Name: in vivo infection with leishmania amazonensis to evaluate parasite virulence in mice
Uploaded: 2020-02-20T13:00:00
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Ringraziamo la prof.ssa Niels Olsen Saraiva Camara dell'Animal Center dell'Istituto di Scienze Biomediche dell'Università di San Paolo per il supporto e la prof.ssa Silvia Reni Uliana per aver fornito il macinino di tessuto di vetro. Questo lavoro è stato sostenuto da Sao Paulo Research Foundation (FAPESP - sovvenzione 2017/23933-3).

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dall'Animal Care and Use Committee presso l'Istituto di Bioscienze dell'Università di San Paolo (CEUA 342/2019) e sono state condotte in conformità con le raccomandazioni e le politiche per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dello Stato di San Paolo (Lei Estadual 11.977, 25/08/2005) e il governo brasiliano (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Tutti i passaggi descritti nelle sezioni da 1 a 5 devono essere eseguiti apartire aquanto in armadi a flusso laminar...

L'analisi dell'infezione in vivo descritta in questo protocollo consente a qualsiasi ricercatore di valutare la leishmaniosi cutanea in vivo considerando l'interazione ospite-parassita in uno scenario sistemico. Questi saggi sono stati utilizzati da molti gruppi22,24,27,29,31,32,34,</su...

Le leishmaniosi sono malattie infettive parassitarie prevalenti in tutto il mondo che rappresentano importanti sfide nei paesi in via di sviluppo e sono riconosciute come una delle più importanti malattie tropicali trascurate dall'Organizzazione Mondiale della Sanità1,2. Le leishmaniasi sono caratterizzate da manifestazioni cutanee, mucose e/o viscerali. Cutaneous leishmaniosi è di solito causata da L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica e L. aethiopica3. Questa forma della malattia è spesso auto-guarigione negli esseri umani a causa dell'induzione della risposta immunitaria cellulare protettiva. Tuttavia, la risposta immunitaria cellulare può fallire e la malattia può progredire nella diffusione della leishmaniosi cutanea diffusa4,5. Non esiste un vaccino disponibile a causa della diversità tra le specie di Leishmania e ospitare le provenienze genetiche6,7. Le opzioni di trattamento sono anche limitate in quanto la maggior parte dei farmaci attualmente disponibili sono costosi, tossici e/o possono richiedere un trattamento a lungo termine8,9. Inoltre, ci sono state segnalazioni di resistenza ai farmaci contro i trattamenti disponibili10,11.
L'agente causale delle leishmaniosi è il parassita protozoo Leishmania. Il parassita presenta due forme morfologiche distinte nel suo ciclo di vita: i promastigoti, la forma flagellata trovata nelle libellule; e amastigoti, la forma intracellulare trovata nei vacuoli parassitoforo dei macrofagi ospiti dei mammiferi12,13. La capacità degli amastigoti di invadere, sopravvivere e replicarsi nonostante i meccanismi di difesa dei macrofagi dell'ospite vertebrato sono soggette a molti studi14,15,16,17. Di conseguenza, diversi gruppi di ricerca hanno descritto i saggi di infezione da macrofagio in vitro per valutare l'impatto di specifici fattori ambientali, nonché i geni parassiti e ospiti sull'infettività dei parassiti. Questo test presenta diversi vantaggi, come la capacità di adattare gli studi a un formato ad alta produttività, un periodo di tempo relativamente più breve per ottenere risultati e un numero ridotto di animali da laboratorio sacrificati18. Tuttavia, i risultati dei test in vitro sono limitati perché non sempre replicano studi in vivo14,19,20,21. I saggi in vivo forniscono una panoramica fisiologica sistemica dell'interazione ospite-parassita, che non può essere completamente imitata da analisi in vitro. Ad esempio, gli studi immunologici possono essere eseguiti attraverso saggi immunohistochimici da sezioni di tessuto del piede raccolte o anche da linfonodi poplylitali per l'analisi delle cellule immunitarie recuperate22.
Gli animali sono spesso utilizzati come modello per le malattie umane nella ricerca biologica e biomedica per comprendere meglio i meccanismi fisiologici sottostanti delle malattie23. Nel caso della leishmaniosi, il percorso, il sito o la dose di inoculazione influenzano l'esito della malattia24,25,26,27. Inoltre, la suscettibilità e la resistenza all'infezione nell'uomo e nei topi sono altamente regolate dagli sfondi genetici dell'ospite e del parassita4,5,22,28,29,30,31. I topi BALB/c sono altamente sensibili all'infezione cutanea di L. amazonensis, mostrando una rapida progressione della malattia con la diffusione dei parassiti ai linfonodi, alla milza e al fegato32. Poiché la malattia può progredire verso metastasi cutanee, l'infezione può essere fatale. Al contrario, i topi C57BL/6 spesso sviluppano lesioni croniche con carichi di parassiti persistenti nei saggi dell'infezione da L. amazonensis 33. Di conseguenza, l'infezione da L. amazonensis con questa particolare specie di topi è stata considerata un ottimo modello per studiare le forme croniche di leishmaniosi cutanea negli esseri umani, perché imita la progressione della malattia meglio del modellodiinfezione dei topi BALB/c 5,34.
Quindi, proponiamo che l'infezione murina in vivo sia un metodo utile per gli studi fisiologici della virulenza Leishmania applicabili alla malattia umana, consentendo una visione sistemica dell'interazione ospite-parassita. Rivisitando i saggi consolidati22, presentiamo qui un protocollo graduale compilato dell'infezione in vivo di topi C57BL/6 con L. amazonensis che comprende la differenziazione del parassita in amastigoti assici, topi pedana cutanea inoculazione, sviluppo delle lesioni, determinazione del carico di parassiti. Questo protocollo può essere adattato ad altri ceppi di topi e specie di Leishmania che causano leishmanie cutanee. In conclusione, il metodo qui presentato è fondamentale per identificare nuovi bersagli e vaccinianti-Leishmania, nonché negli studi fisiologici delle risposte immunitarie e metaboliche dell'ospite all'infezione da Leishmania.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner bio-ne</td>
			<td>655180</td>
			<td>A flat-bottom plate for limiting dilution assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8626</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caliper</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>700-118-20</td>
			<td>A caliper to measure the thickness of footpad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353014</td>
			<td>A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>An equipament used for separating samples based on its density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator 34 &#176;C</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td>An incubator for amastigotes differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K50237083820</td>
			<td>A disinfectant for general items</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass tissue grinder tube</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3431 E04</td>
			<td>A tube to collect and disrupt infected footpad tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Synth</td>
			<td>G1008.01.AH</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>A software used to plot the data and calculate statistical significance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-2250</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5303</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator 25 &#176;C</td>
			<td>Fanem</td>
			<td>347CD</td>
			<td>An incubator for promastigotes cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TMS</td>
			<td>An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>An inhalant anesthetics for mice (3-5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laminar flow cabinet</td>
			<td>Veco</td>
			<td>VLFS-09</td>
			<td>A biosafety cabinet used for aseptical work area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 cell culture media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31100-035</td>
			<td>A cell culture media for Leishmania cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td>A microtube used for sample collection, processing and storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichanel pipette</td>
			<td>Labsystems</td>
			<td>F61978</td>
			<td>A multichannel pipette used for limiting dilution assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6329</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>HBG</td>
			<td>2266</td>
			<td>A hemocytometer to count the parasite suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200</td>
			<td>An optical equipament used to count parasite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>349</td>
			<td>A flexible and resistant plastic to seal the plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>A sterile dish to dissect the footpad tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipetman kit</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167360</td>
			<td>A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Quimis</td>
			<td>BG2000</td>
			<td>An equipament used to weigh collected footpad lesions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>Solidor</td>
			<td>10237580026</td>
			<td>A scalpel to cut and collect footpad tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological pipette 10 mL</td>
			<td>Nest</td>
			<td>327001</td>
			<td>A sterile pipette used for transfering mililiter volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td></td>
			<td>A pipette tip used for transfering microliter volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>A dye used to count viable parasites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypticase peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305945</td>
			<td>A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo infection with leishmania amazonensis to evaluate parasite virulence in mice

Leishmania spp. sono parassiti protozoi che causano leishmaniosi, malattie che presentano un ampio spettro di manifestazioni cliniche da lesioni cutanee a lesioni viscerali. Attualmente, si stima che 12 milioni di persone siano infettate dalla Leishmania in tutto il mondo e oltre 1 miliardo di persone viva a rischio di infezione. La leishmania amazonensis è endemica in America centrale e meridionale e di solito porta alla forma cutanea della malattia, che può essere visualizzata direttamente in un modello animale. Pertanto, i ceppi di L. amazonensis sono buoni modelli per gli studi di leishmaniosi cutanea perché sono anche facilmente coltivati in vitro. I topi C57BL/6 imitano la progressione della malattia guidata da L. amazonensisosservata nell'uomo e sono considerati uno dei migliori modelli di ceppi di topi per la leishmaniosi cutanea. Nell'ospite dei vertebrati, questi parassiti abitano i macrofagi nonostante i meccanismi di difesa di queste cellule. Diversi studi utilizzano saggi di infezione da macrofagio in vitro per valutare l'infettività del parassita in diverse condizioni. Tuttavia, l'approccio in vitro è limitato a un sistema cellulare isolato che ignora la risposta dell'organismo. Qui, compiliamo un metodo di infezione murina in vivo che fornisce una panoramica fisiologica sistemica dell'interazione ospite-parassita. Il protocollo dettagliato per l'infezione in vivo di topi C57BL/6 con L. amazonensis comprende la differenziazione dei parassiti in amastigoti infettivi, intorpidimento cutaneo dei topi, sviluppo della lesione e determinazione del carico di parassiti. Proponiamo questo metodo consolidato come il metodo più adeguato per gli studi fisiologici delle risposte immunitarie e metaboliche dell'ospite alla leishmaniosi cutanea.

I parassiti della Leishmania protozoi esistono in due forme di sviluppo durante il loro ciclo di vita invertebrati e ospiti di vertebrati: promastigoti, le forme proliferanti che si trovano nel lume della landanella femmina; e amastigoti, le forme proliferanti che si trovano nei vacuoli parassofosi delle cellule ospiti dei mammiferi. I promastigoti hanno un corpo allungato di circa 1,5 m di larghezza e di 20 m di larghezza, con un flagello che emerge tipicamente dall'estremità a...

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In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Qui, presentiamo un protocollo compilato per valutare l'infezione cutanea dei topi con Leishmania amazonensis. Questo è un metodo affidabile per studiare la virulenza dei parassiti, consentendo una visione sistemica della risposta dell'ospite vertebrato all'infezione.

Infezione in vivo con Leishmania amazonensis per valutare la virulenza dei parassiti nei topi

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...

Questo protocollo è adatto per studiare la virulenza di Leishmania, perché fornisce una visione sistemica dell'ospite vertebrato all'infezione cutanea. Il vantaggio principale dell'adozione di questo protocollo è che consente ai ricercatori di valutare contemporaneamente la risposta infiammatoria dell'ospite e la replicazione dei parassiti. Questo metodo può essere utilizzato per caratterizzare diversi bersagli e trattamenti relativi alla virulenza, che potrebbero portare nuove intuizioni nel controllo della leishmaniosi cutanea.Può anche essere applicato ad altri ceppi di topi e specie di Leishmania che causano la leishmaniosi cutanea. Questo test ha alcuni passaggi critici, come richiedere personale addestrato che si confortevole a lavorare con i topi e ha esperienza nell'esecuzione di iniezioni subplantarie per evitare l'esposizione accidentale a materiale infettivo. A dimostrare la procedura sarà il Dottor Ricardo Zampieri, tecnico del mio laboratorio.Inizia coltivando promastigoti L.amazonensis in un matraccio di coltura cellulare quadrata di 25 centimetri, contenente 10 millilitri di pro-medium, per tre giorni a 25 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, pipettare cinque millilitri di coltura promastigote in fase di crescita logaritmica in un nuovo pallone. Aggiungere cinque millilitri di ama-medium al pallone e incubarlo a 34 gradi Celsius per tre o quattro giorni.Dividi la cultura diluerla con un rapporto da uno a tre con ama-medium fresco in un nuovo pallone. Quindi incubarlo per altri tre o cinque giorni. Trasferire un'aliquota della sospensione axenica degli amastigoti diluita in PBS in una camera Neubauer e contare i parassiti non flagellati.Quindi, diluire la sospensione in PBS in base alla dose di inoculo desiderata e al numero di inoculi previsti. Caricare una siringa tubercocina con un ago calibro 27 con la sospensione del parassita preparata. Assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato con un dito del piede e inoculare 50 microlitri della sospensione nel tessuto subplantare sul piede posteriore sinistro.Registrare la progressione della lesione una volta alla settimana, misurando lo spessore dei pedvi infetti e non infetti utilizzando una pinza, e calcolare la differenza di spessore tra i due footpad per valutare la progressione della lesione. Aggiungere un millilitro di pro-medium in un tubo di smerigliatrice di tessuto di vetro per lesione e pesare il tubo. Spruzzare il 70% di etanolo sul pedane per la disinfezione e asportare il piede dell'animale sul tallone per estrarre il pedane infetto.Assicurarsi che le forbici e le forcep siano sterilizzate mantenendole imbevute di 70% di etanolo. Posizionare il footpad in una piastra di Petri sterile e sezionarlo con le forcep e il bisturi. Raccogliere tutti i tessuti molli e scartare le ossa.Trasferire i tessuti raccolti nel tubo di smerigliatrice del tessuto di vetro e pesare nuovamente il tubo per determinare il peso della lesione. Omogeneizzare il tessuto 10 volte con la smerigliatrice per una completa interruzione dei tessuti e lasciare che la miscela si insolli. Raccogli 20 microlitri del supernatante e caricalo nella prima colonna e nella prima corsia della piastra del pozzo 96, preparata secondo le indicazioni manoscritte.Ripetere questo passaggio per le tre corsie successivi per quadruplicare i risultati per ogni animale. Omogeneizzare ogni pozzo 10 volte utilizzando una pipetta multicanale e trasferire 20 microlitri del campione diluito dalla prima alla seconda colonna. Continuare la diluizione seriale fino al raggiunto dell'ultima colonna e scartare gli ultimi 20 microlitri del campione diluito.Sigillare il piatto con pellicola e incubarlo a 25 gradi Celsius per sette giorni in una camera umida. Dopo l'incubazione, analizzare la piastra al microscopio invertito per determinare l'ultimo pozzo contenente parassiti per ogni corsia. I parassiti protozoici di Leishmania esistono in due forme di sviluppo durante il loro ciclo vitale in ospiti invertebrati e vertebrati:promastigoti e amastigoti.Le condizioni axeniche possono simulare diversi ambienti ospiti in vitro, mantenendo la morfologia e la vitalità dei parassiti. Le condizioni axeniche per gli amastigoti imitano l'ambiente acido e l'aumento della temperatura degli ospiti dei vertebrati. I promastigoti si distingueranno in amastigoti in queste condizioni.Quando vengono trasferiti in pH neutro e incubati a 25 gradi Celsius, gli amastigoti axenici si trasformano di nuovo in promastigoti. La differenza di virulenza dei ceppi knockout di tipo selvaggio e Leishmania Iron Regulator 1 è stata osservata sui pedani del mouse infetti. LIR1 regola i livelli di ferro intracellulare in Leishmania, mediando l'esportazione di ferro e prevenendone l'accumulo intracellulare a livelli tossici.Il saggio di infezione che include la differenza nella progressione del gonfiore e della lesione ha rivelato che LIR1 è essenziale per la virulenza in vivo di L.amazonensis. Il carico parassita è stato determinato eseguendo un saggio di diluizione limitante dalle lesioni infette. Le lesioni dei topi infetti knockout LIR1 contengono da 10 a sei volte meno parassiti di quelli dei topi infetti da Leishmania di tipo selvatico, rivelando che l'assenza di LIR1 impedisce la replicazione intracellulare degli amastigoti.Una delle cose più importanti da ricordare quando si esegue questa procedura è usare colture di Leishmania che sono state passageate in vitro meno di dieci volte per evitare la perdita di virulenza parassitaria. Oltre a questa procedura, è possibile utilizzare saggi di infezione in vitro. Tuttavia, questo è un metodo limitato, perché non fornisce una panoramica fisiologica sistemica dell'interazione ospite-parassita.Questo metodo in vivo è l'approccio migliore per valutare le risposte sistemiche per la leishmaniosi cutanea, come quantificare i biomarcatori sieri nei tessuti ospiti recuperati per ulteriori studi immunologici.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

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