי מחומם ולהגדיר את פרמטרי הניתוח כמתואר בטבלה. השתמש מנתח טרנספורמציה פורייה כדי לזהות את היונים אב MS-1 ברזולוציה של 60, 000 ובטווח המסה של 150-2000 דלתונים. לאחר מכן, זהה את היונים המשניים MS-2 באמצעות ההגדרות כפי שצוין בטבלה.כדי לזהות ולכימת שומנים שונים מקבצי LC-MS דו-מושביים רחבים, חפש בקבצים גולמיים של LC-MS המכילים נתוני MS-1 סריקה מלאה ותלויים בנתונים MS-2 עבור חומצות שומן לא מאושרות בחינם, לב-שומנים, פיטוצריד, פיטו-פינגוקולן, פוספטידילכולין, פוספטידילטנולאמין, פוספטידליגלגלצרול, פוספטידלינוזיטול, פוספטידלסרין וטריאצ'ילגלצרול השומנים באמצעות מסה המחולקת על ידי סובלנות תשלום של חמישה חלקים למיליון עבור יונים מבשרים ועשרה חלקים למיליון עבור יוסונים מוצרים. לאחר מכן, בצע את ההוראות המופיעות במדריך למשתמש התוכנה כדי לזהות תקני שומנים פנימיים ומינים שומנים עם קומפוזיציות חומצות שומן יוצא דופן. שיטת LC-MS טנדם רגישה זו מאפשרת זיהוי וכימות של מינים מולקולריים של שומנים בריכוזים הנמוכים מ- 0.165 פיקומולר למיקרוליטר.מגבלה זו של כימות שונה משיעורי שומנים שונים במגוון רחב של ריכוזים. שיטה זו יכולה לשמש כדי להגביר את היעילות של יינון עבור שומנים באמצעות תוספי פאזה ניידים חלופיים עבור ספקטרומטריית מסה יינון electrospray. כל אחד מתוספים חלופיים אלה של פאזה ניידת יכול לשמש הן עבור עמודות שלב רגיל והן עבור LC פאזה הפוכה.שיטת דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות מועילה אם נעשה שימוש בשילוב עם תוסף פאזה נייד אמוניום אצטט עבור מצב שלילי יינון אלקטרו-ספריי של ספקטרומטריית מסה, כמו, בתנאים אלה, זה מאפשר את הגידול ביעילות של פיצול יון השומנים MS-1 לתוך מוצרי MS-2. לעומת זאת, האנרגיה הגבוהה, שיטת דיסוציאציה התנגשות הוא חיובי אם נעשה שימוש בשילוב עם תוסף שלב נייד אמוניום formate עבור מצב חיובי יינון אלקטרו-ספריי של ספקטרומטריית מסה כמו בתנאים אלה, זה מאפשר עלייה ביעילות של פיצול יון השומנים MS-1 לתוך מוצרי MS-2. אין לערבב את השלבים בעת איסוף השלב האורגני.סגור את הצינורות תחת זרימת גז חנקן. לחסל כל בועה בתוך להוסיף ולחבר את העמודה בכיוון הנכון. אם זהותו של שיא כלשהו אינה ניתנת לנחישות על-ידי LC-MS, ניתן להשתמש ב- MS-NMR כדי להסיק את המבנה של מולקולה זו.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

בידוד אגל ליפידים על ניתוח כמותי ספקטרומטריית מסה

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Glycoproteomics של מטריקס: שיטה Intact ניתוח Glycopeptide באמצעות ספקטרומטריית מסה

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

זיהוי של אינוזיטול פוספט או זרחן אינטראקציה חלבונים על-ידי כרומטוגרפיה של אהדה מצמידים לאבן חשופה מערבית או ספקטרומטר המסה

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

קוונפיקציה מוחלטת של מטבוליזם החלבון ללא שימוש בפרוטאין על-ידי היפוך-שלב נוזלי כרומטוגרפיה המסה-ספקטרומטריה

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...