Name: in vivo infection with leishmania amazonensis to evaluate parasite virulence in mice
Uploaded: 2020-02-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice at JoVE.com

我们要感谢圣保罗大学生物医学研究所动物中心的尼尔斯·奥尔森·萨拉伊瓦·塞马拉教授的支持和西尔维亚·雷尼·乌利亚纳教授提供玻璃组织研磨机。这项工作得到了圣保罗研究基金会（FAPESP - MFLS赠款2017/23933-3）的支持。

圣保罗大学生物科学研究所动物护理和使用委员会（CEUA 342/2019）核准了所有实验程序，并根据圣保罗州保护和使用实验室动物的建议和政策（Lei Estadual 11.977， de 25/08/2005）和巴西政府（莱联邦11.794，de 08/10/2008）。第 1-5 节中描述的所有步骤都应无菌地在层流柜内执行。在处理活的利什曼病寄生虫时，应使用个人防护设备。
1. 在体外分化L. 亚马孙普罗马斯蒂戈特到...

本议定书中描述的体内感染测定允许任何研究人员评估体内皮性利什曼病，考虑在系统场景中的宿主-寄生虫相互作用。这些测定方法已被许多组使用22，24，27，29，31，32，34，49，在这里我们编译了一个分步协议，以标准化这种方法，同时考虑一些组可能有的基础设施限制。...

利什曼病是全世界流行的寄生虫传染病，在发展中国家面临重大挑战，被世界卫生组织1、2号确认为最重要的被忽视的热带病之一。利什曼病的特点是皮面、黏膜和/或内脏表现。皮内利什曼病通常是由L.亚马逊西斯，L.墨西哥，L.巴西兰西斯，L.Guyensis，L.主要，L.热带和L.aethiopica3。这种形式的疾病往往是自我修复在人类由于诱导保护性细胞免疫反应。然而，细胞免疫反应可能失败，并且疾病可以进展到传播皮性利什曼病4，5。由于利什曼病物种和宿主遗传背景的多样性，没有可用的疫苗。治疗方案也有限，因为目前可用的大多数药物要么昂贵，有毒，要么可能需要长期治疗8，9。此外，有报告称，对现有的治疗方法有抗药性10，11。
利什曼病的病原体是原生动物寄生虫利什曼病。寄生虫在其生命周期中呈现两种截然不同的形态形式：在沙蝇中发现的鞭状体;在沙蝇中发现的鞭状体;和乳腺，在哺乳动物宿主巨噬细胞的寄生虫中发现细胞内形式12，13。尽管脊椎动物宿主的巨噬细胞具有防御机制，但阿马斯蒂戈特的入侵、生存和复制能力仍受到许多研究，研究14、15、16、17。因此，一些研究小组一直在描述体外巨噬细胞感染测定，以评估特定环境因素以及寄生虫和宿主基因对寄生虫感染性的影响。这种测定提供了几个优点，如能够适应高通量格式的研究，获得结果的时间相对较短，以及减少牺牲的实验室动物数量。然而，体外测定的发现是有限的，因为它们并不总是在体内研究14，19，20，21复制。体内检测为宿主-寄生虫相互作用提供了系统生理概述，外体测定不能完全模仿。例如，免疫学研究可以通过免疫组织化学测定从收集的足垫组织部分，甚至从波普利特淋巴结进行分析恢复的免疫细胞22。
动物在生物和生物医学研究中经常被用作人类疾病的模型，以更好地了解疾病的基本生理机制23。在利什曼病的情况下，接种的路线、地点或剂量影响疾病结果24，25，26，27。此外，人类和小鼠的易感性和抗药性受到宿主和寄生虫4、5、22、28、29、30、31的遗传背景的高度调节。BALB/c小鼠极易受到L.亚马逊斯皮感染，随着寄生虫传播到淋巴结、脾脏和肝脏32，疾病进展迅速。由于该疾病可能进展到皮质转移，感染可能是致命的。相比之下，C57BL/6小鼠在L.亚马逊感染测定33中经常出现慢性病变，具有持久性寄生虫负荷。因此，L. amazonensis感染这种特殊的小鼠物种一直被认为是研究人类长期形式皮性利什曼病的极佳模型，因为它比BALB/c小鼠感染模型5，34更好地模仿疾病进展。
因此，我们提出，体内的鼠虫感染是利什曼病毒性生理研究适用于人类疾病的有用方法，允许对宿主-寄生虫相互作用的系统看法。重温已建立的测定方法22，我们在此提出一个汇编的C57BL/6小鼠体内感染L.亚马逊酶的分步方案，其中包括寄生虫分化成轴状肌瘤、小鼠脚垫皮肤接种、病变发展以及寄生虫负荷测定。该协议可以适应其他小鼠菌株和利什曼病物种，导致皮性利什曼病。总之，这里介绍的方法对于确定新的抗利什曼病药物靶点和疫苗，以及对宿主免疫和代谢对利什马尼亚感染的生理研究至关重要。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner bio-ne</td>
			<td>655180</td>
			<td>A flat-bottom plate for limiting dilution assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8626</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caliper</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>700-118-20</td>
			<td>A caliper to measure the thickness of footpad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353014</td>
			<td>A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>An equipament used for separating samples based on its density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator 34 &#176;C</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td>An incubator for amastigotes differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K50237083820</td>
			<td>A disinfectant for general items</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass tissue grinder tube</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3431 E04</td>
			<td>A tube to collect and disrupt infected footpad tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Synth</td>
			<td>G1008.01.AH</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>A software used to plot the data and calculate statistical significance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-2250</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5303</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator 25 &#176;C</td>
			<td>Fanem</td>
			<td>347CD</td>
			<td>An incubator for promastigotes cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TMS</td>
			<td>An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>An inhalant anesthetics for mice (3-5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laminar flow cabinet</td>
			<td>Veco</td>
			<td>VLFS-09</td>
			<td>A biosafety cabinet used for aseptical work area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 cell culture media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31100-035</td>
			<td>A cell culture media for Leishmania cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td>A microtube used for sample collection, processing and storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichanel pipette</td>
			<td>Labsystems</td>
			<td>F61978</td>
			<td>A multichannel pipette used for limiting dilution assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6329</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>HBG</td>
			<td>2266</td>
			<td>A hemocytometer to count the parasite suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200</td>
			<td>An optical equipament used to count parasite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>349</td>
			<td>A flexible and resistant plastic to seal the plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>A sterile dish to dissect the footpad tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipetman kit</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167360</td>
			<td>A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Quimis</td>
			<td>BG2000</td>
			<td>An equipament used to weigh collected footpad lesions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>Solidor</td>
			<td>10237580026</td>
			<td>A scalpel to cut and collect footpad tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological pipette 10 mL</td>
			<td>Nest</td>
			<td>327001</td>
			<td>A sterile pipette used for transfering mililiter volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td></td>
			<td>A pipette tip used for transfering microliter volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>A dye used to count viable parasites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypticase peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305945</td>
			<td>A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo infection with leishmania amazonensis to evaluate parasite virulence in mice

利什曼病是原生动物寄生虫，导致利什曼病，疾病呈现从皮肤到内脏病变的各种临床表现。目前，全世界估计有1 200万人感染利什曼病，超过10亿人生活在感染风险之中。利什曼病在中美洲和南美洲流行，通常导致该疾病的皮状形式，可以直接在动物模型中可视化。因此，L. 亚马孙菌株是治疗皮性利什曼病研究的良好模型，因为它们也易于在体外培养。C57BL/6小鼠模仿人类观察到的L.亚马逊-亚马孙病驱动疾病进展，被认为是治疗皮性利什曼病的最佳小鼠菌株模型之一。在脊椎动物宿主中，这些寄生虫栖息于巨噬细胞中，尽管这些细胞具有防御机制。几项研究使用体外巨噬菌体感染测定法来评估不同条件下的寄生虫感染率。然而，体外方法仅限于一个孤立的细胞系统，它无视生物体的反应。在这里，我们编译了一种体内鼠感染方法，该方法提供了宿主-寄生虫相互作用的系统生理概述。C57BL/6小鼠体内感染L.亚马孙病的详细方案包括寄生虫分化成感染性乳腺、小鼠脚垫皮肤接种、病变发展以及寄生虫负荷测定。我们建议这种成熟的方法，作为生理研究宿主免疫和代谢反应对皮性利什曼病的最适当的方法。

利什曼原生动物寄生虫在无脊椎动物和脊椎动物宿主的生命周期中以两种发育形式存在：原生动物，在雌性沙蝇的流明中发现的增殖形式;和乳腺，在哺乳动物宿主细胞的寄生虫中发现的增殖形式。前列腺有一个长长的体，宽约1.5微米，长20微米，通常从前肢出现一个旗杆。Amastigots 的体形为圆形或卵形体，长度为 2-6 μm，宽度为 1.5-3 μm，并具有明显的旗杆<sup class="xr...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice at JoVE.com

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

在这里，我们提出了一个编译的协议，以评估小鼠与利什曼病的皮感染。这是研究寄生虫毒性的可靠方法，允许对脊椎动物宿主对感染的反应进行系统观察。

在 Vivo 感染利什曼病亚马孙病评估小鼠的寄生虫毒性

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...

该协议适合研究利什马尼亚毒性，因为它提供了脊椎动物宿主的皮皮感染的系统视图。采用此协议的主要优点是，它允许研究人员同时评估宿主炎症反应和寄生虫复制。此方法可用于描述与毒性相关的多个靶点和治疗，从而给皮肤利什曼病控制带来新的见解。它也可以适用于其他小鼠菌株和利什马尼亚物种，导致皮肤利什曼病。这种检测有一些关键步骤，例如要求训练有素的人员能够舒适地与小鼠合作，并具有进行亚植物注射的经验，以避免意外接触传染性物质。演示这个程序的将是里卡多·赞皮耶里博士，一个来自我实验室的技术员。首先在25厘米方的细胞培养瓶中种植L.amazonensis，含有10毫升的亲中基，在25摄氏度下生长三天。孵育后，移液器五毫升对数生长期原型培养成一个新的烧瓶。在烧瓶中加入5毫升的阿玛中型，并在34摄氏度下孵育3至4天。在一个新的烧瓶中，用新鲜的阿玛培养剂，以一比三的比例稀释培养文化。然后再孵育三到五天。将 PBS 中稀释的斧头协议悬浮液的等分转移到 Neubauer 腔室，并计算非旗杆寄生虫。然后，根据所需的接种剂量和预期接种数量稀释PBS中的悬浮液。用准备好的寄生虫悬浮液用 27 量针加载结核素注射器。确保小鼠用脚趾捏液完全麻醉，并在左后脚垫的亚植物组织中接种50微升悬浮液。记录病变的进度每周一次，通过使用卡钳测量受感染和非感染脚垫的厚度，并计算两个脚垫之间的厚度差异，以评估病变进展。每个病变在玻璃组织研磨管中加入一毫升的亲介质，并称重管。在脚垫上喷洒 70% 乙醇进行消毒，并切除动物的脚部，以提取受感染的脚垫。确保剪刀和钳子在70%乙醇中浸泡，确保它们灭菌。将脚垫放在无菌的培养皿中，用钳子和手术刀解剖。收集所有的软组织并丢弃骨头。将收集的组织转移到玻璃组织研磨管，然后再次称重管以确定病变重量。与研磨机一起使组织均质10次，使组织完全破坏，并允许混合物沉降。收集20微升的上一杯，并加载到96井板的第一列和第一车道，根据手稿指示准备。重复此步骤，为接下来的三条车道，使每个动物具有四倍的结果。使用多通道移液器将每一井均质化 10 次，并在第一柱将稀释样品的 20 微升转移到第二柱。继续串行稀释，直到到达最后一列，并丢弃稀释样品的最后 20 微升。用薄膜密封盘子，并在潮湿的室内在25摄氏度下孵育7天。孵育后，在倒置显微镜下分析板，确定每条巷道的最后一个含寄生虫的井。利什马尼亚原生动物寄生虫在无脊椎动物和脊椎动物宿主的生命周期中以两种发育形式存在：普罗巴斯特和海巴斯特。斧头条件可以模拟体外不同的宿主环境，保持寄生虫的形态和生存能力。与海脊动物的斧头条件模仿脊椎动物宿主的酸性环境和温度升高。在这些条件下，普罗马斯蒂戈特人将区分为合作伙伴。当转移到中性pH值并在25摄氏度下孵育时，斧头海巴动物会变回长廊。在受感染的小鼠脚垫上观察到野生型和利什马尼亚铁调节器1的毒性差异。LIR1调节利什马尼亚的细胞内铁含量，调节铁出口，防止其细胞内积累到有毒水平。包括肿胀和病变进展差异的感染分析显示，LIR1对体内的L.amazonensis至关重要。寄生虫负荷通过从受感染的病变进行限制稀释测定来确定。LIR1敲除感染小鼠的病变比野生型利什曼感染小鼠少10至6倍，表明LIR1的缺失可防止细胞内复制的亚巴斯特。执行此过程时，要记住的最重要的事情之一是使用体外传播不到十次的利什马尼亚培养物，以避免寄生虫毒性的丧失。除了这个程序，你可以使用体外感染分析。然而，这是一个有限的方法，因为它不提供宿主-寄生虫相互作用的系统生理概述。这种体内方法是评估皮肤利什曼病的全身反应的最佳方法，例如量化恢复宿主组织中血清生物标志物，以进行进一步的免疫学研究。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

在Live主机转利什曼原虫寄生虫在体内成像

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

科研

免疫与感染

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³HV68 Infection in Mice

γHV68感染小鼠的测量

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

使用人工痰介质测试抗生素药效试验<em&gt;绿脓杆菌</em&gt;更多相关的肺囊肿性纤维化的条件

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Antileishmanial筛选对细胞内的寄生虫救援和转化实验<em&gt;杜氏利什曼原虫</em无鞭毛体在THP1人急性单核细胞白血病细胞株

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

口咽部气管内PAMP管理和支气管肺泡灌洗的利用率来评估小鼠宿主的免疫反应

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

施加诱导表达系统研究与细胞内信号细菌毒力因子的干扰

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

中性粒细胞分离和分析，以确定他们的淋巴瘤细胞的敏感性对治疗药物的作用

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

巨噬细胞内细胞内生长的定量化是评价利什曼原虫寄生虫毒力的快速可靠方法

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

线虫模型中气单胞菌感染的毒力及发病机制评价

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

精确的大脑映射，在小鼠中执行神经-免疫动力学的重复体内振动成像

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...