Name: quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry
Uploaded: 2020-03-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

Titorenko laboratuvarının mevcut ve eski üyelerine görüşmeler için müteşekkiriz. Kütle Spektrometresi Biyolojik Uygulamalar Merkezi ve Yapısal ve Fonksiyonel Genomik Merkezi'ni (her ikisi de Concordia Üniversitesi'nde) olağanüstü hizmetler için kabul ediyoruz. Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (RGPIN 2014-04482) ve Concordia Üniversitesi Başkanlık Fonu (CC0113) tarafından desteklenmiştir. K.M. Concordia Üniversitesi Liyakat Ödülü ile desteklendi.

1. Maya kültüriçin steril ortam hazırlanması
<ol><li>% 1 (w / v) maya ekstresi ve% 2 (w / v) bactopeptone içeren tam bir YP orta 90 mL hazırlayın.</li>
	<li>90 mL sentetik minimal YNB ortamı içeren 0.67% (w/v) amino asitler olmadan maya azot baz, 20 mg /L -histidin, 30 mg/L L-l -l -lösin, 30 mg/L -l -lizin ve 20 mg/L urasil hazırlayın. </li>
	<li>Tam YP ortamının 90 mL'sini eşit olarak 250 mL Erlenmeyer şişesine (yani her biri 45 mL) bölün.</li>
	<li>Sentetik minimal YNB ...

<ol>
	<li>Bou Khalil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+era:+accomplishments+and+challenges.">Lipidomics era: accomplishments and challenges.</a> Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).</li><li>Shevchenko, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+coming+to+grips+with+lipid+diversity.">Lipidomics: coming to grips with lipid diversity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).</li><li>Br&#252;gger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+analysis+of+the+lipid+composition+of+cells+and+subcellular+organelles+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).</li><li>Zechner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAT+SIGNALS+-+lipases+and+lipolysis+in+lipid+metabolism+and+signaling.">FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling.</a> Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).</li><li>Eisenberg, T., B&#252;ttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+and+cell+death+in+yeast.">Lipids and cell death in yeast.</a> FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).</li><li>Richard, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+liponecrosis,+a+distinct+mode+of+programmed+cell+death.">Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death.</a> Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).</li><li>Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+the+discovery+of+anti-tumor+pharmaceuticals:+searching+for+activators+of+liponecrosis.">A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis.</a> Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).</li><li>M&#229;rtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+lipids+on+mitochondrial+functions.">Effects of lipids on mitochondrial functions.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).</li><li>Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-bilayer+phospholipids+in+mitochondrial+structure+and+function.">The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function.</a> FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).</li><li>Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+membrane+turnover+by+phosphatidic+acid:+cellular+functions+and+disease+implications.">Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).</li><li>Goldberg, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+of+lipid+droplets+in+regulating+longevity.">A novel function of lipid droplets in regulating longevity.</a> Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).</li><li>Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obese+and+anorexic+yeasts:+experimental+models+to+understand+the+metabolic+syndrome+and+lipotoxicity.">Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).</li><li>Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+metabolism+and+cellular+aging.">Peroxisome metabolism and cellular aging.</a> Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).</li><li>Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+regulation+of+glycerolipids+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).</li><li>Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+peroxisomes:+key+players+in+cellular+lipid+homeostasis+or+a+matter+of+fat--store+'em+up+or+burn+'em+down.">Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down.</a> Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).</li><li>Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+topology+and+regulation+of+cardiolipin+biosynthesis+and+remodeling+in+yeast.">The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).</li><li>Dimmer, K. S., Rapaport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+contact+sites+as+platforms+for+phospholipid+exchange.">Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).</li><li>Csord&#225;s, G., Weaver, D., Hajn&#243;czky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contactology:+structure+and+signaling+functions.">Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions.</a> Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).</li><li>Mitrofanova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+and+transport+define+longevity+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).</li><li>Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+contact+zones+as+sites+for+lipid+transfer.">Organelle contact zones as sites for lipid transfer.</a> Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).</li><li>Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).</li><li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast:+an+experimental+organism+for+21st+Century+biology.">Yeast: an experimental organism for 21st Century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li><li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+for+budding+geneticists:+a+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system.">Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li><li>Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+surrogate+and+chemical+genetics+in+model+organisms+can+suggest+therapies+for+human+genetic+diseases.">How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases.</a> Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).</li><li>Zimmermann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+tool+to+identify+anti-aging+compounds.">Yeast as a tool to identify anti-aging compounds.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).</li><li>Ejsing, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+yeast+lipidome+by+quantitative+shotgun+mass+spectrometry.">Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).</li><li>Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+lipid+analysis+and+quantification+by+mass+spectrometry.">Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry.</a> Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).</li><li>Guan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+membrane+lipidomics+during+Drosophila+development.">Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development.</a> Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).</li><li>Klose, C., Tarasov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+yeast+lipids+by+shotgun+lipidomics.">Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).</li><li>Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+advances+in+shotgun+lipidomics+for+biology+and+medicine.">Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine.</a> Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).</li><li>Sud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMSD:+LIPID+MAPS+structure+database.">LMSD: LIPID MAPS structure database.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).</li><li>Pauling, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposal+for+a+common+nomenclature+for+fragment+ions+in+mass+spectra+of+lipids.">Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids.</a> PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).</li></ol>

Burada açıklanan protokolün başarılı bir şekilde uygulanması için aşağıdaki önlemler önemlidir:
1. Kloroform ve metanol toksiktir. Laboratuvar plastik leri ve cildiniz de dahil olmak üzere yüzeylerden çeşitli maddeleri verimli bir şekilde ayıklar. Bu nedenle, kloroform ve / veya metanol ile temas içeren adımlarda plastik kullanımını kaçınarak dikkatli bu organik çözücüler ele, bu adımlar için borosilikat cam pipetler kullanarak, ve kullanmadan önce kloroform v...

Bir kanıt gövdesi, biyomoleküllerin ana sınıflarından biri olan lipidlerin ökaryotik hücre içindeki birçok hayati süreçte önemli roller oynadığını göstermektedir. Bu süreçler arasında hücre organlarını çevreleyen plazma membran ve membranlar oluşturan lipid iki tabakalarının biraraya edilmesi, küçük moleküllerin hücre zarları arasında taşınması, hücre dışı ortamdaki değişikliklere yanıt ve hücre içi sinyal iletimi, enerjinin üretimi ve depolanması, farklı organellere hapsedilmiş proteinlerin ithalat ve ihracatı, endmembran sistemi ve protein salgılanması içinde proteinlerin vesiküler ticareti ve düzenlenmiş hücre ölümü çeşitli modları1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Tomurcuklanan maya S. cerevisiae, tek hücreli ökaryotik organizma, başarıyla bu hayati hücreselsüreçlerdelipidlerin temel rolleri altında yatan mekanizmaların bazılarını ortaya çıkarmak için kullanılmıştır 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. Kapsamlı biyokimyasal, genetik, hücre biyolojik, kimyasal biyolojik, sistem biyolojik ve mikroakışkan diseksiyon analizleri21,22,23,24,25münasip olduğu için S. cerevisiae bu mekanizmaları ortaya çıkarmak için değerli bir model organizmadır. Lipid metabolizması ve hücre içi taşımanın bu hayati hücresel süreçlere katkıda bulunduğu mekanizmaları anlamada daha fazla ilerleme, hücresel lipidomun kantitatif karakterizasyonu, lipidom moleküler karmaşıklığınınanlaşılması ve kantitatif lipidomiklerin sistemlerin çok disiplinli platformuna entegre edilmesi için hassas kütle spektrometresi teknolojileri gerektirir. 27,28,29,30.
Maya hücrelerinin ve diğer ökaryotik organizmaların hücrelerinin kütle spektrometresi destekli nicel lipidomikler için mevcut yöntemler yeterince çok yönlü, sağlam veya hassas değildir. Ayrıca, bu şu anda kullanılan yöntemler birbirinden çeşitli izobarik veya izzosik lipid türleri ayırt etmek mümkün değildir. Burada, S. cerevisiae'ninmajör hücresel lipitlerinin kantitatif analizi için tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ile birleşen sıvı kromatografisinin kullanımına olanak tanıyan çok yönlü, sağlam ve hassas bir yöntemi tanımlıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>05-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>60180A-SV9-1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A9554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 series LC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1312A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent1100 Wellplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1367A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A470-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiolipin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>750332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centra CL2 clinical centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramide</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C297-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSH C18 VanGuard</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006944</td>
			<td>Pre-column system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free fatty acid (19:0)</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads (acid-washed, 425-600 &#956;M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Search software (V4.1)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>V4.1</td>
			<td>LC-MS/MS analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylglycerol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylserine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse-phase column CSH C18</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186006102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingosine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Orbitrap Velos MS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ETD-10600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricylglycerol</td>
			<td>Larodan, Malmo</td>
			<td>TAG Mixed FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0919-15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strain BY4742</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>YSC1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of the cellular lipidome of saccharomyces cerevisiae using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

Lipidler suda çözünmez yapısal olarak çeşitli amphipatik moleküllerdir. Lipidler biyolojik membranların organizasyonu ve işlevi, enerji depolama ve üretimi, hücresel sinyalizasyon, proteinlerin veziküler taşınması, organel biyogenezi ve düzenlenmiş hücre ölümü için temel katkıda bulunmaktadır. Tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae kapsamlı moleküler analizler için tek hücreli ökaryot münasip olduğundan, model bir organizma olarak kullanımı ökaryotik hücreler içinde karmaşık biyolojik süreçlere lipid metabolizması ve hücre içi taşıma bağlayan mekanizmaları ortaya çıkarmak yardımcı oldu. Bir maya hücresi içindeki büyük lipid sınıflarının sağlam, hassas ve doğru nicel değerlendirilmesi için çok yönlü bir analitik yöntemin bulunması, bu mekanizmalar hakkında derin bilgiler elde etmek için çok önemlidir. Burada S. cerevisiae'nin majör hücresel lipitlerinin kantitatif analizi için tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ile birleşen sıvı kromatografisi kullanmak için bir protokol salıyoruz. Açıklanan LC-MS/MS yöntemi çok yönlü ve sağlamdır. 10 lipid sınıfının her birinde çok sayıda türün (farklı izobarik veya izometrik formlar dahil) tanımlanmasını ve sayısallaştırılmasını sağlar. Bu yöntem hassastır ve bazı lipid türlerinin 0,2 pmol/μL gibi düşük konsantrasyonlarda tanımlanmasına ve sayısallaştırılmasına olanak sağlar. Yöntem başarıyla tüm maya hücreleri ve saflaştırılmış organellerin lipidomların değerlendirilmesi için uygulanmıştır. Bu yöntemde elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi için alternatif mobil faz katkı larının kullanılması bazı lipid türleri için iyonlaşma verimliliğini artırabilir ve bu nedenle bunların tanımlanması ve nicelliği artırmak için kullanılabilir.

LC-MS/MS yardımı ile bir maya hücresi içindeki majör hücresel lipidlerin nicel değerlendirilmesi için yöntemimiz çok yönlü ve sağlamdı. Başlangıçta %2 glikoz içeren sentetik minimal YNB ortamda yetiştirilen S. cerevisiae hücrelerinde 10 farklı lipid sınıfını tanımlamamızı ve ölçmemizi sağladı. Bu lipid sınıfları serbest (estersiz) yağ asitleri (FFA), CL, fitoseramid (PHC), fitosfingosin (PHS), PC, PE, PG, PI, PS ve TAG(Ek Tablo 1)</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Saccharomyces cerevisiae'dekimajör hücresel lipitleri tanımlamak ve ölçmek için tandem kütle spektrometresi ile birleşen sıvı kromatografi kullanılarak bir protokol sayılmaktadır. Bir maya hücresi içindeki majör lipid sınıflarının nicel bir değerlendirme için açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve duyarlıdır.

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Bu protokol, tek bir ekstraksiyon yöntemi ve tek bir LC-MS yöntemi kullanarak Saccharomyces cerevisiae'nin on farklı lipid sınıfını ölçmek için doğru ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu yöntem, farklı kimyasal ve fiziksel özelliklere sahip izobarik ve izojik lipidik türlerin saptanmasını ve nicelemesine olanak sağlar. Saccharomyces cerevisiae kültürü için, ilk olarak steril YNB orta içeren iki Erlenmeyer şişelerinin her birine %2'lik son glukoz konsantrasyonuna 5 ml steril %20 glikoz çözeltisi ekleyin.Daha sonra, her şişe ve kültür her şişe içine yedi maya hücreleri beş kez on içeren bir gecede maya kültürünün bir hacim aktarmak için steril bir pipet kullanın dakikada 200 devrimleri rotasyonsal sallayarak 30 derece santigrat en az 24 saat şişeleri. Lipid ekstraksiyonu için, kültür mililitre başına maya hücrelerinin toplam sayısını belirlemek ve 15 ml santrifüj tüp içine yedinci hücrelere beş kez on aktarın. 15 ml kadar toplam hacmi getirmek ve santrifüj ile hücreleri toplamak için buz gibi nano saf su ekleyin.İkinci bir santrifüj için 15 ml buz gibi izo-tonik amonyum bikarbonat tamponundaki maya peletini yeniden askıya alın ve peleti 1,5 ml taze buz gibi amonyum bikarbonat çözeltisi içinde yeniden askıya alın. Santrifüjün sonunda, peleti çıkarma kadar 80 derecede saklayın. Lipid ekstraksiyonu başlatmak için, buz soğuk nano saf su 200 mikrolitre hücreleri yeniden askıya almadan önce buz üzerinde hücre pelet çözülme.Bir duman kaputunda, hücre süspansiyonunu 15 ml'ye, yüksek mukavemetli bir cama, politetrafloroetilen kaplı kapaklı vidalı üst santrifüj tüpüne aktarın ve 2:1 kloroform metanol'de hazırlanan dahili lipid standartları karışımından 25 mikrolitre ekleyin. 100 mikrolitre 425-600 mikromolar asit yıkanmış cam boncuklar ve tüp bir 17:1 kloroform metanol 600 mikrolitre. Hücreyi bozmak için tüpü oda sıcaklığında beş dakika yüksek hızda girdaplayın.Lipid ekstraksiyonu kolaylaştırmak için oda sıcaklığında düşük hızda bir saat girdap takip. Ekstraksiyon sonunda, protein yağışı ve sulu ve organik fazların ayrılması teşvik etmek için, buz üzerinde 15 dakika boyunca örnek kuluçka. Kuluçka sonunda, alt organik fazdan üst sulu fazı daha fazla ayırmak için numuneyi santrifüj edin ve duman kaputunda, alt organik fazı politetrafloroetilen kaplı kapaklı yeni 15 ml'lik yüksek mukavemetli cam vidaüst santrifüj tüpüne aktarmak için borosilikat cam pipet kullanın.Azot gazı akışı altında alt organik faz yerleştirin ve, duman kaputunda, kalan üst sulu faza 2:1 kloroform metanol karışımı 300 mikrolitre ekleyin. Fosfatidikasit, fosfatidilserin, fosfatidilisol ve kardiyo-lipid ekstraksiyon girdap kuvvetle oda sıcaklığında beş dakika boyunca tüp teşvik etmek için örnek santrifüj önce. Azot altında alt organik faz içine alt organik faz aktarmak ve duman kaputundaki kombine organik fazlarda çözücü buharlaştırmak için bir borosilikat cam pipet kullanın.Daha sonra, azot gazı akışı altında lipid film tüpleri kapatın ve 80 santigrat derece örnekleri saklayın. Sıvı kromatografiiçin, çıkarılan lipidlerin 500 mikrolitrelik bir 63:35:5 aceto-nitril-2-propanol nano-saf su karışımının lipid film tüpüne ayrılması ve oda sıcaklığında girdap başına üç kez girdap. Sadece gösterildiği gibi girdap başına on saniye için tüp üç kez girdap önce 15 dakika boyunca ultrasonik sonication için tüp içeriğini tabi.Numunenin 100 mikrolitresini 24 kuyu plakası için kullanılan bir kesici uçla cam bir şişeye aktarın ve kesici uçtaki kabarcıkları ortadan kaldırın. Kesici ucu 24 kuyuluktan birine yerleştirin ve sıvı kromatografi sistemine bir ön kolonla birleşen ters faz C18 sütun CSH yükleyin. Kolon sıcaklığını 55 dereceye, akışı dakikada 300 mikrolitreye ayarlayın.Tüm parametreler ayarlandığında, ilk numuneyi yüklemeden önce bir çıkarma boşunun on mikrolitresini yükleyin. Daha sonra, belirtildiği gibi sıvı kromatografi gradient kullanarak farklı lipid türleri ayırın. Hücrelerden çıkarılan lipidler için LC-MS verilerinden temsili bir iyon kromatogramı üretilecektir.Çıkarılan lipidlerin kütle spektrometrik analizi için, numuneleri ısıtmalı elektro-sprey iyonizasyon kaynağı ile donatılmış bir kütle spektrometresine yükleyin ve analiz parametrelerini tabloda belirtildiği şekilde ayarlayın. MS-1 ana iyonlarını 60,000 çözünürlükte ve 150-2000 dalton kütle aralığında tespit etmek için Fourier Transform Analyzer'ı kullanın. Ardından, tabloda belirtildiği gibi ayarları kullanarak MS-2 ikincil iyonlarını algılayın.Geniş tandem LC-MS dosyalarından farklı lipitleri tanımlamak ve ölçmek için, tam tarayın MS-1 verileri ve veri bağımlı MS-2 verilerini içeren LC-MS ham dosyalarını ücretsiz, estersiz yağ asitleri için arayın, kardiyo-lipid, fitoserimid, fitosidilamid, fitosidilgolen, fosfatidiletanolamin, fosfatiddenolamine, fosfatydlinositol, fosfatydlinositol, fosfatydlserinve triacifiyinserinve triacylglycerol lipid sınıfları prekürsör iyonları iyonları iyonları için milyon da perdelik beş parça ve milyon iyonları için on parça şarj toleransı ile bölünmüş bir kitle kullanarak. Daha sonra, olağandışı yağ asidi bileşimlerine sahip dahili lipid standartlarını ve lipid türlerini belirlemek için yazılım kullanım kılavuzunda verilen talimatları uygulayın. Bu hassas tandem LC-MS yöntemi, mikrolitre başına 0,165 picomolar gibi düşük konsantrasyonlarda lipidmoleküler türlerinin tanımlanmasını ve sayısallaştırılmasını sağlar.Bu sayısallaştırma sınırı, çok çeşitli konsantrasyonlarda farklı lipid sınıflarından farklıdır. Bu yöntem, elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi için alternatif mobil faz katkı maddeleri kullanılarak lipidler için iyonlaşma nın verimliliğini artırmak için kullanılabilir. Bu alternatif mobil faz katkılarının her biri hem normal faz hem de ters faz LC sütunları için kullanılabilir.Çarpışmaya bağlı dissosilasyon yöntemi, kitle spektrometresinin elektro-sprey iyonizasyon negatif modu için amonyum asetat mobil faz katkısı ile birlikte kullanıldığında faydalıdır, çünkü bu koşullar altında MS-1 lipid iyon parçalanmasının MS-2 ürünlerine veriminin artmasına olanak sağlar. Buna karşılık, yüksek enerji, çarpışma dissosiyasiyon yöntemi bu koşullar altında olduğu gibi kitle spektrometresi elektro-sprey iyonizasyon pozitif modu için amonyum formatmobil faz katkı ile birlikte kullanıldığında olumlu, MS-1 lipid iyon parçalanması nın MS-2 ürünlerine veriminin artırılmasını sağlar. Organik faz toplarken fazları karıştırmayın.Azot gazı akışı altında tüpleri kapatın. Ekleme içindeki herhangi bir kabarcık ortadan kaldırmak ve doğru yönde sütun bağlayın. Herhangi bir tepenin kimliği LC-MS ile belirlenemiyorsa, MS-NMR molekülün yapısını saptamak için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım<em&gt; Stafilokok aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Kantitatif Kütle Spektrometresi Analiz lipid Damlacık izolasyonu

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Hücre dışı Matrix Glycoproteomics: Kütle Spektrometresi kullanarak Sağlam GLİKOPEPTİT Analizi için Bir Yöntem

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Inositol fosfat veya Phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık Kromatografi Batı Blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Hedefsiz Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Tabanlı Metabolomik Buğday Tanesi Analizi

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...