Name: quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry
Uploaded: 2020-03-08T15:00:00
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Somos gratos aos atuais e antigos membros do laboratório Titorenko pelas discussões. Reconhecemos o Centro de Aplicações Biológicas da Espectrometria de Massa e o Centro de Genômica Estrutural e Funcional (ambos na Universidade de Concórdia) por serviços de destaque. Este estudo foi apoiado por bolsas do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia (NSERC) do Canadá (RGPIN 2014-04482) e do Concordia University Chair Fund (CC0113). K.M. foi apoiado pelo Prêmio de Mérito da Universidade de Concórdia.

1. Preparação de mídia estéril para cultivar levedura
<ol><li>Prepare 90 mL de um meio YP completo que contenha 1% (c/v) de extrato de levedura e 2% (c/v) bactopepnona.</li>
	<li>Preparar 90 mL de um meio ynb mínimo sintético contendo 0,67% (c/v) base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 20 mg/L -histidina, 30 mg/L -leucina, 30 mg/L -lysina e 20 mg/L uracil.</li>
	<li>Divida 90 mL do meio YP completo igualmente em dois frascos erlenmeyer de 250 mL (ou seja, 45 mL cada).</li>
	<l...

<ol>
	<li>Bou Khalil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+era:+accomplishments+and+challenges.">Lipidomics era: accomplishments and challenges.</a> Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).</li><li>Shevchenko, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+coming+to+grips+with+lipid+diversity.">Lipidomics: coming to grips with lipid diversity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).</li><li>Br&#252;gger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+analysis+of+the+lipid+composition+of+cells+and+subcellular+organelles+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).</li><li>Zechner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAT+SIGNALS+-+lipases+and+lipolysis+in+lipid+metabolism+and+signaling.">FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling.</a> Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).</li><li>Eisenberg, T., B&#252;ttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+and+cell+death+in+yeast.">Lipids and cell death in yeast.</a> FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).</li><li>Richard, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+liponecrosis,+a+distinct+mode+of+programmed+cell+death.">Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death.</a> Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).</li><li>Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+the+discovery+of+anti-tumor+pharmaceuticals:+searching+for+activators+of+liponecrosis.">A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis.</a> Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).</li><li>M&#229;rtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+lipids+on+mitochondrial+functions.">Effects of lipids on mitochondrial functions.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).</li><li>Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-bilayer+phospholipids+in+mitochondrial+structure+and+function.">The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function.</a> FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).</li><li>Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+membrane+turnover+by+phosphatidic+acid:+cellular+functions+and+disease+implications.">Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).</li><li>Goldberg, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+of+lipid+droplets+in+regulating+longevity.">A novel function of lipid droplets in regulating longevity.</a> Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).</li><li>Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obese+and+anorexic+yeasts:+experimental+models+to+understand+the+metabolic+syndrome+and+lipotoxicity.">Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).</li><li>Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+metabolism+and+cellular+aging.">Peroxisome metabolism and cellular aging.</a> Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).</li><li>Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+regulation+of+glycerolipids+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).</li><li>Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+peroxisomes:+key+players+in+cellular+lipid+homeostasis+or+a+matter+of+fat--store+'em+up+or+burn+'em+down.">Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down.</a> Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).</li><li>Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+topology+and+regulation+of+cardiolipin+biosynthesis+and+remodeling+in+yeast.">The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).</li><li>Dimmer, K. S., Rapaport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+contact+sites+as+platforms+for+phospholipid+exchange.">Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).</li><li>Csord&#225;s, G., Weaver, D., Hajn&#243;czky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contactology:+structure+and+signaling+functions.">Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions.</a> Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).</li><li>Mitrofanova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+and+transport+define+longevity+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).</li><li>Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+contact+zones+as+sites+for+lipid+transfer.">Organelle contact zones as sites for lipid transfer.</a> Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).</li><li>Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).</li><li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast:+an+experimental+organism+for+21st+Century+biology.">Yeast: an experimental organism for 21st Century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li><li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+for+budding+geneticists:+a+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system.">Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li><li>Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+surrogate+and+chemical+genetics+in+model+organisms+can+suggest+therapies+for+human+genetic+diseases.">How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases.</a> Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).</li><li>Zimmermann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+tool+to+identify+anti-aging+compounds.">Yeast as a tool to identify anti-aging compounds.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).</li><li>Ejsing, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+yeast+lipidome+by+quantitative+shotgun+mass+spectrometry.">Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).</li><li>Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+lipid+analysis+and+quantification+by+mass+spectrometry.">Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry.</a> Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).</li><li>Guan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+membrane+lipidomics+during+Drosophila+development.">Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development.</a> Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).</li><li>Klose, C., Tarasov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+yeast+lipids+by+shotgun+lipidomics.">Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).</li><li>Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+advances+in+shotgun+lipidomics+for+biology+and+medicine.">Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine.</a> Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).</li><li>Sud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMSD:+LIPID+MAPS+structure+database.">LMSD: LIPID MAPS structure database.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).</li><li>Pauling, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposal+for+a+common+nomenclature+for+fragment+ions+in+mass+spectra+of+lipids.">Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids.</a> PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).</li></ol>

As seguintes precauções são importantes para a implementação bem sucedida do protocolo descrito aqui:
1. Clorofórmio e metanol são tóxicos. Eles extraem eficientemente várias substâncias de superfícies, incluindo plástico de laboratório e sua pele. Portanto, manuseie esses solventes orgânicos com cautela, evitando o uso de plásticos em etapas que envolvam contato com clorofórmio e/ou metanol, utilizando pipetas de vidro borossilicato para estas etapas, e enxaguando essas pipeta...

Um conjunto de evidências indica que os lipídios, uma das principais classes de biomoléculas, desempenham papéis essenciais em muitos processos vitais dentro de uma célula eucariótica. Esses processos incluem a montagem de bicamadas lipídicas que constituem a membrana plasmática e as membranas ao redor de organelas celulares, o transporte de pequenas moléculas através das membranas celulares, a resposta a alterações no ambiente extracelular e transdução de sinal intracelular, geração e armazenamento de energia, importação e exportação de proteínas confinadas a diferentes organelas, tráfico vesicular de proteínas dentro do sistema de endomembrana e secreção de proteínas, e vários modos de regulação da célula ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
A levedura brotante S. cerevisiae, um organismo eucaótico unicelular, tem sido usada com sucesso para descobrir alguns dos mecanismos subjacentes aos papéis essenciais dos lipídios nestes processos celulares vitais4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae é um organismo modelo valioso para a descoberta desses mecanismos, pois é passível de análises abrangentes bioquímicas, genéticas, biológicas, biológicas químicas, biológicas do sistema e microfluidas21,22,23,24,25. Avanços adicionais na compreensão de mecanismos através dos quais o metabolismo lipídico e o transporte intracelular contribuem para esses processos celulares vitais requer tecnologias sensíveis de espectrometria de massa para a caracterização quantitativa do lipidome celular, compreensão da complexidade molecular lipidome e integração de lipidomia quantitativa em uma plataforma multidisciplinar de biologia de sistemas1,2,3,26, 27,28,29,30.
Os métodos atuais para a lipdomia quantitativa assistida por espectrometria de massa de células de levedura e células de outros organismos eucaóticos não são suficientemente versáteis, robustos ou sensíveis. Além disso, esses métodos atualmente utilizados são incapazes de diferenciar várias espécies lipídicas isobarricas ou isóricas umas das outras. Aqui descrevemos um método versátil, robusto e sensível que permite o uso de cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS) para análise quantitativa dos principais lipídios celulares de S. cerevisiae.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>05-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>60180A-SV9-1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A9554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 series LC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1312A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent1100 Wellplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1367A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A470-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiolipin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>750332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centra CL2 clinical centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramide</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C297-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSH C18 VanGuard</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006944</td>
			<td>Pre-column system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free fatty acid (19:0)</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (acid-washed, 425-600 &#956;M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Search software (V4.1)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V4.1</td>
			<td>LC-MS/MS analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylglycerol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylserine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse-phase column CSH C18</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingosine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Orbitrap Velos MS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ETD-10600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricylglycerol</td>
			<td>Larodan, Malmo</td>
			<td>TAG Mixed FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0919-15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strain BY4742</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>YSC1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

Lipídios são moléculas anfípticas estruturalmente diversas que são insolúveis em água. Os lipídios são contribuintes essenciais para a organização e função das membranas biológicas, armazenamento e produção de energia, sinalização celular, transporte vesicular de proteínas, biogênese organela e morte celular regulada. Como a levedura brotante Saccharomyces cerevisiae é um eucariote unicelular passível de análises moleculares completas, seu uso como organismo modelo ajudou a descobrir mecanismos que ligam o metabolismo lipídico e o transporte intracelular a processos biológicos complexos dentro de células eucarióticas. A disponibilidade de um método analítico versátil para a avaliação quantitativa robusta, sensível e precisa das principais classes de lipídios dentro de uma célula de levedura é crucial para obter insights profundos sobre esses mecanismos. Aqui apresentamos um protocolo de utilização de cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS) para a análise quantitativa dos principais lipídios celulares de S. cerevisiae. O método LC-MS/MS descrito é versátil e robusto. Permite a identificação e quantificação de inúmeras espécies (incluindo diferentes formas isóbaras ou isóricas) dentro de cada uma das 10 classes lipídicas. Este método é sensível e permite a identificação e quantitação de algumas espécies lipídicas em concentrações tão baixas quanto 0,2 pmol/μL. O método tem sido aplicado com sucesso na avaliação de lipidomas de células inteiras de levedura e suas organelas purificadas. O uso de aditivos de fase móvel alternativos para espectrometria de massa de ionização eletrospray neste método pode aumentar a eficiência da ionização para algumas espécies lipídicas e, portanto, pode ser usado para melhorar sua identificação e quantitação.

Nosso método para uma avaliação quantitativa dos principais lipídios celulares dentro de uma célula de levedura com a ajuda de LC-MS/MS foi versátil e robusto. Permitiu identificar e quantificar 10 classes lipídicas diferentes em células s. cerevisiae cultivadas no meio nINS mínimo sintético contendo inicialmente 2% de glicose. Estas classes lipídicas incluem ácidos graxos gratuitos (não esestrdiados) (AFa), CL, fitoceramide (APS), fitosofingosina (PHS), PC, PE, PG, ...

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Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Apresentamos um protocolo utilizando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem para identificar e quantificar os principais lipídios celulares em Saccharomyces cerevisiae. O método descrito para uma avaliação quantitativa das principais classes lipídicas dentro de uma célula de levedura é versátil, robusto e sensível.

Análise Quantitativa do Lipidome Celular de Saccharomyces Cerevisiae Usando Cromatografia Líquida Juntamente com Espectrometria de Massa de Tandem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Este protocolo fornece um método preciso e reprodutível para quantificar dez classes lipídicas diferentes de Saccharomyces cerevisiae usando um único método de extração e um único método LC-MS. Este método permite a detecção e quantificação de espécies lipídicas isobáricas e isomericas com diferentes propriedades químicas e físicas. Para a cultura saccharomyces cerevisiae, adicione primeiro 5 ml de solução de estoque de glicose estéril de 20% para cada um dos dois frascos erlenmeyer contendo meio YNB estéril a uma concentração final de 2%de glicose.Em seguida, use uma pipeta estéril para transferir um volume de uma cultura de levedura durante a noite contendo cinco vezes dez para as sétimas células de levedura em cada frasco e cultura os frascos por pelo menos 24 horas a 30 graus Celsius com agitação rotacional a 200 revoluções por minuto. Para extração lipídica, determine o número total de células de levedura por mililitro de cultura e transfira cinco vezes dez para a sétima célula em um tubo de centrífuga de 15 ml. Adicione água nano-pura gelada para aumentar o volume total até 15 ml e coletar as células por centrifugação.Suspenda a pelota de levedura em 15 ml de tampão de bicarbonato de amônio iso-tônico gelado para uma segunda centrifugação e suspenda a pelota em 1,5 ml de solução de bicarbonato de amônio frio fresco. No final da centrifugação, armazene a pelota a 80 graus celsius até a extração. Para começar a extração lipídica, descongele a pelota celular no gelo antes de suspender as células em 200 microliters de água nano-pura gelada.Em um capô de fumaça, transfira a suspensão celular para uma mistura de 15 ml, vidro de alta resistência, tubo de centrífuga de rosca superior com uma tampa forrada de politetrafluoroetileno e adicione 25 microlitros de uma mistura interna de padrões lipídicos, preparado em metanol clorofórmio 2:1. 100 microliters de 425 a 600 contas de vidro lavadas com ácido micromolar e 600 microliters de um metanol clorofórmio 17:1 para o tubo. Vórtice o tubo em alta velocidade por cinco minutos à temperatura ambiente para interromper as células.Seguido por vórtice por uma hora a baixa velocidade à temperatura ambiente para facilitar a extração lipídica. Ao final da extração, incubar a amostra por 15 minutos no gelo, para promover a precipitação proteica e a separação das fases aquosas e orgânicas. Ao final da incubação, centrifugar a amostra para separar ainda mais a fase aquosa superior da fase orgânica inferior e, na capa de fumaça, use uma pipeta de vidro borossilicato para transferir a fase orgânica inferior para um novo tubo de centrífugo de vidro de alta resistência de 15 ml com uma tampa forrada politefluoroetileno.Coloque a fase orgânica inferior sob o fluxo de gás nitrogênio e, na capa de fumaça, adicione 300 microliters de uma mistura de metanol clorofórmio 2:1 à fase aquosa superior restante. Para facilitar o vórtice de fosfattidicad, fosfatidylserine, fosphatidylinositol e extração cardio-lipídica o tubo vigorosamente por cinco minutos à temperatura ambiente antes de centrifugar a amostra. Use uma pipeta de vidro borossilicato para transferir a fase orgânica inferior para a fase orgânica inferior sob nitrogênio e evaporar o solvente nas fases orgânicas combinadas na capa de fumaça.Em seguida, feche os tubos de filme lipídico sob o fluxo de gás nitrogênio e armazene as amostras a 80 graus celsius. Para cromatografia líquida, separação dos lipídios extraídos a 500 microliters de uma mistura de água nano-pura de aceto-nitrílico-2-propanol ao tubo de filme lipídado e vórtice três vezes por dez segundos por vórtice à temperatura ambiente. Sujeito o conteúdo do tubo à sônica ultrassônica por 15 minutos antes de vórtice do tubo três vezes por dez segundos por vórtice como apenas demonstrado.Transfira 100 microliters da amostra em um frasco de vidro com uma inserção usada para uma placa de 24 poços e elimine quaisquer bolhas dentro da pastilha. Coloque a inserção em um poço de uma placa de 24 poços e carregue uma fase inversa C18 coluna CSH acoplado a uma pré-coluna no sistema de cromatografia líquida. Coloque a temperatura da coluna em 55 graus celsius e o fluxo para 300 microliters por minuto.Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, carregue dez microlitadores de uma extração em branco antes de carregar a primeira amostra. Em seguida, separe as diferentes espécies lipídicas usando o gradiente de cromatografia líquida, conforme indicado. Um cromatograma de íon total representativo dos dados de LC-MS para os lipídios extraídos das células será gerado.Para análise espectrométrica de massa dos lipídios extraídos, carregue as amostras em um espectrômetro de massa equipado com uma fonte de íons de íons de íons eletro-spray aquecido e defina os parâmetros de análise conforme descrito na tabela. Use o Fourier Transform Analyzer para detectar íons-mãe MS-1 com uma resolução de 60.000 e dentro da faixa de massa de 150-2000 daltons. Em seguida, detecte os íons secundários MS-2 usando as configurações indicadas na tabela.Para identificar e quantificar diferentes lipídios de arquivos LC-MS amplos, pesquise arquivos brutos LC-MS contendo dados MS-1 e dados MS-2 dependentes de dados para ácidos graxos gratuitos e não esterocidos, cardio-lipídicos, fitocerimídeos, fitosfito, fosfattidylcolina, fosfatidylethanolamina, fosphatydlglycerol, fosphatydlinositol, fosphatydlserine e triacylglycerol lipid classes usando uma massa dividida pela tolerância de carga de cinco partes por milhão para íons precursores e dez partes por milhão para ions de produtos. Em seguida, siga as instruções fornecidas no manual do usuário do software para identificar padrões lipídes internos e espécies lipídicas com composições incomuns de ácidos graxos. Este método sensível tandem LC-MS permite a identificação e quantificação de espécies moleculares de lipídios em concentrações tão baixas quanto 0,165 picomolar por microliter.Este limite de quantificação difere de diferentes classes lipídicas dentro de uma ampla gama de concentrações. Este método pode ser usado para aumentar a eficiência da ionização para lipídios usando aditivos de fase móvel alternativos para a espectrometria de massa de ionização eletrospray. Cada um desses aditivos de fase móvel alternativos pode ser usado tanto para as colunas LC de fase normal quanto para a fase inversa.O método de dissociação induzido por colisão é benéfico se usado em combinação com o aditivo de fase móvel de acetato de amônio para o modo negativo de espectrometria de massa, pois, nessas condições, permite o aumento da eficiência da fragmentação da íon lipídica MS-1 em produtos MS-2. Em contraste, o método de dissociação de alta energia e colisão é favorável se usado em combinação com o aditivo de fase móvel formato de amônio para o modo positivo de espectrometria de massa eletro-spray, pois nessas condições, permite um aumento na eficiência da fragmentação da íon lipídica MS-1 em produtos MS-2. Não misture as fases durante a coleta da fase orgânica.Feche os tubos sob o fluxo de gás nitrogênio. Elimine qualquer bolha dentro da inserção e conecte a coluna na direção correta. Se a identidade de qualquer pico não puder ser determinada por LC-MS, o MS-NMR pode ser usado para deduzir a estrutura dessa molécula.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Bioquímica

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Uma abordagem baseada em Espectrometria Tandem Cromatografia Líquida de Massachusetts para análise de metabolitos de<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Isolamento de gotículas de gordura para análise quantitativa Espectrometria de Massa

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Glicoproteômica da matriz extracelular: um método de análise GLICOPï¿½TIDOS Intact Usando Espectrometria de Massa

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identificação de fosfato de inositol ou proteínas Fosfoinositídeo interagindo por cromatografia de afinidade acoplada a Western blot ou espectrometria de massas

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Quantificação absoluta do metabolismo da síntese de proteínas livres de células por cromatografia líquida de fase reversa-espectrometria

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Análise de metabolômica baseada em espectrometria líquida não direcionada

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...