Name: quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry
Uploaded: 2020-03-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

우리는 토론을 위해 Titorenko 실험실의 현재 및 전 회원에게 감사드립니다. 우리는 질량 분석의 생물학적 응용 을위한 센터와 구조 및 기능 유전체학 센터 (모두 콩코르디아 대학에서) 뛰어난 서비스를 인정합니다. 이 연구는 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC)의 보조금에 의해 지원되었다 (RGPIN 2014-04482) 콩코르디아 대학 의자 기금 (CC0113). K.M.은 콩코르디아 대학 공로상을 수상했습니다.

1. 효모 배양용 멸균제 준비
<ol><li>1%(vv) 효모 추출물과 2%(vv) 박토펩톤을 함유한 완전한 YP 배지 90 mL를 준비합니다.</li>
	<li>아미노산이 없는 0.67%(w/v) 효모 질소 염기를 함유하는 합성 최소 YNB 배지 90 mL, 20 mg/L-히스티딘, 30 mg/L L-류신, 30 mg/L L-리신,20 mg/L-라이신, 20 mg/L 우라실을 준비합니다. </li>
	<li>전체 YP 배지의 90 mL을 2개의 250 mL Erlenmeyer 플라스크(즉, 각각 45mL)로 균등하게 나눕...

<ol>
	<li>Bou Khalil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+era:+accomplishments+and+challenges.">Lipidomics era: accomplishments and challenges.</a> Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).</li><li>Shevchenko, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+coming+to+grips+with+lipid+diversity.">Lipidomics: coming to grips with lipid diversity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).</li><li>Br&#252;gger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+analysis+of+the+lipid+composition+of+cells+and+subcellular+organelles+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).</li><li>Zechner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAT+SIGNALS+-+lipases+and+lipolysis+in+lipid+metabolism+and+signaling.">FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling.</a> Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).</li><li>Eisenberg, T., B&#252;ttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+and+cell+death+in+yeast.">Lipids and cell death in yeast.</a> FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).</li><li>Richard, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+liponecrosis,+a+distinct+mode+of+programmed+cell+death.">Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death.</a> Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).</li><li>Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+the+discovery+of+anti-tumor+pharmaceuticals:+searching+for+activators+of+liponecrosis.">A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis.</a> Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).</li><li>M&#229;rtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+lipids+on+mitochondrial+functions.">Effects of lipids on mitochondrial functions.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).</li><li>Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-bilayer+phospholipids+in+mitochondrial+structure+and+function.">The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function.</a> FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).</li><li>Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+membrane+turnover+by+phosphatidic+acid:+cellular+functions+and+disease+implications.">Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).</li><li>Goldberg, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+of+lipid+droplets+in+regulating+longevity.">A novel function of lipid droplets in regulating longevity.</a> Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).</li><li>Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obese+and+anorexic+yeasts:+experimental+models+to+understand+the+metabolic+syndrome+and+lipotoxicity.">Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).</li><li>Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+metabolism+and+cellular+aging.">Peroxisome metabolism and cellular aging.</a> Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).</li><li>Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+regulation+of+glycerolipids+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).</li><li>Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+peroxisomes:+key+players+in+cellular+lipid+homeostasis+or+a+matter+of+fat--store+'em+up+or+burn+'em+down.">Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down.</a> Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).</li><li>Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+topology+and+regulation+of+cardiolipin+biosynthesis+and+remodeling+in+yeast.">The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).</li><li>Dimmer, K. S., Rapaport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+contact+sites+as+platforms+for+phospholipid+exchange.">Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).</li><li>Csord&#225;s, G., Weaver, D., Hajn&#243;czky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contactology:+structure+and+signaling+functions.">Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions.</a> Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).</li><li>Mitrofanova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+and+transport+define+longevity+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).</li><li>Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+contact+zones+as+sites+for+lipid+transfer.">Organelle contact zones as sites for lipid transfer.</a> Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).</li><li>Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).</li><li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast:+an+experimental+organism+for+21st+Century+biology.">Yeast: an experimental organism for 21st Century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li><li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+for+budding+geneticists:+a+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system.">Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li><li>Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+surrogate+and+chemical+genetics+in+model+organisms+can+suggest+therapies+for+human+genetic+diseases.">How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases.</a> Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).</li><li>Zimmermann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+tool+to+identify+anti-aging+compounds.">Yeast as a tool to identify anti-aging compounds.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).</li><li>Ejsing, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+yeast+lipidome+by+quantitative+shotgun+mass+spectrometry.">Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).</li><li>Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+lipid+analysis+and+quantification+by+mass+spectrometry.">Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry.</a> Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).</li><li>Guan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+membrane+lipidomics+during+Drosophila+development.">Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development.</a> Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).</li><li>Klose, C., Tarasov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+yeast+lipids+by+shotgun+lipidomics.">Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).</li><li>Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+advances+in+shotgun+lipidomics+for+biology+and+medicine.">Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine.</a> Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).</li><li>Sud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMSD:+LIPID+MAPS+structure+database.">LMSD: LIPID MAPS structure database.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).</li><li>Pauling, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposal+for+a+common+nomenclature+for+fragment+ions+in+mass+spectra+of+lipids.">Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids.</a> PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).</li></ol>

여기에 설명된 프로토콜을 성공적으로 구현하는 데 는 다음과 같은 예방 조치가 중요합니다.
1. 클로로포름과 메탄올은 독성이 있습니다. 실험실 플라스틱 제품 및 피부를 포함한 표면에서 다양한 물질을 효율적으로 추출합니다. 따라서 이러한 유기 용매는 클로로포름 및/또는 메탄올과 접촉하는 단계에서 플라스틱을 사용하지 않고, 이러한 단계에 보로실리케이트 유리 파이...

증거의 몸은 지질, 생체 분자의 주요 클래스 중 하나, 진핵 세포 내에서 많은 중요한 프로세스에 필수적인 역할을 나타냅니다. 이러한 프로세스는 세포 소기관을 둘러싼 혈장 막과 막을 구성하는 지질 이중층의 조립, 세포막을 가로지르는 소분자의 수송, 세포외 환경및 세포내 신호 전이의 변화에 대한 반응, 에너지의 생성 및 저장, 다른 세포기관에 국한된 단백질의 생성 및 수출, 내막 시스템 및 단백질 분비내의 단백질의 반응 인신매매, 여러 세포 세포 분비, 및 단백질 분비의 수강용 인신, 및 여러 세포 세포 내 단백질의 인신 매매를포함합니다. 2,3,4,5,6,7,8,9,10.
신생 효모 S. cerevisiae,단세포 진핵 생물, 성공적으로 이러한 중요한 세포 과정에서 지질의 필수 역할의 기초메커니즘의 일부를 발견하는 데 사용되었습니다4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae는 포괄적인 생화학적, 유전적, 세포 생물학적, 화학적 생물학적, 시스템 생물학적, 및 미세유체 해부 분석21,22,23,24,25를사용할 수 있기 때문에 이러한 메커니즘을 밝히는 귀중한 모델 유기체이다. 지질 대사와 세포내 수송이 이러한 중요한 세포 과정에 기여하는 이해 메커니즘의 추가 진전은 세포 지질의 정량적 특성화에 대한 민감한 질량 분석 기술을 필요로하며, 지질학 분자 복잡성을 이해하고, 정량적 지질학을 시스템 생물학1,2,3,26의다분야 플랫폼으로 통합합니다. 27,28,29,30.
다른 진핵 생물의 효모 세포 및 세포의 질량 분광법 보조 양적 지질학에 대한 현재 의 방법은 충분히 다재다능하거나, 견고하거나, 민감하지 않다. 더욱이, 이들 현재 사용되는 방법은 서로 다양한 등바성 또는 이소성 지질 종을 분화할 수 없다. 여기에서 우리는 S. cerevisiae의주요 세포 지질의 정량 분석을 위한 탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS)와 결합된 액체 크로마토그래피의 사용을 허용하는 다재다능하고, 견고하고, 민감한 방법을 기술합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>05-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>60180A-SV9-1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A9554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 series LC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1312A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent1100 Wellplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1367A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A470-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiolipin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>750332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centra CL2 clinical centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramide</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C297-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSH C18 VanGuard</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006944</td>
			<td>Pre-column system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free fatty acid (19:0)</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (acid-washed, 425-600 &#956;M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Search software (V4.1)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V4.1</td>
			<td>LC-MS/MS analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylglycerol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylserine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse-phase column CSH C18</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingosine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Orbitrap Velos MS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ETD-10600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricylglycerol</td>
			<td>Larodan, Malmo</td>
			<td>TAG Mixed FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0919-15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strain BY4742</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>YSC1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

지질은 물에서 불용성 구조적으로 다양한 양과 성 분자입니다. 지질은 생물학적 막의 조직과 기능에 필수적인 기여자, 에너지 저장 및 생산, 세포 신호, 단백질의 포식 수송, 세포 생체 발생, 및 조절 된 세포 사멸. 신진 효모 Saccharomyces cerevisiae는 철저한 분자 분석을 할 수 있는 단세포 진핵생물이기 때문에, 모형 유기체로 의 사용은 진핵 세포 내의 복잡한 생물학 프로세스에 지질 물질 대사 및 세포내 수송을 연결하는 기계장치를 밝히는 것을 도왔습니다. 효모 세포 내의 주요 지질 류의 강력하고 민감하며 정확한 정량적 평가를 위한 다목적 분석 방법의 가용성은 이러한 메커니즘에 대한 깊은 통찰력을 얻는 데 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 S. cerevisiae의 주요 세포 지질의 정량 분석을 위한 탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS)와 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 설명된 LC-MS/MS 방법은 다재다능하고 견고합니다. 그것은 10 개의 지질 클래스의 각각 내에서 수많은 종 (다른 등심 또는 이소성 형태 포함)의 식별 및 정량화를 가능하게합니다. 이 방법은 민감하고 0.2 pmol /μL의 낮은 농도에서 일부 지질 종의 식별 및 정량을 허용합니다. 이 방법은 전체 효모 세포와 정제 된 소기관의 지질 을 평가하는 데 성공적으로 적용되었습니다. 이 방법에서 전기 분무 이온화 질량 분광법에 대한 대체 이단 첨가제의 사용은 일부 지질 종에 대한 이온화의 효율을 증가시킬 수 있으며 따라서 그들의 식별 및 정량을 향상시키는 데 사용될 수 있다.

LC-MS/MS의 도움으로 효모 세포 내의 주요 세포 지질의 정량적 평가를 위한 우리의 방법은 다재다능하고 견고했습니다. 처음에는 2% 포도당을 함유하는 합성 최소 YNB 배지에서 배양된 S. 세레비시아세포에서 10개의 상이한 지질 클래스를 식별하고 정량화할 수 있었습니다. 이러한 지질 클래스는 무료(비제스테레화) 지방산(FFA), CL, 피토세라미드(PHC), 피토스핑고신(PHS), P...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

우리는 Saccharomyces cerevisiae에있는 중요한 세포 지질을 확인하고 정량화하기 위하여 탠덤 질량 분광법과 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 프로토콜을 제시합니다. 효모 세포 내의 주요 지질 클래스의 정량적 평가를 위한 설명된 방법은 다재다능하고, 견고하며, 민감하다.

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

이 프로토콜은 단일 추출 방법과 단일 LC-MS 방법을 사용하여 Saccharomyces cerevisiae의 10가지 다른 지질 클래스를 정량화하는 정확하고 재현 가능한 방법을 제공합니다. 이 방법은 다른 화학 적 및 물리적 특성을 갖는 등류 및 이성질성 립질 종의 검출 및 정량화를 허용합니다. Saccharomyces cerevisiae 문화의 경우, 먼저 멸균 YNB 배지를 함유한 2개의 Erlenmeyer 플라스크 각각에 멸균 20%의 포도당 스톡 용액 5ml를 최종 농도인 2%의 포도당에 추가합니다.이어서, 멸균 파이펫을 사용하여 7번째 효모 세포에 5배씩 함유된 야간 효모 배양을 각 플라스크로 옮기고 분당 200회전에서 회전흔들림으로 섭씨 30도에서 적어도 24시간 동안 플라스크를 배양한다. 지질 추출의 경우, 배양의 밀리리터 당 효모 세포의 총 수를 결정하고 15ml 원심분리기 튜브로 일곱 번째 세포로 5회 10번 을 이송한다. 얼음 차가운 나노 순수 한 물을 추가하여 총 부피를 최대 15ml까지 가져 와서 원심 분리로 세포를 수집합니다.효모 펠릿을 얼음 냉이 이소 토닉 암모늄 중탄산염 버퍼 15ml에 재중단하여 두 번째 원심분리를 하고 1.5ml의 신선한 얼음 차가운 암모늄 중탄산염 용액으로 펠릿을 다시 중단합니다. 원심 분리의 끝에, 추출 될 때까지 80섭씨에 펠릿을 저장합니다. 지질 추출을 시작하려면 얼음 에 세포 펠릿을 해동한 후 얼음 차가운 나노 순수 한 물의 200 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하십시오.연기 후드에서, 15ml, 고강도 유리, 폴리테트라플루오로에틸렌 안감 캡나사 상단 원심분리기 튜브로 셀 서스펜션을 옮기고 2:1 클로로폼 메탄올로 제조된 내부 지질 표준 혼합물의 마이크로리터 25를 추가한다. 425~600마이크로몰라산 세척 유리 구슬 100마이크로리터와 튜브에 17:1 클로로폼 메탄올의 600 마이크로리터. 세포를 방해하기 위해 실온에서 5 분 동안 고속으로 튜브를 소용돌이시킵니다.그 다음에는 실온에서 저속으로 1시간 동안 소용돌이를 가하여 지질 추출을 용이하게 합니다. 추출의 끝에서, 얼음에 15 분 동안 샘플을 배양, 단백질 강수량 및 수성 및 유기 단계의 분리를 촉진. 인큐베이션의 끝에서 원심분리는 상부 수성 상과 하부 유기상으로부터 의 상부 수성 위상을 더욱 분리하고, 연기 후드에서, 더 낮은 유기 상을 새로운 15ml 고강도 유리 스크류 상단 원심분리 튜브에 폴리테트라플루오로틸렌 라이닝 캡으로 전송한다.질소 가스의 흐름 아래에 하부 유기 상을 놓고, 연기 후드에, 나머지 상부 수성 상에 2:1 클로로폼 메탄올 혼합물의 300 마이크로리터를 추가합니다. 인산염을 용이하게 하기 위해, 인산다이들세린, 포스파디딜리노시톨 및 심폐지질 추출 소용돌이는 샘플을 원심분리하기 전에 실온에서 5분 동안 적극적으로 튜브를 소용돌이시다. 보로실리케이트 유리 파이펫을 사용하여 질소 하에서 하부 유기 상으로 하부 유기상을 이송하고 연기 후드의 결합된 유기 상에서 용매를 증발시다.그런 다음 질소 가스의 흐름 하에서 지질 필름의 튜브를 닫고 샘플을 섭씨 80도에 저장합니다. 액체 크로마토그래피의 경우, 63:35:5 아세토-니트릴-2-프로파놀 나노 순수 수분 혼합물의 500 마이크로리터에서 추출된 지질을 실온에서 소용돌이 당 10초 동안 3회 지질필름과 소용돌이의 튜브로 분리한다. 튜브 내용내용을 초음파 초음파처리로 15분 간 피사체를 적용한 후 소용돌이당 10초 동안 튜브를 3회 피류로 피합니다.24 웰 플레이트에 사용되는 인서트와 유리 유리 바이알에 샘플의 100 마이크로 리터를 전송하고 삽입 내에서 어떤 거품을 제거합니다. 인서트를 24웰 플레이트의 한 웰에 넣고 액체 크로마토그래피 시스템에 사전 열에 결합된 역상 C18 컬럼 CSH를 로드합니다. 기둥 온도를 섭씨 55도로 설정하고 흐름은 분당 300 마이크로리터로 설정합니다.모든 매개 변수가 설정된 경우 첫 번째 샘플을 로드하기 전에 추출 공백10 마이크로리터를 로드합니다. 이어서, 표시된 바와 같이 액체 크로마토그래피 그라데이션을 사용하여 상이한 지질 종을 분리한다. 세포로부터 추출된 지질에 대한 LC-MS 데이터로부터의 대표적인 토탈 이온 크로마토그램이 생성될 것이다.추출된 지질의 질량 분광 분석을 위해 가열된 전기 분무 이온 소스를 장착한 질량 분광계에 샘플을 적재하고 표에 설명된 대로 분석 매개 변수를 설정합니다. Fourier 변환 분석기를 사용하여 60, 000의 해상도와 150-2000 달톤의 질량 범위 내에서 MS-1 부모 이온을 감지합니다. 그런 다음 테이블에 표시된 설정을 사용하여 MS-2 보조 이온을 감지합니다.광범위한 탠덤 LC-MS 파일에서 다른 지질을 식별하고 정량화하려면 전체 스캔 MS-1 데이터와 데이터 종속 MS-2 데이터를 포함하는 LC-MS 원시 파일을 검색하여 무료, 비esterified 지방산에 대해 검색하고, 심장 지질, 식물성 세필리미드, 피토스피렌고센, 포스파디델콜린, 포스파디에틸라민, 인스파티들글리세롤, 인스파티들리노시톨리톨, 인스파티들세린 및 트리아킬글리세롤 지질 클래스는 100만 개당 100만 개의 분당 과전오차로 나누어 져 있다. 그런 다음 소프트웨어 사용자 매뉴얼에 제공된 지침을 따라 내부 지질 표준 및 지질 종을 특이한 지방산 조성물로 식별합니다. 이 민감한 탠덤 LC-MS 방법은 마이크로리터 당 0.165 피코몰라의 농도에서 지질의 분자 종의 식별 및 정량화를 가능하게 한다.정량화의 이 한계는 농도의 넓은 범위 내의 다른 지질 클래스와 다릅니다. 이 방법은 전기분무분화 질량 분광에 대한 대체 이동상 첨가제를 사용하여 지질에 대한 이온화의 효율을 높이는 데 사용될 수 있다. 이러한 대체 모바일 위상 첨가제는 각각정상 위상 및 역상 LC 컬럼모두에 사용될 수 있습니다.충돌 유도 해리 방법은 질량 분석의 전기 분무 이온화 음성 모드용 암모늄 아세테이트 모바일 상 첨가제와 병용하는 경우, 이러한 조건하에서 MS-1 지질 이온 단편화의 효율을 MS-2 제품으로 증가시킬 수 있게 한다. 대조적으로, 고에너지, 충돌해리 방법은 이러한 조건하에서와 같이 질량 분석의 전기 분무 양성 모드에 대한 암모늄용 암모늄포메이트 모바일 상 첨가제와 함께 사용하는 경우, MS-2 제품으로 의 MS-1 지질 이온 단편화의 효율을 높일 수 있게 한다. 유기 상을 수집하는 동안 위상을 혼합하지 마십시오.질소 가스의 흐름 하에서 튜브를 닫습니다. 삽입 내의 거품을 제거하고 컬럼을 올바른 방향으로 연결합니다. 어떤 피크의 ID가 LC-MS에 의해 결정될 수 없는 경우에, MS-NMR는 그 분자의 구조물을 추론하기 위하여 이용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

연구

생화학

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

의 대사 산물 분석을위한 탠덤 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 기반 접근<em&gt; 포도상 구균</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

세포 외 기질의 Glycoproteomics : 질량 분석을 사용하여 본래 글리코 펩타이드 분석을위한 방법

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

이노시톨 인산염 또는 인산성교단백질의 동정은 서부 블롯 또는 질량분광법에 결합된 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

역상 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 의한 무세포 단백질 합성 대사의 절대 정량화

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

밀 곡물의 비표적 액체 크로마토그래피 질량 분광계 기반 대사체학 분석

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...