Name: quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry
Uploaded: 2020-03-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

Vi är tacksamma mot nuvarande och tidigare medlemmar av Titorenkolaboratoriet för diskussioner. Vi erkänner Centrum för biologiska tillämpningar av masspektrometri och Centrum för strukturell och funktionell genomik (båda vid Concordia University) för enastående tjänster. Studien stöddes av bidrag från Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada (RGPIN 2014-04482) och Concordia University Chair Fund (CC0113). K.M. stöddes av Concordia University Merit Award.

1. Beredning av sterila medier för odling av jäst
<ol><li>Förbered 90 ml av ett komplett YP-medium som innehåller 1% (w/v) jästextrakt och 2% (w/v) bactopepton.</li>
	<li>Förbered 90 ml av ett syntetiskt minimalt YNB-medium som innehåller 0,67% (w/v) jästkvävebas utan aminosyror, 20 mg/L L-histidin, 30 mg/L L-leucin, 30 mg/L L-lysin och 20 mg/L uracil.</li>
	<li>Dela upp 90 ml av hela YP-mediet lika i två 250 ml Erlenmeyer-flaskor (dvs. 45 ml vardera).</li>
	<li>Dela upp 90 ml av de...

<ol>
	<li>Bou Khalil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+era:+accomplishments+and+challenges.">Lipidomics era: accomplishments and challenges.</a> Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).</li><li>Shevchenko, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+coming+to+grips+with+lipid+diversity.">Lipidomics: coming to grips with lipid diversity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).</li><li>Br&#252;gger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+analysis+of+the+lipid+composition+of+cells+and+subcellular+organelles+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).</li><li>Zechner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAT+SIGNALS+-+lipases+and+lipolysis+in+lipid+metabolism+and+signaling.">FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling.</a> Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).</li><li>Eisenberg, T., B&#252;ttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+and+cell+death+in+yeast.">Lipids and cell death in yeast.</a> FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).</li><li>Richard, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+liponecrosis,+a+distinct+mode+of+programmed+cell+death.">Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death.</a> Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).</li><li>Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+the+discovery+of+anti-tumor+pharmaceuticals:+searching+for+activators+of+liponecrosis.">A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis.</a> Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).</li><li>M&#229;rtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+lipids+on+mitochondrial+functions.">Effects of lipids on mitochondrial functions.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).</li><li>Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-bilayer+phospholipids+in+mitochondrial+structure+and+function.">The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function.</a> FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).</li><li>Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+membrane+turnover+by+phosphatidic+acid:+cellular+functions+and+disease+implications.">Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).</li><li>Goldberg, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+of+lipid+droplets+in+regulating+longevity.">A novel function of lipid droplets in regulating longevity.</a> Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).</li><li>Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obese+and+anorexic+yeasts:+experimental+models+to+understand+the+metabolic+syndrome+and+lipotoxicity.">Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).</li><li>Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+metabolism+and+cellular+aging.">Peroxisome metabolism and cellular aging.</a> Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).</li><li>Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+regulation+of+glycerolipids+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).</li><li>Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+peroxisomes:+key+players+in+cellular+lipid+homeostasis+or+a+matter+of+fat--store+'em+up+or+burn+'em+down.">Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down.</a> Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).</li><li>Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+topology+and+regulation+of+cardiolipin+biosynthesis+and+remodeling+in+yeast.">The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).</li><li>Dimmer, K. S., Rapaport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+contact+sites+as+platforms+for+phospholipid+exchange.">Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).</li><li>Csord&#225;s, G., Weaver, D., Hajn&#243;czky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contactology:+structure+and+signaling+functions.">Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions.</a> Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).</li><li>Mitrofanova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+and+transport+define+longevity+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).</li><li>Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+contact+zones+as+sites+for+lipid+transfer.">Organelle contact zones as sites for lipid transfer.</a> Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).</li><li>Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).</li><li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast:+an+experimental+organism+for+21st+Century+biology.">Yeast: an experimental organism for 21st Century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li><li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+for+budding+geneticists:+a+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system.">Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li><li>Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+surrogate+and+chemical+genetics+in+model+organisms+can+suggest+therapies+for+human+genetic+diseases.">How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases.</a> Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).</li><li>Zimmermann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+tool+to+identify+anti-aging+compounds.">Yeast as a tool to identify anti-aging compounds.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).</li><li>Ejsing, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+yeast+lipidome+by+quantitative+shotgun+mass+spectrometry.">Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).</li><li>Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+lipid+analysis+and+quantification+by+mass+spectrometry.">Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry.</a> Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).</li><li>Guan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+membrane+lipidomics+during+Drosophila+development.">Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development.</a> Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).</li><li>Klose, C., Tarasov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+yeast+lipids+by+shotgun+lipidomics.">Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).</li><li>Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+advances+in+shotgun+lipidomics+for+biology+and+medicine.">Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine.</a> Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).</li><li>Sud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMSD:+LIPID+MAPS+structure+database.">LMSD: LIPID MAPS structure database.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).</li><li>Pauling, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposal+for+a+common+nomenclature+for+fragment+ions+in+mass+spectra+of+lipids.">Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids.</a> PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).</li></ol>

Följande försiktighetsåtgärder är viktiga för ett framgångsrikt genomförande av det protokoll som beskrivs här:
1. Kloroform och metanol är giftiga. De extraherar effektivt olika ämnen från ytor, inklusive laboratorieplastoch din hud. Därför hantera dessa organiska lösningsmedel med försiktighet genom att undvika användning av plast i steg som innebär kontakt med kloroform och / eller metanol, med borosilikat glas pipetter för dessa steg, och skölja dessa pipetter med kloro...

En mängd bevis tyder på att lipider, en av de viktigaste klasserna av biomolekyler, spelar viktiga roller i många viktiga processer inom en eukaryota cell. Dessa processer omfattar montering av lipidbilayers som utgör plasmamembran och membran kring cellulära organeller, transport av små molekyler över cellmembran, svar på förändringar i den extracellulära miljön och intracellulära signaltransduktion, generering och lagring av energi, import och export av proteiner som är begränsade till olika organeller, fordonshandel med proteiner inom endomembranesystemet och proteinutsöndringen samt flera sätt att reglera disponikeldöd1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Den spirande jäst S. cerevisiae, en encellig eukaryota organism, har framgångsrikt använts för att avslöja några av de mekanismer som ligger till grund för de väsentliga rollerna av lipider i dessa viktiga cellulära processer4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae är en värdefull modell organism för att avslöja dessa mekanismer eftersom det är mottagliga för omfattande biokemiska, genetiska, cell biologiska, kemiska biologiska, system biologiska, och mikrofluidiska dissekering analyser21,22,23,24,25. Ytterligare framsteg i förståelse mekanismer genom vilka lipidmetabolism och intracellulära transporter bidrar till dessa viktiga cellulära processer kräver känsliga massa spectrometri teknik för kvantitativ karakterisering av cellulära lipidom, förstå lipidom molekylär komplexitet, och integrera kvantitativa lipidomik i en tvärvetenskaplig plattform av systembiologi1,2,3,26, 27,28,29,30.
Nuvarande metoder för masspektrometriassisterad kvantitativa lipidomik av jästceller och celler i andra eukaryota organismer är inte tillräckligt mångsidiga, robusta eller känsliga. Dessutom är dessa metoder som för närvarande används inte kan skilja olika isobariska eller isomeric lipidarter från varandra. Här beskriver vi en mångsidig, robust och känslig metod som tillåter användning av flytande kromatografi tillsammans med tandem masspektrometri (LC-MS/MS) för kvantitativ analys av större cellulära lipider av S. cerevisiae.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>05-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>60180A-SV9-1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A9554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 series LC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1312A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent1100 Wellplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1367A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A470-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiolipin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>750332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centra CL2 clinical centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramide</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C297-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSH C18 VanGuard</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006944</td>
			<td>Pre-column system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free fatty acid (19:0)</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (acid-washed, 425-600 &#956;M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Search software (V4.1)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V4.1</td>
			<td>LC-MS/MS analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylglycerol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylserine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse-phase column CSH C18</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingosine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Orbitrap Velos MS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ETD-10600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricylglycerol</td>
			<td>Larodan, Malmo</td>
			<td>TAG Mixed FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0919-15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strain BY4742</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>YSC1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

Lipider är strukturellt olika amfipatiska molekyler som är olösliga i vatten. Lipider är viktiga bidragsgivare till organisationen och funktionen av biologiska membran, energilagring och produktion, cellulär signalering, fordonstransport av proteiner, organelle biogenes och reglerad celldöd. Eftersom den spirande jästen Saccharomyces cerevisiae är en encellig eukaryote mottaglig för grundliga molekylära analyser, hjälpte dess användning som modellorganism till att avslöja mekanismer som kopplar lipidmetabolism och intracellulära transporter till komplexa biologiska processer inom eukaryota celler. Tillgången till en mångsidig analysmetod för robust, känslig och korrekt kvantitativ bedömning av större klasser av lipider i en jästcell är avgörande för att få djupa insikter i dessa mekanismer. Här presenterar vi ett protokoll för att använda flytande kromatografi tillsammans med tandem masspektrometri (LC-MS/MS) för kvantitativ analys av större cellulära lipider av S. cerevisiae. LC-MS/MS-metoden som beskrivs är mångsidig och robust. Det möjliggör identifiering och kvantifiering av många arter (inklusive olika isobariska eller isomeric former) inom var och en av de 10 lipidklasser. Denna metod är känslig och möjliggör identifiering och kvantiering av vissa lipidarter vid koncentrationer så låga som 0,2 pmol/μL. Metoden har framgångsrikt tillämpats på att bedöma lipidomer av hela jästceller och deras renade organeller. Användningen av alternativa mobila fastillsatser för elektrosprayjonisering massa spektrometri i denna metod kan öka effektiviteten i jonisering för vissa lipidarter och kan därför användas för att förbättra deras identifiering och kvantisering.

Vår metod för en kvantitativ bedömning av större cellulära lipider i en jästcell med hjälp av LC-MS/MS var mångsidig och robust. Det tillät oss att identifiera och kvantifiera 10 olika lipidklasser i S. cerevisiae celler odlade i syntetiska minimal YNB medium som ursprungligen innehåller 2% glukos. Dessa lipidklasser inkluderar fria (oesterade) fettsyror (FFA), CL, fytoceramid (PHC), fytosphingosin (PHS), PC, PE, PG, PI, PS och TAG (Supplemental Tabell 1</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Vi presenterar ett protokoll med flytande kromatografi tillsammans med tandem massa spektrometri för att identifiera och kvantifiera stora cellulära lipider i Saccharomyces cerevisiae. Den beskrivna metoden för en kvantitativ bedömning av större lipidklasser i en jästcell är mångsidig, robust och känslig.

Kvantitativ analys av cellulär lipidom e av Saccharomyces Cerevisiae med hjälp av flytande kromatografi tillsammans med Tandem Mass Spectrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Detta protokoll ger en korrekt och reproducerbar metod för att kvantifiera tio olika lipidklasser av Saccharomyces cerevisiae med en enda extraktionsmetod och en enda LC-MS-metod. Denna metod möjliggör detektion och kvantifiering av isobaric och isomeriska lipidic arter med olika kemiska och fysikaliska egenskaper. För Saccharomyces cerevisiae-odling, tillsätt först 5 ml steril 20%glukos stamlösning till var och en av två Erlenmeyerkolvar som innehåller sterilt YNB-medium till en slutlig koncentration av 2%glukos.Använd sedan en steril pipettering för att överföra en volym av en jästkultur över natten som innehåller fem gånger tio till de sjunde jästcellerna i varje kolv och odla kolvarna i minst 24 timmar vid 30 grader Celsius med rotationsskakning vid 200 varv per minut. För lipidutsug, bestäm det totala antalet jästceller per milliliter av kultur och överför fem gånger tio till de sjunde cellerna till ett 15 ml centrifugrör. Tillsätt iskallt nano-rent vatten för att få den totala volymen upp till 15 ml och samla in cellerna genom centrifugeringen.Åter upphäva jäst pelleten i 15 ml iskall iso-tonic ammonium bikarbonat buffert för en andra centrifugation och åter upphäva pelleten i 1,5 ml färsk iskall ammonium bikarbonat lösning. Vid centrifugeringens ände förvaras pelleten i 80 grader celsius fram till utsuget. För att påbörja lipidutdragningen tina cellpelletsen på is innan cellerna åter suspenderas i 200 mikroliter iskallt nanorent vatten.I en fume huva, överför cellen suspensionen till en 15 ml, höghållfast glas, skruv topp centrifugrör med en polytetrafluoreten fodrad mössa och tillsätt 25 mikroliter av en intern lipider standarder blandning, framställd i 2:1 kloroform metanol. 100 mikroliter av 425 till 600 mikromolarsyra tvättade glaspärlor och 600 mikroliter av en 17:1 kloroform metanol till röret. Vortexa röret i hög hastighet i fem minuter vid rumstemperatur för att störa cellerna.Följt av vortexing i en timme vid låg hastighet vid rumstemperatur för att underlätta lipidutdragning. Vid slutet av extraktionen, inkubera provet i 15 minuter på is, för att främja proteinutfällning och separation av de vattenhaltiga och organiska faserna. I slutet av inkubationen, centrifug provet att ytterligare separera den övre vattenfasen från den nedre organiska fasen och, i fume huven, använda en borosilikat glaspipett för att överföra den lägre organiska fasen till en ny 15 ml höghållfast glas skruv topp centrifuge rör med en polytetrafluoreten fodrad lock.Placera den nedre organiska fasen under flödet av kvävegas och, i rökhuven, tillsätt 300 mikroliter av en 2:1 kloroform metanolblandning till den återstående övre vattenfasen. För att underlätta fosfatidicacid, fosfatidylserin, fosfatidylinositol och kardio-lipid extraktion virvel röret kraftigt i fem minuter vid rumstemperatur innan centrifuging provet. Använd en pipett av borosilikatglas för att överföra den nedre organiska fasen i den lägre organiska fasen under kväve och avdunsta lösningsmedlet i de kombinerade organiska faserna i rökhuven.Stäng sedan rören av lipidfilm under flödet av kvävegas och förvara proverna vid 80 grader celsius. För flytande kromatografi, separation av de extraherade lipider vid 500 mikroliter av en 63:35:5 aceto-nitril-2-propanol nano-rent vatten blandningen till röret av lipidfilm och virvel tre gånger i tio sekunder per virvel vid rumstemperatur. Föremål röret innehållet till ultraljud ultraljudsbehandling i 15 minuter innan vortexing röret tre gånger i tio sekunder per virvel som just visat.Överför 100 mikroliter av provet till en glasflaska med ett skär som används för en 24 brunnsplatta och eliminera eventuella bubblor inom skäret. Placera insatsen i en brunn av en 24 brunnsplatta och ladda en omvänd fas C18-kolumn CSH kopplade till en förkolonn i vätskekromatografisystemet. Ställ in kolumntemperaturen på 55 grader celsius och flödet till 300 mikroliter per minut.När alla parametrar har ställts in, ladda tio mikroliter av en extraktion blank innan du laddar det första provet. Därefter separera de olika lipidarterna med hjälp av vätskekromatografigradienten, som angivelser. Ett representativt totalt jonkromatogram från LC-MS-data för de lipider som extraheras från cellerna kommer att genereras.För masspektrometrisk analys av de extraherade lipiderna, ladda proverna på en masspektrometer utrustad med en uppvärmd elektro-sprayjonisation jonisationsjonkälla och ställa in analysparametrarna som beskrivs i tabellen. Använd Fourier Transform Analyzer för att upptäcka MS-1 förälder joner med en upplösning på 60, 000 och inom massintervallet 150-2000 dalton. Sedan, upptäcka MS-2 sekundära joner med hjälp av inställningarna som anges i tabellen.För att identifiera och kvantifiera olika lipider från breda tandem LC-MS-filer, sök LC-MS raw-filer som innehåller full scan MS-1 data och databeroende MS-2 data för gratis, oesterifierade fettsyror, cardio-lipid, phytocerimide, phytosphyngocene, fosfatidylkolin, fosfatidytylethanolamin, fosfatydlglycerol, fosphatydlinositol, fosfatydlserin och triacylglycerol lipidklasser med hjälp av en massa som delas av laddningstolerans på fem delar per miljon för prekursorjoner och tio delar per miljon för produktjoner. Följ sedan instruktionerna som ges i programvaran användarhandboken för att identifiera interna lipidstandarder och lipidarter med ovanliga fettsyrakompositioner. Denna känsliga tandem LC-MS-metod möjliggör identifiering och kvantifiering av molekylära arter av lipider vid koncentrationer så låga som 0,165 picomolar per mikroliter.Denna begränsning av kvantifiering skiljer sig från olika lipidklasser inom ett brett spektrum av koncentrationer. Denna metod kan användas för att öka effektiviteten i jonisering för lipider genom att använda alternativa mobila fastillsatser för elektrosprayjoniseringsmasspektrometrin. Var och en av dessa alternativa mobila fastillsatser kan användas för både den normala fasen och omvänd fas LC kolumner.Kollisionen inducerad dissociation metod är fördelaktigt om den används i kombination med ammoniumacetat mobil fas tillsats för elektro-spray jonisering negativa läget för masspektrometri, som, under dessa förhållanden, det tillåter ökningen av effektiviteten av MS-1 lipid jon fragmentering i MS-2 produkter. Däremot är den höga energi, kollisionsal dissociation metod gynnsam om den används i kombination med ammoniumformate mobil fas tillsats för elektro-spray jonisering positivt läge för masspektrometri som under dessa förhållanden, möjliggör det en ökning av effektiviteten av MS-1 lipid jon fragmentering i MS-2 produkter. Blanda inte faserna medan du samlar den organiska fasen.Stäng rören under flödet av kvävegas. Eliminera eventuell bubbla inom skäret och anslut kolumnen i rätt riktning. Om någon topps identitet inte kan fastställas med LC-MS kan MS-NMR användas för att utläsa den molekylens struktur.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

En Tandem vätskekromatografi-masspektrometri baserad strategi för metabolit analys av<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolation för Kvantitativ masspektrometri Analys

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Glycoproteomics av ​​den extracellulära matrisen: En metod för intakt glykopeptiden analys med masspektrometri

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Djupa proteomet profilering av isobariska märkning, omfattande vätskekromatografi, masspektrometri och programvara-assisted kvantifiering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identifiering av inositol fosfat eller fosfoinositid samverkande proteiner genom affinitetskromatografi kopplad till Western blot eller masspektrometri

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolut kvantifiering av cellfri protein syntes metabolism genom omvänd fas vätskekromatografi-masspektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Oriktad flytande kromatografi-Mass Pektrometri-Baserade metabolomika analys av vetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...