Name: quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry
Uploaded: 2020-03-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

Мы благодарны нынешним и бывшим сотрудникам лаборатории Титоренко за дискуссии. Мы признательны Центру биологического применения массовой спектрометрии и Центру структурной и функциональной геномики (оба при Университете Конкордии) за выдающиеся услуги. Это исследование было поддержано грантами Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) Канады (RGPIN 2014-04482) и Фонда кафедры Университета Конкордия (CC0113). К.М. была поддержана премией Университета Конкордии за заслуги.

1. Подготовка стерильных носителей для культивирования дрожжей
<ol><li>Приготовьте 90 мл полной среды YP, которая содержит 1% (w/v) экстракт дрожжей и 2% (w/v) бактопептон.</li>
	<li>Приготовьте 90 мл синтетической минимальной среды YNB, содержащей 0,67% (w/v) дрожжевой азотной базы без аминокислот, 20 мг/л L-ги...

<ol>
	<li>Bou Khalil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+era:+accomplishments+and+challenges.">Lipidomics era: accomplishments and challenges.</a> Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).</li><li>Shevchenko, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+coming+to+grips+with+lipid+diversity.">Lipidomics: coming to grips with lipid diversity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).</li><li>Br&#252;gger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+analysis+of+the+lipid+composition+of+cells+and+subcellular+organelles+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).</li><li>Zechner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAT+SIGNALS+-+lipases+and+lipolysis+in+lipid+metabolism+and+signaling.">FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling.</a> Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).</li><li>Eisenberg, T., B&#252;ttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+and+cell+death+in+yeast.">Lipids and cell death in yeast.</a> FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).</li><li>Richard, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+liponecrosis,+a+distinct+mode+of+programmed+cell+death.">Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death.</a> Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).</li><li>Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+the+discovery+of+anti-tumor+pharmaceuticals:+searching+for+activators+of+liponecrosis.">A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis.</a> Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).</li><li>M&#229;rtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+lipids+on+mitochondrial+functions.">Effects of lipids on mitochondrial functions.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).</li><li>Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-bilayer+phospholipids+in+mitochondrial+structure+and+function.">The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function.</a> FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).</li><li>Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+membrane+turnover+by+phosphatidic+acid:+cellular+functions+and+disease+implications.">Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).</li><li>Goldberg, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+of+lipid+droplets+in+regulating+longevity.">A novel function of lipid droplets in regulating longevity.</a> Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).</li><li>Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obese+and+anorexic+yeasts:+experimental+models+to+understand+the+metabolic+syndrome+and+lipotoxicity.">Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).</li><li>Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+metabolism+and+cellular+aging.">Peroxisome metabolism and cellular aging.</a> Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).</li><li>Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+regulation+of+glycerolipids+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).</li><li>Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+peroxisomes:+key+players+in+cellular+lipid+homeostasis+or+a+matter+of+fat--store+'em+up+or+burn+'em+down.">Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down.</a> Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).</li><li>Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+topology+and+regulation+of+cardiolipin+biosynthesis+and+remodeling+in+yeast.">The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).</li><li>Dimmer, K. S., Rapaport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+contact+sites+as+platforms+for+phospholipid+exchange.">Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).</li><li>Csord&#225;s, G., Weaver, D., Hajn&#243;czky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contactology:+structure+and+signaling+functions.">Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions.</a> Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).</li><li>Mitrofanova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+and+transport+define+longevity+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).</li><li>Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+contact+zones+as+sites+for+lipid+transfer.">Organelle contact zones as sites for lipid transfer.</a> Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).</li><li>Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).</li><li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast:+an+experimental+organism+for+21st+Century+biology.">Yeast: an experimental organism for 21st Century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li><li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+for+budding+geneticists:+a+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system.">Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li><li>Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+surrogate+and+chemical+genetics+in+model+organisms+can+suggest+therapies+for+human+genetic+diseases.">How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases.</a> Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).</li><li>Zimmermann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+tool+to+identify+anti-aging+compounds.">Yeast as a tool to identify anti-aging compounds.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).</li><li>Ejsing, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+yeast+lipidome+by+quantitative+shotgun+mass+spectrometry.">Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).</li><li>Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+lipid+analysis+and+quantification+by+mass+spectrometry.">Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry.</a> Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).</li><li>Guan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+membrane+lipidomics+during+Drosophila+development.">Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development.</a> Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).</li><li>Klose, C., Tarasov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+yeast+lipids+by+shotgun+lipidomics.">Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).</li><li>Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+advances+in+shotgun+lipidomics+for+biology+and+medicine.">Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine.</a> Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).</li><li>Sud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMSD:+LIPID+MAPS+structure+database.">LMSD: LIPID MAPS structure database.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).</li><li>Pauling, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposal+for+a+common+nomenclature+for+fragment+ions+in+mass+spectra+of+lipids.">Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids.</a> PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).</li></ol>

Для успешной реализации протокола, описанного здесь, важны следующие меры предосторожности:
1. Хлороформ и метанол токсичны. Они эффективно извлекают различные вещества из поверхностей, в том числе лабораторную пластичную посуду и кожу. Поэтому, обрабатывать эти органич...

Совокупность доказательств указывает на то, что липиды, один из основных классов биомолекул, играют важную роль во многих жизненно важных процессах в эукариотической клетке. Эти процессы включают в себя сборку липидных двухслойных, которые составляют плазменную мембрану и мембраны, окружающие клеточные органеллы, транспортировку небольших молекул через клеточные мембраны, реакцию на изменения в внеклеточной среде и внутриклеточной трансдукции сигналов, генерацию и хранение энергии, импорт и экспорт белков, ограниченных различными органеллами, везикулярный оборот белков в системе эндоммраленции и белковой секреции, а также несколько режимов клеточной секреции, а также несколько способов регулирования клеточной секреции клеток1 ,2,3,4,5,7,8,9,10.
Подающий надежды дрожжи S. cerevisiae, одноклеточный эукариотический организм, был успешно использован, чтобы раскрыть некоторые из механизмов, лежащих в основе основных ролей липидов в этих жизненно важных клеточных процессов4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae является ценным моделью организма для раскрытия этих механизмов, поскольку он поддается всеобъемлющей биохимической, генетической, клеточной биологической, химической биологической, системной биологической и микрофлюидной анализы21,22,23,24,25. Дальнейший прогресс в понимании механизмов, с помощью которых липидный метаболизм и внутриклеточный транспорт способствуют этим жизненно важным клеточным процессам, требует чувствительных технологий масс-спектрометрии для количественной характеристики клеточного липидома, понимания молекулярной сложности липидома и интеграции количественной липидоми в многодисциплинарную платформу систем биологии1,2,3,26, 27,28,29,30.
Современные методы массовой спектрометрии при содействии количественной липидоми дрожжевых клеток и клеток других эукариотических организмов не являются достаточно универсальными, надежными или чувствительными. Кроме того, эти используемые в настоящее время методы не способны дифференцировать различные изобарические или изомерные липидные виды друг от друга. Здесь мы описываем универсальный, надежный и чувствительный метод, который позволяет использовать жидкую хроматографию в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) для количественного анализа основных клеточных липидов S. cerevisiae.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>05-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>60180A-SV9-1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A9554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 series LC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1312A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent1100 Wellplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1367A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A470-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiolipin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>750332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centra CL2 clinical centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramide</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C297-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSH C18 VanGuard</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006944</td>
			<td>Pre-column system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free fatty acid (19:0)</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (acid-washed, 425-600 &#956;M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Search software (V4.1)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V4.1</td>
			<td>LC-MS/MS analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylglycerol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylserine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse-phase column CSH C18</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingosine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Orbitrap Velos MS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ETD-10600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricylglycerol</td>
			<td>Larodan, Malmo</td>
			<td>TAG Mixed FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0919-15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strain BY4742</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>YSC1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

Липиды являются структурно разнообразными молекулами амфипатических, которые нерастворяются в воде. Липиды являются важными факторами, способствующими организации и функционированию биологических мембран, хранению и производству энергии, клеточной сигнализации, везикулярной транспортировке белков, биогенезу органеллы и регулируемой гибели клеток. Поскольку подающий надежды дрожжи Saccharomyces cerevisiae является одноклеточным эукариотом, поддающимся тщательному молекулярным анализам, его использование в качестве модельного организма помогло раскрыть механизмы, связывающие липидный метаболизм и внутриклеточный перенос со сложными биологическими процессами в эукариотических клетках. Наличие универсального аналитического метода для надежной, чувствительной и точной количественной оценки основных классов липидов в дрожжевой клетке имеет решающее значение для получения глубокого понимания этих механизмов. Здесь мы представляем протокол для использования жидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) для количественного анализа основных клеточных липидов S. cerevisiae. Описанный метод LC-MS/MS является универсальным и надежным. Это позволяет идентифицировать и количественно многих видов (в том числе различных изобарических или изомерических форм) в рамках каждого из 10 классов липидов. Этот метод является чувствительным и позволяет идентифицировать и количественно некоторых видов липидов в концентрациях до 0,2 моль/Л. Метод успешно применяется для оценки липидоменов цельных дрожжевых клеток и их очищенных органелл. Использование альтернативных мобильных фазовых добавок для масс-спектрометрии электроспрея в этом методе может повысить эффективность ионизации для некоторых видов липидов и поэтому может быть использовандля для улучшения их идентификации и количественной оценки.

Наш метод количественной оценки основных клеточных липидов в дрожжевой клетке с помощью LC-MS/MS был универсальным и надежным. Это позволило нам определить и количественно 10 различных классов липидов в S. cerevisiae клеток культивируется в синтетической минимальной сред...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Мы представляем протокол с использованием жидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией для выявления и количественной оценки основных клеточных липидов в Saccharomyces cerevisiae. Описанный метод количественной оценки основных классов липидов в дрожжевой клетке является универсальным, надежным и чувствительным.

Количественный анализ клеточного липидома Сахаромиса Церевизии с использованием жидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Этот протокол обеспечивает точный и воспроизводимый метод количественной оценки десяти различных липидных классов Saccharomyces cerevisiae с использованием одного метода извлечения и единого метода LC-MS. Этот метод позволяет обнаруживать и количественно выявлять изобарические и изомериковые липидные виды, имеющие различные химические и физические свойства. Для saccharomyces cerevisiae культуры, сначала добавить 5 мл стерильных 20% раствора запасов глюкозы в каждой из двух колб Erlenmeyer, содержащих стерильные YNB среды до конечной концентрации 2%глюкозы.Затем используйте стерильную пипетку для передачи объема ночной дрожжевой культуры, содержащей пять раз десять- до седьмых дрожжевых клеток в каждую колбу и культуры колбы, по крайней мере 24 часов при 30 градусах по Цельсию с вращательной тряски на 200 оборотов в минуту. Для извлечения липидов, определить общее количество дрожжевых клеток на миллилитр культуры и передать пять раз десять седьмой клетки в 15 мл центрифуги трубки. Добавьте ледяную нано-чистую воду, чтобы довести общий объем до 15 мл и собрать клетки путем центрифугации.Повторно приостановить дрожжевой гранулы в 15 мл ледяного изо-тонизирующего аммония бикарбонат буфер для второй центрифугации и повторно приостановить гранулы в 1,5 мл свежего ледяного аммония бикарбонатного раствора. В конце центрифугации храните гранулы при 80 градусах цельсия до извлечения. Чтобы начать экстракции липидов, оттаивать гранулы клетки на льду, прежде чем повторно приостановить клетки в 200 микролитров ледяной нано-чистой воды.В паровой капот, передача подвески клетки на 15 мл, высокопрочное стекло, винт верхней центрифуги трубки с политетрафторэтилен выстроились крышка и добавить 25 микролитров внутренней смеси стандартов липидов, подготовленный в 2:1 хлороформ метанола. 100 микролитров от 425 до 600 микромолярной кислоты промывают стеклянные бусины и 600 микролитров хлороформного метанола 17:1 в трубку. Vortex трубки на высокой скорости в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы нарушить клетки.Затем вихревые в течение одного часа на низкой скорости при комнатной температуре для облегчения извлечения липидов. В конце извлечения инкубировать образец в течение 15 минут на льду, для содействия белковых осадков и разделения аквеозных и органических фаз. В конце инкубации, центрифуга образца для дальнейшего отделить верхнюю фазу aqueous от нижней органической фазы и, в дым капот, использовать borosilicate стеклянная пипетка для передачи нижней органической фазы в новый 15 мл высокой прочности стекла винт верхней центрифуги трубки с политетрафтороэтилен выстроились крышкой.Поместите нижнюю органическую фазу под поток азотного газа и, в дымовой капот, добавьте 300 микролитров смеси хлороформного метанола в оставшуюся верхнюю часть. Для облегчения фосфатидикацида, фосфатидилсерина, фосфатидилинозитол и кардио-липидного экстракции вихрь трубки энергично в течение пяти минут при комнатной температуре до центрифугирования образца. Используйте борозиликатную стеклянную пипетку для переноса нижней органической фазы в нижнюю органическую фазу под азотом и испарения растворителя в комбинированных органических фазах в дымовой капоте.Затем закройте трубки липидной пленки под потоком азотного газа и храните образцы при 80 градусах цельсия. Для жидкой хроматографии, разделение извлеченных липидов на 500 микролитров 63:35:5 ацето-нитрил-2-пропанол нано-чистой смеси воды в трубку липидной пленки и вихря три раза в течение десяти секунд на вихрь при комнатной температуре. Подавми содержимое трубки к ультразвуковой звуковой в течение 15 минут, прежде чем вихри трубки три раза в течение десяти секунд на вихрь, как только что продемонстрировали.Перенесите 100 микролитров образца в стеклянный флакон со вставкой, используемой для 24 хорошо пластины и устранить любые пузырьки в вставке. Поместите вставку в один колодец пластины 24 хорошо и загрузите обратную фазу C18 колонки CSH в сочетании с предварительной колонкой в жидкой системе хроматографии. Установите температуру столбца до 55 градусов по Цельсию и поток до 300 микролитров в минуту.Когда все параметры будут установлены, загрузите десять микролитров извлечения пустыми перед загрузкой первого образца. Затем отделяйте различные виды липидов, используя жидкий градиент хроматографии, как указано. Будет создана репрезентативная общая ионная хроматограмма из данных LC-MS для липидов, извлеченных из клеток.Для масс-спектрометрического анализа извлеченных липидов загрузите образцы на масс-спектрометр, оснащенный нагретым источником ионизации электро-спрей, и установите параметры анализа, изложенные в таблице. Используйте анализатор Fourier Transform analyzer для обнаружения родительских ионов MS-1 с разрешением 60 000 и в пределах массового диапазона 150-2000 дальятов. Затем обнаружите вторичные ионы MS-2 с помощью настроек, указанных в таблице.Для выявления и количественной оценки различных липидов из широкого тандема LC-MS файлов, поиск LC-MS сырые файлы, содержащие полное сканирование MS-1 данных и данных, зависящих от MS-2 данных бесплатно, неэстерифицированных жирных кислот, кардио-липиды, фитоцеримид, фитосфингоцен, фосфатидилхолин, фосфатидилеталамин, фосфатидлиглицерол, фосфатидлинозитол, фосфатидлидлерин и триацилглицерол липидные классы с использованием массы, разделенной на пять частей на миллион для ионов-предшественников. Затем следуйте инструкциям, представленным в руководстве пользователя программного обеспечения для выявления внутренних липидных стандартов и липидных видов с необычными составами жирных кислот. Этот чувствительный тандем LC-MS метод позволяет идентификации и количественной оценки молекулярных видов липидов в концентрациях, как низко как 0,165 пикомоляр на микролитр.Этот предел количественной оценки отличается от различных классов липидов в широком диапазоне концентраций. Этот метод может быть использован для повышения эффективности ионизации липидов с помощью альтернативных мобильных фазовых добавок для масс-спектрометрии ионизации электроспрей. Каждая из этих альтернативных мобильных фазовых добавок может быть использована как для обычных фазовых, так и для обратных фазовых LC-столбцов.Метод дисоциации, вызванный столкновением, полезен в сочетании с ацетатом ацетата аммония мобильной фазовой добавкой для электропысячи ионизации негативного режима масс-спектрометрии, так как в этих условиях позволяет повысить эффективность фрагментации липидов МС-1 в продукты МС-2. В отличие от этого, высокая энергия, метод столкновения диссоциации является благоприятным, если используется в сочетании с аммонием formate мобильной фазовой добавки для электро-спрей ионизации положительный режим масс-спектрометрии, как в этих условиях, это позволяет повысить эффективность MS-1 липидной ионной фрагментации в MS-2 продуктов. Не смешивайте фазы во время сбора органической фазы.Закройте трубы под потоком азотного газа. Исключите любой пузырь в вставке и соедините столбец в правильном направлении. Если личность какого-либо пика не может быть определена LC-MS, MS-NMR может быть использован для вывода структуры этой молекулы.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Тандем жидкостной хроматографии на основе подхода для анализа метаболитов<em&gt; Золотистый стафилококк</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Липидное Выделение капельного для количественной анализа масс-спектрометрии

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Glycoproteomics внеклеточного матрикса: Метод анализа интактного гликопептидных использованием масс-спектрометрии

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Глубокая протеома профилирование Изобарический маркировки, обширные жидкостная хроматография, масс-спектрометрии и при содействии программного обеспечения количественной оценки

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Идентификация фосфата инозитола или фосфонинозидных взаимодействующих белков по хроматографии Affinity в сочетании с Западной погреловой или масс-спектрометрией

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Абсолютная количественная количественная количественная количественная метания белка без клеток путем обратной фазы жидкой хроматографии-масс-спектрометрии

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Нецелевая жидкая хроматография-масс-спектрометрия на основе метаболомики Анализ зерна пшеницы

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...