Name: in vivo infection with leishmania amazonensis to evaluate parasite virulence in mice
Uploaded: 2020-02-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice at JoVE.com

Nous tenons à remercier le Professeur Niels Olsen Saraiva Câmara du Centre des Animaux de l’Institut des Sciences Biomédicales de l’Université de Sao Paulo pour son soutien et le Prof. Dr. Silvia Reni Uliana pour la fourniture du broyeur de tissu en verre. Ce travail a été soutenu par la Sao Paulo Research Foundation (FAPESP - subvention 2017/23933-3 du MFLS).

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’Institut de bioscience de l’Université de Sao Paulo (CEUA 342/2019), et ont été menées conformément aux recommandations et aux politiques relatives à l’entretien et à l’utilisation des animaux de laboratoire de l’État de Sao Paulo (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) et le gouvernement brésilien (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Toutes les étapes décrites dans les sections 1...

L’analyse in vivo de l’infection décrite dans ce protocole permet à n’importe quel chercheur d’évaluer la leishmaniose cutanée in vivo compte tenu de l’interaction hôte-parasite dans un scénario systémique. Ces essais ont été utilisés par de nombreux groupes22,24,27,29,31,32,34...

Les leishmanimes sont des maladies infectieuses parasitaires répandues dans le monde entier représentant des défis importants dans les pays en développement et sont reconnues comme l’une des maladies tropicales négligées les plus importantes par l’Organisation mondiale de la Santé1,2. Les leishmaniose sont caractérisées par des manifestations cutanées, muqueuses et/ou viscérales. La leishmaniose cutanée est habituellement causée par L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica et L. aethiopica3. Cette forme de la maladie est souvent auto-guérison chez l’homme en raison de l’induction de la réponse immunitaire cellulaire protectrice. Cependant, la réponse immunitaire cellulaire peut échouer, et la maladie peut progresser à la leishmaniose cutanée disséminée4,5. Il n’existe pas de vaccin disponible en raison de la diversité entre les espèces leishmanimanieuses et les milieux génétiques hôtes6,7. Les options de traitement sont également limitées car la plupart des médicaments actuellement disponibles sont soit coûteux, toxiques, et / ou peuvent nécessiter un traitement à long terme8,9. En outre, il ya eu des rapports de résistance aux médicaments contre les traitements disponibles10,11.
L’agent causal des leishmanians est le parasite protozoaire Leishmania. Le parasite présente deux formes morphologiques distinctes dans son cycle de vie : les promastigotes, la forme flagellée trouvée dans les phandres ; et amastigotes, la forme intracellulaire trouvée dans les vacuoles parasitophores des macrophages d’hôte de mammifères12,13. La capacité des amastigotes d’envahir, de survivre et de se répliquer malgré les mécanismes de défense des macrophages de l’hôte vertébré est sujette à de nombreuses études14,15,16,17. Par conséquent, plusieurs groupes de recherche ont décrit des essais d’infection in vitro de macrophage pour évaluer l’impact des facteurs environnementaux spécifiques, aussi bien que des gènes parasites et d’hôte sur l’infectiosité parasite. Cet analyse présente plusieurs avantages, tels que la capacité d’adapter les études à un format de débit élevé, une période de temps relativement plus courte pour obtenir des résultats, et une réduction du nombre d’animaux de laboratoire sacrifiés18. Cependant, les résultats des essais in vitro sont limités parce qu’ils ne reproduisent pas toujours les études in vivo14,19,20,21. Les essais in vivo fournissent un aperçu physiologique systémique de l’interaction hôte-parasite, qui ne peut pas être entièrement imité par des essais in vitro. Par exemple, les études immunologiques peuvent être exécutées par des essais immunohistochimiques des sections rassemblées de tissu de pied ou même des ganglions lymphatiques popliteal pour l’analyse des cellules immunitaires récupérées22.
Les animaux sont souvent utilisés comme modèle pour les maladies humaines dans la recherche biologique et biomédicale pour mieux comprendre les mécanismes physiologiques sous-jacents des maladies23. Dans le cas de la leishmaniose, l’itinéraire, le site, ou la dose d’inoculation influencent les résultats de la maladie24,25,26,27. En outre, la susceptibilité et la résistance à l’infection chez l’homme et les souris sont fortement réglementées par les antécédents génétiques de l’hôte et le parasite4,5,22,28,29,30,31. Les souris BALB/c sont très sensibles à l’infection cutanée de L. amazonensis, montrant une progression rapide de la maladie avec la dissémination des parasites aux ganglions lymphatiques, à la rate et au foie32. Comme la maladie peut progresser vers des métastases cutanées, l’infection peut être mortelle. En revanche, les souris C57BL/6 développent souvent des lésions chroniques avec des charges parasites persistantes dans les essais d’infection de L. amazonensis 33. Par conséquent, l’infection à L. amazonensis avec cette espèce particulière de souris a été considérée comme un excellent modèle pour étudier les formes chroniques de leishmaniose cutanée chez l’homme, parce qu’elle imite la progression de la maladie mieux que le modèle d’infection de souris BALB/c5,34.
Par conséquent, nous proposons que l’infection in vivo de murine soit une méthode utile pour des études physiologiques de virulence de Leishmania applicables à la maladie humaine, permettant une vue systémique de l’interaction hôte-parasite. Revisiter les essais bien établis22, nous présentons ici un protocole compilé étape par étape de l’infection in vivo des souris C57BL/6 avec L. amazonensis qui comprend la différenciation parasite en amastigotes hachenique, souris footpad inoculation cutanée, développement de lésions, et la détermination de la charge parasite. Ce protocole peut être adapté à d’autres souches de souris et aux espèces de Leishmania qui causent des leishmanimes cutanés. En conclusion, la méthode présentée ici est cruciale pour identifier de nouvelles cibles de médicamentsanti-Leishmania et des vaccins, ainsi que dans les études physiologiques des réponses immunitaires et métaboliques de l’hôte à l’infection à Leishmania.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner bio-ne</td>
			<td>655180</td>
			<td>A flat-bottom plate for limiting dilution assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8626</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caliper</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>700-118-20</td>
			<td>A caliper to measure the thickness of footpad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353014</td>
			<td>A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>An equipament used for separating samples based on its density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator 34 &#176;C</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td>An incubator for amastigotes differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K50237083820</td>
			<td>A disinfectant for general items</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass tissue grinder tube</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3431 E04</td>
			<td>A tube to collect and disrupt infected footpad tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Synth</td>
			<td>G1008.01.AH</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>A software used to plot the data and calculate statistical significance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-2250</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5303</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator 25 &#176;C</td>
			<td>Fanem</td>
			<td>347CD</td>
			<td>An incubator for promastigotes cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TMS</td>
			<td>An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>An inhalant anesthetics for mice (3-5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laminar flow cabinet</td>
			<td>Veco</td>
			<td>VLFS-09</td>
			<td>A biosafety cabinet used for aseptical work area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 cell culture media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31100-035</td>
			<td>A cell culture media for Leishmania cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td>A microtube used for sample collection, processing and storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichanel pipette</td>
			<td>Labsystems</td>
			<td>F61978</td>
			<td>A multichannel pipette used for limiting dilution assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6329</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>HBG</td>
			<td>2266</td>
			<td>A hemocytometer to count the parasite suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200</td>
			<td>An optical equipament used to count parasite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>349</td>
			<td>A flexible and resistant plastic to seal the plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>A sterile dish to dissect the footpad tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipetman kit</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167360</td>
			<td>A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Quimis</td>
			<td>BG2000</td>
			<td>An equipament used to weigh collected footpad lesions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>Solidor</td>
			<td>10237580026</td>
			<td>A scalpel to cut and collect footpad tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological pipette 10 mL</td>
			<td>Nest</td>
			<td>327001</td>
			<td>A sterile pipette used for transfering mililiter volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td></td>
			<td>A pipette tip used for transfering microliter volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>A dye used to count viable parasites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypticase peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305945</td>
			<td>A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo infection with leishmania amazonensis to evaluate parasite virulence in mice

Leishmania spp. sont des parasites protozoaires qui causent des leishmaniose, maladies qui présentent un large éventail de manifestations cliniques des lésions cutanées aux lésions viscérales. Actuellement, on estime que 12 millions de personnes sont infectées par le Leishmania dans le monde et plus d’un milliard de personnes vivent à risque d’infection. L’amazonense de Leishmania est endémique en Amérique centrale et du Sud et mène habituellement à la forme cutanée de la maladie, qui peut être visualisée directement dans un modèle animal. Par conséquent, les souches de L. amazonensis sont de bons modèles pour les études de leishmaniose cutanée parce qu’elles sont également facilement cultivées in vitro. Les souris C57BL/6 imitent la progression de la maladie entraînée par L. amazonensisobservée chez l’homme et sont considérées comme l’un des meilleurs modèles de souches de souris pour la leishmaniose cutanée. Chez l’hôte vertébré, ces parasites habitent les macrophages malgré les mécanismes de défense de ces cellules. Plusieurs études utilisent des tests d’infection à macrophage in vitro pour évaluer l’infectiosité du parasite dans différentes conditions. Cependant, l’approche in vitro se limite à un système cellulaire isolé qui ne tient pas compte de la réponse de l’organisme. Ici, nous compilons une méthode in vivo d’infection de murine qui fournit un aperçu physiologique systémique de l’interaction hôte-parasite. Le protocole détaillé pour l’infection in vivo des souris de C57BL/6 avec L. amazonensis comprend la différenciation de parasite en amastigotes infectieux, l’inoculation cutanée de pied de souris, le développement de lésion, et la détermination de charge de parasite. Nous proposons cette méthode bien établie comme méthode la plus adéquate pour des études physiologiques des réponses immunitaires et métaboliques d’hôte à la leishmaniose cutanée.

Les parasites protozoaires de leishmaniose existent sous deux formes développementales au cours de leur cycle de vie chez les hôtes invertébrés et vertébrés : les promastigotes, les formes proliérantes trouvées dans le lumen de la mouche de sable femelle ; et amastigotes, les formes proliérantes trouvées dans les vacuoles parasitophores des cellules hôtes mammifères. Les promastigotes ont un corps allongé d’environ 1,5 m de large et 20 m de long, avec un dalle éme...

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In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Ici, nous présentons un protocole compilé pour évaluer l’infection cutanée des souris avec l’amazonensis de Leishmania. Il s’agit d’une méthode fiable pour étudier la virulence parasite, permettant une vue systémique de la réponse de l’hôte vertébré à l’infection.

Infection in vivo avec l’amazonense de Leishmania pour évaluer la virulence parasite chez les souris

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...

Ce protocole est approprié pour étudier la virulence de Leishmania, parce qu’il fournit une vue systémique de l’hôte vertébré à l’infection cutanée. Le principal avantage de l’adoption de ce protocole est qu’il permet aux chercheurs d’évaluer simultanément la réponse inflammatoire de l’hôte et la réplication des parasites. Cette méthode peut être utilisée pour caractériser plusieurs cibles et traitements liés à la virulence, ce qui pourrait apporter de nouvelles perspectives dans le contrôle cutané de la leishmaniose.Il peut également être appliqué à d’autres souches de souris et aux espèces de Leishmania qui causent la leishmaniose cutanée. Cet essai a quelques étapes critiques, telles que exiger le personnel formé qui sont confortables travaillant avec des souris et ont l’expérience en exécutant des injections sous-plantaires pour éviter l’exposition accidentelle au matériel infectieux. Le Dr Ricardo Zampieri, technicien de mon laboratoire, démontrera la procédure.Commencez par cultiver des promastigotes L.amazonensis dans un flacon de culture cellulaire carrée de 25 centimètres, contenant 10 millilitres de pro-moyen, pendant trois jours à 25 degrés Celsius. Après l’incubation, pipette cinq millilitres de la phase de croissance logarithmique promastigote culture dans un nouveau flacon. Ajouter cinq millilitres d’ama-moyen au flacon et l’incuber à 34 degrés Celsius pendant trois à quatre jours.Divisez la culture en la diluant à un rapport de un à trois avec l’ama-medium frais dans un nouveau flacon. Puis l’incuber pendant encore trois à cinq jours. Transférer un aliquot de la suspension axenique amastigotes diluée dans PBS à une chambre Neubauer et compter les parasites non flagellés.Ensuite, diluer la suspension dans PBS en fonction de la dose d’inoculum désirée et le nombre d’inoculums prévus. Chargez une seringue de tuberculine avec une aiguille de calibre 27 avec la suspension parasite préparée. Assurez-vous que la souris est entièrement anesthésiée avec une pincée d’un pied et inoculer 50 microlitres de la suspension dans le tissu subplantaire sur le pied arrière gauche.Enregistrez la progression de la lésion une fois par semaine, en mesurant l’épaisseur des pieds infectés et non infectés à l’aide d’un étrier, et calculez la différence d’épaisseur entre les deux pieds pour évaluer la progression des lésions. Ajouter un millilitre de pro-moyen dans un tube de broyeur de tissu en verre par lésion et peser le tube. Vaporiser 70% d’éthanol sur le pavé pour la désinfection et exciser le pied de l’animal à son talon pour extraire le pavé infecté.Assurez-vous que les ciseaux et les forceps sont stérilisés en les gardant trempés dans 70 % d’éthanol. Placez le pavé dans une boîte de Pétri stérile et disséquez-le avec les forceps et le scalpel. Recueillir tous les tissus mous et jeter les os.Transférer les tissus recueillis dans le tube de broyeur de tissu de verre et peser le tube à nouveau pour déterminer le poids de lésion. Homogénéiser le tissu 10 fois avec le broyeur pour une perturbation complète des tissus, et permettre au mélange de se peupler. Recueillir 20 microlitres du surnatant et le charger dans la première colonne et la première voie de la plaque de puits 96, préparé selon les instructions manuscrites.Répétez cette étape pour que les trois prochaines voies aient des résultats quadruplicate pour chaque animal. Homogénéisez chaque puits 10 fois à l’aide d’une pipette multicanal et transférez 20 microlitres de l’échantillon dilué de la première à la deuxième colonne. Continuez la dilution en série jusqu’à ce que la dernière colonne soit atteinte, et jetez les 20 derniers microlitres de l’échantillon dilué.Sceller la plaque avec du film et l’incuber à 25 degrés Celsius pendant sept jours dans une chambre humide. Après l’incubation, analyser la plaque au microscope inversé pour déterminer le dernier puits contenant des parasites pour chaque voie. Les parasites protozoaires de Leishmania existent sous deux formes développementales au cours de leur cycle de vie chez les hôtes invertébrés et vertébrés : les promastigotes et les amastigotes.Les conditions axeniques peuvent simuler différents environnements hôtes in vitro, en maintenant la morphologie et la viabilité des parasites. Les conditions axeniques des amastigotes imitent l’environnement acide et l’augmentation de la température des hôtes vertébrés. Les promastigotes se différencieront en amastigotes dans ces conditions.Lorsqu’ils sont transférés au pH neutre et incubés à 25 degrés Celsius, les amastigotes axeniques se transforment en promastigotes. La différence de virulence du type sauvage et des souches de KO leishmania Iron Regulator 1 a été observée sur les tapis de souris infectés. LIR1 régule les niveaux intracellulaires de fer en Leishmania, en médiatiser l’exportation de fer et en empêchant son accumulation intracellulaire à des niveaux toxiques.L’analyse d’infection qui inclut la différence dans la progression de gonflement et de lésion a indiqué que LIR1 est essentiel pour L.amazonensis in vivo virulence. La charge parasite a été déterminée en effectuant un essai limitant de dilution des lésions infectées. Les lésions des souris infectées par KO LIR1 contiennent 10 à six fois moins de parasites que ceux des souris infectées par le type sauvage Leishmania, révélant que l’absence de LIR1 empêche la réplication intracellulaire des amastigotes.Une des choses les plus importantes à retenir lorsque vous effectuez cette procédure est d’utiliser les cultures Leishmania qui ont été transmis in vitro moins de dix fois pour éviter la perte de virulence parasite. En plus de cette procédure, vous pouvez utiliser des analyses d’infection in vitro. Cependant, il s’agit d’une méthode limitée, car elle ne fournit pas une vue d’ensemble physiologique systémique de l’interaction hôte-parasite.Cette méthode in vivo est la meilleure approche pour évaluer les réponses systémiques pour la leishmaniose cutanée, telles que la quantification des biomarqueurs sériques dans les tissus hôtes récupérés pour d’autres études immunologiques.

Research

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