Name: quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry
Uploaded: 2020-03-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

Vi er takknemlige til nåværende og tidligere medlemmer av Titorenko-laboratoriet for diskusjoner. Vi anerkjenner Senter for biologiske anvendelser av massespektrometri og Senter for strukturell og funksjonell genomikk (begge ved Concordia University) for fremragende tjenester. Denne studien ble støttet av tilskudd fra Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) i Canada (RGPIN 2014-04482) og Concordia University Chair Fund (CC0113). K.M. ble støttet av Concordia University Merit Award.

1. Tilberedning av sterile medier for å putere gjær
<ol><li>Forbered 90 ml av et komplett YP-medium som inneholder 1 % (w/v) gjærekstrakt og 2 % (w/v) bactopeptone.</li>
	<li>Forbered 90 ml syntetisk minimalt YNB-medium som inneholder 0,67 % gjærgjærnitrogenbase uten aminosyrer, 20 mg/L-histidin, 30 mg/L-le-leviin, 30 mg/L-lysin og 20 mg/L uracil. </li>
	<li>Del 90 ml av hele YP-mediet likt i to 250 ml Erlenmeyer-flasker (dvs. 45 ml hver).</li>
	<li>Del 90 ml av det syntetiske minimale ...

<ol>
	<li>Bou Khalil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+era:+accomplishments+and+challenges.">Lipidomics era: accomplishments and challenges.</a> Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).</li><li>Shevchenko, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+coming+to+grips+with+lipid+diversity.">Lipidomics: coming to grips with lipid diversity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).</li><li>Br&#252;gger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+analysis+of+the+lipid+composition+of+cells+and+subcellular+organelles+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).</li><li>Zechner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAT+SIGNALS+-+lipases+and+lipolysis+in+lipid+metabolism+and+signaling.">FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling.</a> Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).</li><li>Eisenberg, T., B&#252;ttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+and+cell+death+in+yeast.">Lipids and cell death in yeast.</a> FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).</li><li>Richard, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+liponecrosis,+a+distinct+mode+of+programmed+cell+death.">Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death.</a> Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).</li><li>Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+the+discovery+of+anti-tumor+pharmaceuticals:+searching+for+activators+of+liponecrosis.">A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis.</a> Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).</li><li>M&#229;rtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+lipids+on+mitochondrial+functions.">Effects of lipids on mitochondrial functions.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).</li><li>Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-bilayer+phospholipids+in+mitochondrial+structure+and+function.">The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function.</a> FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).</li><li>Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+membrane+turnover+by+phosphatidic+acid:+cellular+functions+and+disease+implications.">Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).</li><li>Goldberg, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+of+lipid+droplets+in+regulating+longevity.">A novel function of lipid droplets in regulating longevity.</a> Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).</li><li>Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obese+and+anorexic+yeasts:+experimental+models+to+understand+the+metabolic+syndrome+and+lipotoxicity.">Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).</li><li>Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+metabolism+and+cellular+aging.">Peroxisome metabolism and cellular aging.</a> Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).</li><li>Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+regulation+of+glycerolipids+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).</li><li>Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+peroxisomes:+key+players+in+cellular+lipid+homeostasis+or+a+matter+of+fat--store+'em+up+or+burn+'em+down.">Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down.</a> Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).</li><li>Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+topology+and+regulation+of+cardiolipin+biosynthesis+and+remodeling+in+yeast.">The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).</li><li>Dimmer, K. S., Rapaport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+contact+sites+as+platforms+for+phospholipid+exchange.">Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).</li><li>Csord&#225;s, G., Weaver, D., Hajn&#243;czky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contactology:+structure+and+signaling+functions.">Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions.</a> Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).</li><li>Mitrofanova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+and+transport+define+longevity+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).</li><li>Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+contact+zones+as+sites+for+lipid+transfer.">Organelle contact zones as sites for lipid transfer.</a> Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).</li><li>Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).</li><li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast:+an+experimental+organism+for+21st+Century+biology.">Yeast: an experimental organism for 21st Century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li><li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+for+budding+geneticists:+a+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system.">Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li><li>Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+surrogate+and+chemical+genetics+in+model+organisms+can+suggest+therapies+for+human+genetic+diseases.">How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases.</a> Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).</li><li>Zimmermann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+tool+to+identify+anti-aging+compounds.">Yeast as a tool to identify anti-aging compounds.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).</li><li>Ejsing, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+yeast+lipidome+by+quantitative+shotgun+mass+spectrometry.">Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).</li><li>Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+lipid+analysis+and+quantification+by+mass+spectrometry.">Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry.</a> Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).</li><li>Guan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+membrane+lipidomics+during+Drosophila+development.">Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development.</a> Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).</li><li>Klose, C., Tarasov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+yeast+lipids+by+shotgun+lipidomics.">Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).</li><li>Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+advances+in+shotgun+lipidomics+for+biology+and+medicine.">Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine.</a> Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).</li><li>Sud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMSD:+LIPID+MAPS+structure+database.">LMSD: LIPID MAPS structure database.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).</li><li>Pauling, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposal+for+a+common+nomenclature+for+fragment+ions+in+mass+spectra+of+lipids.">Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids.</a> PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).</li></ol>

Følgende forholdsregler er viktige for vellykket gjennomføring av protokollen som er beskrevet her:
1. Kloroform og metanol er giftige. De trekker effektivt ut ulike stoffer fra overflater, inkludert laboratorieplasttøy og huden din. Håndter derfor disse organiske løsemidlene med forsiktighet ved å unngå bruk av plast i trinn som involverer kontakt med kloroform og/eller metanol, ved hjelp av borosilikatglasspipetter for disse trinnene, og sner disse pipetter med kloroform og metanol f?...

En mengde bevis indikerer at lipider, en av de store klassene av biomolekyler, spiller viktige roller i mange viktige prosesser i en eukaryotisk celle. Disse prosessene inkluderer montering av lipidbilag som utgjør plasmamembranen og membranene rundt cellulære organeller, transport av små molekyler på tvers av cellemembraner, respons på endringer i det ekstracellulære miljøet og intracellulær signaltransduksjon, generering og lagring av energi, import og eksport av proteiner begrenset til forskjellige organeller, vesikulær smugling av proteiner i endomembransystemet og proteinsekresjon, og flere moduser regulert celledød1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Den spirende gjær S. cerevisiae, en encellulær eukalær organisme, har blitt brukt til å avdekke noen av mekanismene som ligger til grunn for de essensielle rollene til lipider i disse vitale cellulære prosessene4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae er en verdifull modell organisme for å avdekke disse mekanismene fordi det er mottagelig for omfattende biokjemiske, genetiske, celle biologiske, kjemiskbiologiske, system biologiske og mikrofluidiske disseksjonsanalyser21,22,23,24,25. Videre fremgang i å forstå mekanismer der lipidmetabolisme og intracellulær transport bidrar til disse vitale cellulære prosessene krever sensitiv massespektrometriteknologi er for kvantitativ karakterisering av cellulær lipidom, forståelse av lipidommolekylær kompleksitet og integrering av kvantitative lipidomikk i en tverrfaglig plattform av systembiologi1,2,3,26, 27,28,29,30.
Nåværende metoder for massespektrometriassistertkvantitative lipidomics av gjærceller og celler av andre eukaryyotiske organismer er ikke tilstrekkelig allsidige, robuste eller følsomme. Videre er disse brukte metodene i dag ikke i stand til å skille ulike isobariske eller isomeric lipid arter fra hverandre. Her beskriver vi en allsidig, robust og sensitiv metode som tillater bruk av flytende kromatografi kombinert med tandemmassespektrometri (LC-MS/MS) for kvantitativ analyse av store cellulære lipider av S. cerevisiae.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>05-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>60180A-SV9-1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A9554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 series LC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1312A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent1100 Wellplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1367A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A470-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiolipin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>750332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centra CL2 clinical centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramide</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C297-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSH C18 VanGuard</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006944</td>
			<td>Pre-column system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free fatty acid (19:0)</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (acid-washed, 425-600 &#956;M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Search software (V4.1)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V4.1</td>
			<td>LC-MS/MS analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylglycerol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylserine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse-phase column CSH C18</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingosine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Orbitrap Velos MS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ETD-10600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricylglycerol</td>
			<td>Larodan, Malmo</td>
			<td>TAG Mixed FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0919-15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strain BY4742</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>YSC1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

Lipider er strukturelt varierte amhiptaiske molekyler som er uoppløselige i vann. Lipider er viktige bidragsytere til organiseringen og funksjonen til biologiske membraner, energilagring og produksjon, cellulær signalering, vesikulær transport av proteiner, organelle biogenese og regulert celledød. Fordi den spirende gjærSaccharomyces cerevisiae er en encellulær eukaryote mottagelig for grundige molekylære analyser, hjalp bruken som modellorganisme avdekke mekanismer som knytter lipidmetabolisme og intracellulær transport til komplekse biologiske prosesser innen eukaryyotiske celler. Tilgjengeligheten av en allsidig analytisk metode for robust, sensitiv og nøyaktig kvantitativ vurdering av store klasser av lipider i en gjærcelle er avgjørende for å få dyp innsikt i disse mekanismene. Her presenterer vi en protokoll for å bruke flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri (LC-MS/MS) for kvantitativ analyse av store cellulære lipider av S. cerevisiae. LC-MS/MS-metoden som er beskrevet er allsidig og robust. Det muliggjør identifisering og kvantifisering av mange arter (inkludert forskjellige isobariske eller isomeriske former) i hver av de 10 lipidklassene. Denne metoden er følsom og tillater identifisering og kvantitet av noen lipidarter ved konsentrasjoner så lavt som 0,2 pmol/μL. Metoden har blitt brukt til å vurdere lipidomer av hele gjærceller og deres rensede organeller. Bruken av alternative mobile fase tilsetningsstoffer for elektrospray ionisering massespektrometri i denne metoden kan øke effektiviteten av ionisering for noen lipid arter og kan derfor brukes til å forbedre deres identifikasjon og kvantitet.

Vår metode for en kvantitativ vurdering av store cellulære lipider i en gjærcelle ved hjelp av LC-MS/MS var allsidig og robust. Det tillot oss å identifisere og kvantifisere 10 forskjellige lipidklasser i S. cerevisiae celler dyrket i syntetisk minimal YNB medium som opprinnelig inneholder 2% glukose. Disse lipidklassene inkluderer gratis (unesterified) fettsyrer (FFA), CL, phytoceramide (PHC), phytosphingosine (PHS), PC, PE, PG, PI, PS og TAG (Tilleggstabell 1</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Vi presenterer en protokoll ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri for å identifisere og kvantifisere store cellulære lipider i Sakkarincerevisiae. Den beskrevne metoden for en kvantitativ vurdering av store lipidklasser i en gjærcelle er allsidig, robust og følsom.

Kvantitativ analyse av cellulær lipidom eav saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Denne protokollen gir en nøyaktig og reproduserbar metode for å kvantifisere ti forskjellige lipidklasser av Saccharomyces cerevisiae ved hjelp av en enkelt ekstraksjonsmetode og en enkelt LC-MS-metode. Denne metoden gjør det mulig å oppdage og kvantifisere isobariske og inoiske lipidiske arter som har forskjellige kjemiske og fysiske egenskaper. For Saccharomyces cerevisiae kultur, først legge til 5 ml steril 20% glukose lager løsning til hver av to Erlenmeyer flasker som inneholder sterile YNB medium til en endelig konsentrasjon av 2% glukose.Deretter bruker du en steril pipette til å overføre et volum av en gjærkultur over natten som inneholder fem ganger ti til de syvende gjærcellene i hver kolbe og kultur kolben i minst 24 timer ved 30 grader Celsius med rotasjonsristing ved 200 omdreininger per minutt. For lipidekstraksjon, bestem det totale antallet gjærceller per milliliter kultur og overfør fem ganger ti til de syvende cellene til et 15 ml sentrifugerør. Tilsett iskaldt nano rent vann for å bringe det totale volumet opp til 15 ml og samle cellene ved sentrifugering.Re-suspendere gjær pellet i 15 ml iskald iso-tonic ammonium bikarbonat buffer for en andre sentrifugering og re-suspendere pellet i 1,5 ml frisk iskald ammonium bikarbonat løsning. Ved slutten av sentrifugeringen, lagre pellet på 80 grader celsius til utvinningen. For å begynne lipidekstraksjonen, tin cellepelleten på is før de suspenderer cellene i 200 mikroliter iskaldt nano rent vann.I en røykhette overfører du cellefjæringen til et 15 ml glass med høy styrke, skruetopp sentrifugerør med en polytetrafluoretylenfôret hette og tilsett 25 mikroliter av en intern lipider standardblanding, tilberedt i 2:1 kloroformmetanol. 100 mikroliter på 425 til 600 mikromossyrevasket glassperler og 600 mikroliter av en 17:1 kloroformmetanol til røret. Vortex røret i høy hastighet i fem minutter ved romtemperatur for å forstyrre cellene.Etterfulgt av vortexing i en time ved lav hastighet ved romtemperatur for å lette lipid ekstraksjon. På slutten av utvinningen, inkuber prøven i 15 minutter på is, for å fremme proteinnedbør og separasjon av vandige og organiske faser. På slutten av inkubasjonen, sentrifuge prøven for å ytterligere skille den øvre vandige fasen fra den nedre organiske fasen, og i røykhetten, bruk en borosilikatglasspipette for å overføre den nedre organiske fasen til en ny 15 ml høyfast glassskruetopp sentrifugerør med en polytetrafluoreetylforet hette.Plasser den nedre organiske fasen under strømmen av nitrogengass, og legg i røykhetten til 300 mikroliter av en 2:1 kloroformmetanolblanding til den gjenværende øvre vandige fasen. For å lette fosfacid, fosfatidylserin, fosfatidylinositol og kardio-lipid ekstraksjon vortex røret kraftig i fem minutter ved romtemperatur før sentrifuging prøven. Bruk en borosilikatglasspipette til å overføre den nedre organiske fasen til den nedre organiske fasen under nitrogen og fordampe oppløsningsvæsken i de kombinerte organiske fasene i røykhetten.Deretter lukker du rørene av lipidfilm under strømmen av nitrogengass og lagre prøvene ved 80 grader celsius. For flytende kromatografi, separasjon av ekstraherte lipider på 500 mikroliter av en 63:35:5 aceto-nitril-2-propanol nano-ren vann blanding til røret av lipid film og virvel tre ganger i ti sekunder per virvel ved romtemperatur. Utvis rørinnholdet for ultralyd sonikering i 15 minutter før det virvler røret tre ganger i ti sekunder per virvel som nettopp demonstrert.Overfør 100 mikroliter av prøven til et hetteglass med en innsats som brukes til en 24-brønnplate og eliminere eventuelle bobler i innsatsen. Plasser innsatsen i en brønn av en 24 brønnplate og legg en omvendt fase C18-kolonne CSH skrevet til en forkolonne i det flytende kromatografisystemet. Sett kolonnetemperaturen til 55 grader celsius og strømmen til 300 mikroliter per minutt.Når alle parametrene er angitt, laster du inn ti mikroliter av et ekstraksjonsromt før du laster den første prøven. Deretter skiller du de forskjellige lipidartene ved hjelp av flytende kromatografigradient, som angitt. Et representativt totalionkromatrammet fra LC-MS-dataene for lipidene som er hentet fra cellene, genereres.For massespektrometrisk analyse av de ekstraherte lipidene, last prøvene på et massespektrometer utstyrt med en oppvarmet elektro-sprayioniseringsioniseringskilde og sett analyseparametrene som beskrevet i tabellen. Bruk Fourier Transform Analyzer til å oppdage MS-1 overordnede ioner med en oppløsning på 60 000 og innenfor masseområdet 150-2000 daltons. Deretter oppdager du sekundære MS-2-ioner ved hjelp av innstillingene som angitt i tabellen.Hvis du vil identifisere og kvantifisere forskjellige lipider fra brede tandem LC-MS-filer, kan du søke i LC-MS raw-filer som inneholder fullstendige MS-1-data og dataavhengige MS-2-data gratis, uesterifiserte fettsyrer, cardio-lipid, fytocerimid, fytosphyngocene, fosfatatidylkolin, fosfatidyletanolamin, fosfatydlglycerol, fosfatydlinositol, fosfatydlserin og triacylglycerol lipidklasser ved hjelp av en masse delt på ladetoleranse på fem deler per million for forløperioner og ti deler per million for produktioner. Følg deretter instruksjonene i programvarebrukerhåndboken for å identifisere interne lipidstandarder og lipidarter med uvanlige fettsyresammensetninger. Denne følsomme tandem LC-MS-metoden muliggjør identifisering og kvantifisering av molekylære arter av lipider ved konsentrasjoner så lave som 0,165 picomolar per mikroliter.Denne kvantifiseringsgrensen er forskjellig fra forskjellige lipidklasser innenfor et bredt spekter av konsentrasjoner. Denne metoden kan brukes til å øke effektiviteten av ionisering for lipider ved hjelp av alternative mobile fase tilsetningsstoffer for elektrosprayionisering massespektrometri. Hver av disse alternative mobile fase tilsetningsstoffer kan brukes for både normal fase og omvendt fase LC kolonner.Kollisjonsindusert dissosiasjonsmetode er gunstig hvis den brukes i kombinasjon med ammoniumacetat mobil fase additiv for elektro-spray ionisering negativ modus av massespektrometri, som, under disse forholdene, det tillater økningen i effektiviteten av MS-1 lipid ion fragmentering i MS-2 produkter. I motsetning er den høye energien, kollisjonsdesosiasjonsmetoden gunstig hvis den brukes i kombinasjon med ammoniumformat mobilfasetilsetning for elektro-sprayionisering positiv modus for massespektrometri som under disse forholdene, det muliggjør en økning i effektiviteten av MS-1 lipidion fragmentering i MS-2-produkter. Ikke bland fasene mens du samler den organiske fasen.Lukk rørene under strømmen av nitrogengass. Eliminer eventuelle bobler i innsatsen og koble kolonnen i riktig retning. Hvis identiteten til en topp ikke kan bestemmes av LC-MS, kan MS-NMR brukes til å utlede strukturen til dette molekylet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Et tandem-væskekromatografi-massespektrometri basert tilnærming for Metabolitt Analyse av<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolasjon for Quantitative massespektrometri analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Glycoproteomics av ​​den ekstracellulære matrise: En metode for Intakt glykopeptidreagens analyse ved hjelp av massespektrometri

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Dyp proteom profilering av isobar merking, omfattende flytende Ture, massespektrometri og Software-baserte kvantifisering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identifisering av Inositol fosfat eller Fosfoinositid samspill proteiner av affinitet kromatografi koplet til Western Blot eller Mass massespektrometri

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolutt kvantifisering av Cell-fri protein syntese metabolisme av reversert-fase flytende kromatografi-Mass massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flytende kromatografi-massespektrometribasert metabolomikkanalyse av hvetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...