Name: quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry
Uploaded: 2020-03-08T15:00:00
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Siamo grati agli attuali ed ex membri del laboratorio Titorenko per le discussioni. Riconosciamo il Centro per le applicazioni biologiche della spettrometria di massa e il Centro per la genomica strutturale e funzionale (entrambe all'Università di Concordia) per i servizi eccezionali. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) del Canada (RGPIN 2014-04482) e del Concordia University Chair Fund (CC0113). K.M. è stato sostenuto dal Concordia University Merit Award.

1. Preparazione di supporti sterili per la coltura del lievito
<ol><li>Preparare 90 mL di un mezzo YP completo che contiene 1% (w/v) di estratto di lievito e 2% (w/v) bactopeptone.</li>
	<li>Preparare 90 mL di un mezzo YNB minimo sintetico contenente 0,67% (w/v) base di azoto di lievito senza aminoacidi, 20 mg/L L-histidina, 30 mg/L -leucina, 30 mg/L L-lisina, e 20 mg/L uracile.</li>
	<li>Dividere 90 mL del mezzo YP completo equamente in due flaconi Erlenmeyer da 250 mL (cioè 45 mL ciascuno)...

<ol>
	<li>Bou Khalil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+era:+accomplishments+and+challenges.">Lipidomics era: accomplishments and challenges.</a> Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).</li><li>Shevchenko, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+coming+to+grips+with+lipid+diversity.">Lipidomics: coming to grips with lipid diversity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).</li><li>Br&#252;gger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+analysis+of+the+lipid+composition+of+cells+and+subcellular+organelles+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).</li><li>Zechner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAT+SIGNALS+-+lipases+and+lipolysis+in+lipid+metabolism+and+signaling.">FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling.</a> Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).</li><li>Eisenberg, T., B&#252;ttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+and+cell+death+in+yeast.">Lipids and cell death in yeast.</a> FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).</li><li>Richard, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+liponecrosis,+a+distinct+mode+of+programmed+cell+death.">Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death.</a> Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).</li><li>Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+the+discovery+of+anti-tumor+pharmaceuticals:+searching+for+activators+of+liponecrosis.">A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis.</a> Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).</li><li>M&#229;rtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+lipids+on+mitochondrial+functions.">Effects of lipids on mitochondrial functions.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).</li><li>Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-bilayer+phospholipids+in+mitochondrial+structure+and+function.">The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function.</a> FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).</li><li>Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+membrane+turnover+by+phosphatidic+acid:+cellular+functions+and+disease+implications.">Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).</li><li>Goldberg, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+of+lipid+droplets+in+regulating+longevity.">A novel function of lipid droplets in regulating longevity.</a> Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).</li><li>Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obese+and+anorexic+yeasts:+experimental+models+to+understand+the+metabolic+syndrome+and+lipotoxicity.">Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).</li><li>Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+metabolism+and+cellular+aging.">Peroxisome metabolism and cellular aging.</a> Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).</li><li>Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+regulation+of+glycerolipids+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).</li><li>Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+peroxisomes:+key+players+in+cellular+lipid+homeostasis+or+a+matter+of+fat--store+'em+up+or+burn+'em+down.">Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down.</a> Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).</li><li>Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+topology+and+regulation+of+cardiolipin+biosynthesis+and+remodeling+in+yeast.">The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).</li><li>Dimmer, K. S., Rapaport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+contact+sites+as+platforms+for+phospholipid+exchange.">Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).</li><li>Csord&#225;s, G., Weaver, D., Hajn&#243;czky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contactology:+structure+and+signaling+functions.">Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions.</a> Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).</li><li>Mitrofanova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+and+transport+define+longevity+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).</li><li>Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+contact+zones+as+sites+for+lipid+transfer.">Organelle contact zones as sites for lipid transfer.</a> Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).</li><li>Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).</li><li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast:+an+experimental+organism+for+21st+Century+biology.">Yeast: an experimental organism for 21st Century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li><li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+for+budding+geneticists:+a+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system.">Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li><li>Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+surrogate+and+chemical+genetics+in+model+organisms+can+suggest+therapies+for+human+genetic+diseases.">How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases.</a> Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).</li><li>Zimmermann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+tool+to+identify+anti-aging+compounds.">Yeast as a tool to identify anti-aging compounds.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).</li><li>Ejsing, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+yeast+lipidome+by+quantitative+shotgun+mass+spectrometry.">Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).</li><li>Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+lipid+analysis+and+quantification+by+mass+spectrometry.">Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry.</a> Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).</li><li>Guan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+membrane+lipidomics+during+Drosophila+development.">Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development.</a> Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).</li><li>Klose, C., Tarasov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+yeast+lipids+by+shotgun+lipidomics.">Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).</li><li>Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+advances+in+shotgun+lipidomics+for+biology+and+medicine.">Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine.</a> Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).</li><li>Sud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMSD:+LIPID+MAPS+structure+database.">LMSD: LIPID MAPS structure database.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).</li><li>Pauling, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposal+for+a+common+nomenclature+for+fragment+ions+in+mass+spectra+of+lipids.">Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids.</a> PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).</li></ol>

Le seguenti precauzioni sono importanti per la corretta implementazione del protocollo descritto di seguito:
1. Il cloroformio e il metanolo sono tossici. Estraggono in modo efficiente varie sostanze dalle superfici, tra cui plasticware di laboratorio e la pelle. Pertanto, gestire questi solventi organici con cautela evitando l'uso di materie plastiche in passaggi che comportano il contatto con cloroformio e/o metanolo, utilizzando pipette di vetro borosilicato per questi passaggi e risciacqua...

Un insieme di prove indica che i lipidi, una delle principali classi di biomolecole, svolgono un ruolo essenziale in molti processi vitali all'interno di una cellula eucarome. Questi processi includono l'assemblaggio di bistrati lipidici che costituiscono la membrana plasmatica e le membrane che circondano gli organelli cellulari, il trasporto di piccole molecole attraverso le membrane cellulari, la risposta ai cambiamenti nell'ambiente extracellulare e la trasduzione del segnale intracellulare, la generazione e lo stoccaggio dell'energia, l'importazione e l'esportazione di proteine confinate a diversi organelli, il traffico vescicolare di proteine all'interno del sistema endomembrana e della segreteria delle proteine, e diversi modi regolati di morte cellulare1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Il lievito in erba S. cerevisiae, un organismo eucariotico unicellulare, è stato utilizzato con successo per scoprire alcuni dei meccanismi alla base dei ruoli essenziali dei lipidi in questi processi cellulari vitali4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae è un organismo modello prezioso per scoprire questi meccanismi perché è suscettibile di biochimica completa, genetica, cellula biologica, biologica chimica, sistema biologica, e microfluidica dissezione analisi21,22,23,24,25. Ulteriori progressi nella comprensione dei meccanismi attraverso i quali il metabolismo lipidico e il trasporto intracellulare contribuiscono a questi processi cellulari vitali richiedono tecnologie sensibili di spettrometria di massa per la caratterizzazione quantitativa del lipidome cellulare, la comprensione della complessità molecolare lipidoma e l'integrazione della lipidomica quantitativa in una piattaforma multidisciplinare della biologia dei sistemi1,2,3,26, 27,28,29,30.
Gli attuali metodi per la lipidomica quantitativa assistita dalla spettrometria di massa delle cellule di lievito e delle cellule di altri organismi eucarioti non sono sufficientemente versatili, robusti o sensibili. Inoltre, questi metodi attualmente utilizzati non sono in grado di distinguere varie specie di lipidi isobarici o isomeriche l'una dall'altra. Qui descriviamo un metodo versatile, robusto e sensibile che permette l'uso di cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per l'analisi quantitativa dei principali lipidi cellulari di S. cerevisiae.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>05-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>60180A-SV9-1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A9554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 series LC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1312A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent1100 Wellplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1367A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A470-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiolipin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>750332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centra CL2 clinical centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramide</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C297-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSH C18 VanGuard</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006944</td>
			<td>Pre-column system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free fatty acid (19:0)</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (acid-washed, 425-600 &#956;M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Search software (V4.1)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V4.1</td>
			<td>LC-MS/MS analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylglycerol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylserine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse-phase column CSH C18</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingosine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Orbitrap Velos MS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ETD-10600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricylglycerol</td>
			<td>Larodan, Malmo</td>
			<td>TAG Mixed FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0919-15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strain BY4742</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>YSC1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

I lipidi sono molecole anfipatiche strutturalmente diverse che sono insolubili in acqua. I lipidi sono contributori essenziali all'organizzazione e alla funzione delle membrane biologiche, dello stoccaggio e della produzione di energia, della segnalazione cellulare, del trasporto vescicolare delle proteine, della biogenesi dell'orgelli e della morte cellulare regolata. Poiché il lievito in erba Saccharomyces cerevisiae è un euaryote unicellulare che consente di analizzare molecolari approfondite, il suo uso come organismo modello ha contribuito a scoprire meccanismi che collegano il metabolismo dei lipidi e il trasporto intracellulare a complessi processi biologici all'interno di cellule eucariotiche. La disponibilità di un metodo analitico versatile per una valutazione quantitativa robusta, sensibile e accurata delle principali classi di lipidi all'interno di una cellula di lievito è fondamentale per ottenere informazioni approfondite su questi meccanismi. Qui presentiamo un protocollo per utilizzare la cromatografia liquida accoppiata con la spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per l'analisi quantitativa dei principali lipidi cellulari di S. cerevisiae. Il metodo LC-MS/MS descritto è versatile e robusto. Consente l'identificazione e la quantificazione di numerose specie (comprese diverse forme isobariche o isomeriche) all'interno di ciascuna delle classi di 10 lipidi. Questo metodo è sensibile e consente l'identificazione e la quantificazione di alcune specie di lipidi a concentrazioni a partire da 0,2 pmol/L. Il metodo è stato applicato con successo alla valutazione dei lipidomi delle cellule intere del lievito e dei loro organelli purificati. L'uso di additivi alternativi di fase mobile per la spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray in questo metodo può aumentare l'efficienza della ionizzazione per alcune specie lipidiche e può quindi essere utilizzato per migliorarne l'identificazione e la quantitazione.

Il nostro metodo per una valutazione quantitativa dei principali lipidi cellulari all'interno di una cellula di lievito con l'aiuto di LC-MS/MS era versatile e robusto. Ci ha permesso di identificare e quantificare 10 diverse classi di lipidi nelle cellule S. cerevisiae coltivate nel mezzo YNB minimo sintetico inizialmente contenente il 2% di glucosio. Queste classi lipidiche includono acidi grassi liberi (non esterificati) (FFA), CL, fitoceramide (PHC), fitosphingosine (PHS), PC...

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Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Vi presentiamo un protocollo che utilizza la cromatografia liquida accoppiata con la spettrometria di massa tandem per identificare e quantificare i principali lipidi cellulari in Saccharomyces cerevisiae. Il metodo descritto per una valutazione quantitativa delle principali classi lipidiche all'interno di una cellula di lievito è versatile, robusto e sensibile.

Analisi quantitativa del Lipidome cellulare di Saccharomyces Cerevisiae Utilizzando la cromatografia Liquida Accoppiata con la Spettrometria di Massa Tandem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Questo protocollo fornisce un metodo accurato e riproducibile per quantificare dieci diverse classi lipidiche di Saccharomyces cerevisiae utilizzando un unico metodo di estrazione e un singolo metodo LC-MS. Questo metodo consente il rilevamento e la quantificazione di specie lipidiche isobariche e isomeriche aventi diverse proprietà chimiche e fisiche. Per la coltura di Saccharomyces cerevisiae, aggiungere prima 5 ml di soluzione sterile di 20% di glucosio a ciascuno dei due contenitori Erlenmeyer contenenti mezzo YNB sterile a una concentrazione finale del 2% di glucosio.Quindi, utilizzare una pipetta sterile per trasferire un volume di una coltura di lievito durante la notte contenente cinque per dieci alla settima parte del lievito in ogni pallone e colturare i contenitori per almeno 24 ore a 30 gradi Celsius con scuotimento rotazionale a 200 giri al minuto. Per l'estrazione lipidica, determinare il numero totale di cellule di lievito per millilitro di coltura e trasferire cinque volte dieci alla settima cellule in un tubo di centrifuga da 15 ml. Aggiungere acqua nano-pura ghiacciata per portare il volume totale fino a 15 ml e raccogliere le cellule per centrifugazione.Sospendere il pellet di lievito in 15 ml di tampone di bicarbonato di ammonio isotonico freddo ghiaccio per una seconda centrifugazione e sospendere il pellet in 1,5 ml di soluzione di bicarbonato di ammonio freddo ghiaccio fresco. Al termine della centrifugazione, conservare il pellet a 80 gradi celsius fino all'estrazione. Per iniziare l'estrazione lipidica, scongelare il pellet cellulare sul ghiaccio prima di sospendere di nuovo le cellule in 200 microlitri di acqua nano-pura ghiacciata.In una cappa aspirante, trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga superiore da 15 ml, ad alta resistenza, con cappuccio rivestito in politetrafluoroetilene e aggiungere 25 microlitri di una miscela interna di standard lipidici, preparati in metanolo cloroformio 2:1. 100 microlitri da 425 a 600 perline di vetro lavato con acido micromolare e 600 microlitri di un metanolo cloroformio 17:1 al tubo. Vortice il tubo ad alta velocità per cinque minuti a temperatura ambiente per interrompere le cellule.Seguito da vortice per un'ora a bassa velocità a temperatura ambiente per facilitare l'estrazione lipidica. Al termine dell'estrazione, incubare il campione per 15 minuti sul ghiaccio, per favorire la precipitazione proteica e la separazione delle fasi acquose e organiche. Al termine dell'incubazione, centrifugare il campione per separare ulteriormente la fase acquosa superiore dalla fase organica inferiore e, nella cappa dei fumi, utilizzare una pipetta di vetro borosilicato per trasferire la fase organica inferiore in un nuovo tubo di centrifuga superiore a vite in vetro ad alta resistenza da 15 ml con cappuccio rivestito in polietilene.Posizionare la fase organica inferiore sotto il flusso di gas azoto e, nella cappa dei fumi, aggiungere 300 microlitri di una miscela di metanolo cloroformio 2:1 alla fase acquosa superiore rimanente. Per facilitare il fosfatidipide, la fosfatidilserina, il fosfatidilinositolo e il vortice di estrazione cardio-lipidico il tubo vigorosamente per cinque minuti a temperatura ambiente prima di centrifugare il campione. Utilizzare una pipetta di vetro borosilicata per trasferire la fase organica inferiore nella fase organica inferiore sotto azoto ed evaporare il solvente nelle fasi organiche combinate nella cappa dei fumi.Quindi, chiudere i tubi del film lipidico sotto il flusso di gas azoto e conservare i campioni a 80 gradi Celsius. Per la cromatografia liquida, separazione dei lipidi estratti a 500 microlitri di una miscela di acqua nano-pura aceto-nitrile-2-propanolo 63:35:5 al tubo di pellicola lipidica e vortice tre volte per dieci secondi per vortice a temperatura ambiente. Sottoseti il contenuto del tubo alla sonicazione ad ultrasuoni per 15 minuti prima di vortice del tubo tre volte per dieci secondi per vortice, come appena dimostrato.Trasferire 100 microlitri del campione in una fiala di vetro con un inserto utilizzato per una piastra da 24 pozza ed eliminare eventuali bolle all'interno dell'inserto. Posizionare l'inserto in un unico pozzo di una piastra a 24 porsi e caricare una CSH a colonna C18 in fase inversa accoppiata a una pre-colonna nel sistema di cromatografia liquida. Impostare la temperatura della colonna su 55 gradi celsius e il flusso su 300 microlitri al minuto.Una volta impostati tutti i parametri, caricare dieci microlitri di un vuoto di estrazione prima di caricare il primo campione. Quindi, separare le diverse specie lipidiche utilizzando il gradiente di cromatografia liquida, come indicato. Verrà generato un cromatogramma ionico totale rappresentativo dai dati LC-MS per i lipidi estratti dalle cellule.Per l'analisi spettrometrica di massa dei lipidi estratti, caricare i campioni su uno spettrometro di massa dotato di una sorgente ionica di ionizzazione elettro-spray riscaldata e impostare i parametri di analisi come delineato nella tabella. Utilizzare l'analizzatore di trasformazioni Di Fourier per rilevare ioni padre MS-1 con una risoluzione di 60.000 e nell'intervallo di massa di 150-2000 dalton. Quindi, rilevare gli ioni secondari MS-2 utilizzando le impostazioni come indicato nella tabella.Per identificare e quantificare diversi lipidi da file LC-MS tandem di ampio livello, cercare file grezzi LC-MS contenenti dati MS-1 a scansione completa e dati MS-2 dipendenti dai dati per acidi grassi liberi e non sterizzati, cardio-lipidi, fitocerimide, fitosphyngocene, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolammina, fosfatidilglicerolo, fosfatidilinositolo, fosfatildlserina e triacilgilcerolo classi lipidiche utilizzando una massa divisa per tolleranza di carica di cinque parti per milione per gli ioni precursori e dieci parti per milione per gli ioni prodotto. Quindi, seguire le istruzioni fornite nel manuale d'uso del software per identificare gli standard lipidici interni e le specie lipidiche con composizioni di acidi grassi insolite. Questo delicato metodo tandem LC-MS consente l'identificazione e la quantificazione di specie molecolari di lipidi a concentrazioni fino a 0,165 picomolare per microlitro.Questo limite di quantificazione differisce dalle diverse classi lipidiche all'interno di un'ampia gamma di concentrazioni. Questo metodo può essere utilizzato per aumentare l'efficienza della ionizzazione per i lipidi utilizzando additivi di fase mobili alternativi per la spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray. Ognuno di questi additivi alternativi per fasi mobili può essere utilizzato sia per le colonne LC di fase normale che in fase inversa.Il metodo di dissociazione indotto dalla collisione è utile se utilizzato in combinazione con l'additivo di fase mobile acetato di ammonio per il modo negativo di ionizzazione elettro-spray della spettrometria di massa, in quanto, in queste condizioni, consente l'aumento dell'efficienza della frammentazione ionica lipidica MS-1 nei prodotti MS-2. Al contrario, il metodo di dissociazione collisionale ad alta energia è favorevole se utilizzato in combinazione con l'additivo di fase mobile in formato ammonio per il modo positivo di ionizzazione elettro-spray della spettrometria di massa come in queste condizioni, consente un aumento dell'efficienza della frammentazione ionica lipidica MS-1 nei prodotti MS-2. Non mescolare le fasi durante la raccolta della fase organica.Chiudere i tubi sotto il flusso di gas azoto. Eliminare qualsiasi bolla all'interno dell'inserto e collegare la colonna nella direzione corretta. Se l'identità di un picco non può essere determinata da LC-MS, MS-NMR può essere usato per dedurre la struttura di quella molecola.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Ricerca

Biochimica

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Un approccio Tandem HPLC-MS-based per analisi dei metaboliti di<em&gt; Staphylococcus aureus</em

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Isolamento Droplet per l&#39;analisi quantitativa dei lipidi Spettrometria di Massa

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Proteoma profonda profilatura di etichettatura isobarico, vasto cromatografia liquida, spettrometria di massa e quantificazione assistita da Software

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Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...