Name: in vivo infection with leishmania amazonensis to evaluate parasite virulence in mice
Uploaded: 2020-02-20T13:00:00
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サンパウロ大学生物医学研究所動物センターのニールセン・サライヴァ・カマラ教授の皆様の支援、ガラス組織グラインダーの提供に対するシルビア・レニ・ウリアナ教授に感謝申し上げます。この研究はサンパウロ研究財団(FAPESP - MFLSの助成金2017/23933-3)によって支援されました。

すべての実験手順は、サンパウロ大学生物科学研究所の動物ケアと使用委員会によって承認され(CEUA 342/2019)、サンパウロ州の実験動物のケアと使用に関する勧告と方針に従って実施されました(Lei Estadual 11.977、 de 25/08/2005)とブラジル政府(レイ連邦11.794、de 08/10/2008)。セクション1-5に記載されているすべてのステップは、層流キャビネット内で無菌的に行われるべきである。リーシュマニア<...

このプロトコルで説明されているin vivo感染アッセイは、全身的なシナリオにおける宿主寄生虫相互作用を考慮して、すべての研究者が生体内での皮状リーシュマニア症を評価することを可能にする。これらのアッセイは、多くのグループ22、24、27、29、31、32、34、49で使用されており、ここではいくつかのグループが持つかもしれないインフラストラクチャの制限を考慮し?...

リーシュマニア症は、発展途上国で重要な課題を表す世界的に流行している寄生虫感染症であり、世界保健機関1、2によって最も重要な放置熱帯病の一つとして認識されています。リーシュマニア症は、皮、粘膜、および/または内臓症状によって特徴付けられる。通常、L. アマゾネンシスによって引き起こされます, L. メキシカーナ, L. ブラジル人, L. ガイアナシス, L. メジャー, L. 熱帯と L. aethiopica3.この疾患の形態は、保護細胞性免疫応答の誘導によるヒトにおける自己治癒性が高い。しかし、細胞性免疫応答が失敗する可能性があり、病気は広がった皮状リーシュマニア症4、5に進行する可能性がある。リーシュマニア種とホスト遺伝的背景の間の多様性に利用可能なワクチンはありません6,7.現在入手可能な薬物のほとんどが高価で有毒であり、および/または長期治療8、9を必要とすることができるので、治療の選択肢も制限されている。その上、利用可能な治療10、11に対する薬剤耐性の報告があった。
リーシュマニア症の原因物質は原虫寄生虫リーシュマニアである。寄生虫は、そのライフサイクルに2つの異なる形態を提示する:プロマスティゴテ、サンドフライに見られる旗揚げ形態;そして、アマスティゴテは、哺乳動物宿主マクロファージ12、13の寄生性空胞に見られる細胞内形態である。脊椎動物宿主のマクロファージの防御機構にもかかわらず、アマスティゴテスの侵略、生存、複製する能力は、多くの研究の対象となる14、15、16、17。その結果、いくつかの研究グループが、特定の環境要因の影響を評価するためにインビトロマクロファージ感染アッセイを記述し、寄生虫および宿主遺伝子が寄生虫感染性に及ぼす影響を評価している。このアッセイは、高スループット形式に研究を適応させる能力、結果を得るための比較的短い期間、および犠牲にした実験動物の数を減少させる18のようないくつかの利点を提示する。しかし、インビトロアッセイの所見は、インビボ研究14、19、20、21を常に複製するとは限らない。インビボアッセイは、宿主寄生虫相互作用の全身的な生理学的概要を提供し、インビトロアッセイでは完全に模倣することができない。例えば、免疫学的研究は、回収されたフットパッド組織切片から、あるいは回収された免疫細胞22の分析のために球輝リンパ節からも免疫組織化学的アッセイを通して行うことができる。
動物は、多くの場合、疾患23の基礎的な生理学的メカニズムをよりよく理解するために、生物学的および生物医学的研究におけるヒト疾患のモデルとして使用される。リーシュマニア症の場合、接種の経路、部位、または用量が疾患の結果24、25、26、27に影響を与える。さらに、ヒトおよびマウスにおける感染に対する感受性および耐性は、宿主および寄生虫4の遺伝的背景によって高度に調節される4、5、22、28、29、30、31である。BALB/cマウスは、L.アマゾニスの皮感染に対して非常に感受性であり、寄生虫がリンパ節、脾臓、および肝臓32に広がることを伴う急速な疾患進行を示す。病気が皮の転移に進行する可能性があるため、感染は致命的になる可能性があります。対照的に、C57BL/6マウスは、L.アマゾネンシス感染アッセイ33において持続的な寄生虫負荷を有する慢性病変をしばしば発症する。それにより、この特定のマウス種に対するL.アマゾネンシス感染は、ヒトにおける慢性形態の皮状リーシュマニア症を研究する優れたモデルと考えられているが、それはBALB/cマウス感染モデル5、34よりも疾患進行を模倣するからである。
したがって、マウスインビボ感染は、ヒト疾患に適用可能なリーシュマニア病原性生理学的研究に有用な方法であり、宿主と寄生虫の相互作用の全身的な見解を可能にすることを提案する。確立されたアッセイ22を再検討し、我々はここに、亜感染性アマスタチゴテへの寄生虫分化、マウスフットパッドの細部発微、病変の発達、および寄生虫負荷測定を含むL.アマゾネンシスを有するC57BL/6マウスのインビボ感染のコンパイルされたステップバイステッププロトコルを提示する。このプロトコルは、他のマウス株および皮状リーシュマニアーゼを引き起こすリーシュマニア種に適応させることができる。結論として、ここで提示された方法は、新しい抗リーシュマニア薬物標的およびワクチンを同定する上で重要であり、また、リーシュマニア感染に対する宿主の免疫および代謝応答の生理学的研究において重要である。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner bio-ne</td>
			<td>655180</td>
			<td>A flat-bottom plate for limiting dilution assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8626</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caliper</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>700-118-20</td>
			<td>A caliper to measure the thickness of footpad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353014</td>
			<td>A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>An equipament used for separating samples based on its density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator 34 &#176;C</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td>An incubator for amastigotes differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K50237083820</td>
			<td>A disinfectant for general items</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass tissue grinder tube</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3431 E04</td>
			<td>A tube to collect and disrupt infected footpad tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Synth</td>
			<td>G1008.01.AH</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>A software used to plot the data and calculate statistical significance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-2250</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5303</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator 25 &#176;C</td>
			<td>Fanem</td>
			<td>347CD</td>
			<td>An incubator for promastigotes cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TMS</td>
			<td>An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>An inhalant anesthetics for mice (3-5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laminar flow cabinet</td>
			<td>Veco</td>
			<td>VLFS-09</td>
			<td>A biosafety cabinet used for aseptical work area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 cell culture media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31100-035</td>
			<td>A cell culture media for Leishmania cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td>A microtube used for sample collection, processing and storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichanel pipette</td>
			<td>Labsystems</td>
			<td>F61978</td>
			<td>A multichannel pipette used for limiting dilution assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6329</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>HBG</td>
			<td>2266</td>
			<td>A hemocytometer to count the parasite suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200</td>
			<td>An optical equipament used to count parasite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>349</td>
			<td>A flexible and resistant plastic to seal the plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>A sterile dish to dissect the footpad tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipetman kit</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167360</td>
			<td>A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Quimis</td>
			<td>BG2000</td>
			<td>An equipament used to weigh collected footpad lesions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>Solidor</td>
			<td>10237580026</td>
			<td>A scalpel to cut and collect footpad tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological pipette 10 mL</td>
			<td>Nest</td>
			<td>327001</td>
			<td>A sterile pipette used for transfering mililiter volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td></td>
			<td>A pipette tip used for transfering microliter volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>A dye used to count viable parasites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypticase peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305945</td>
			<td>A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo infection with leishmania amazonensis to evaluate parasite virulence in mice

リーシュマニア属は、リーシュマニアーゼを引き起こす原虫の寄生虫であり、皮疹から内臓病変まで幅広い臨床症状を示す疾患である。現在、世界中で1,200万人がリーシュマニアに感染していると推定されており、10億人以上が感染の危険にさらされています。リーシュマニアアマゾネンシスは中南米で流行しており、通常は動物モデルで直接視覚化できる病気の皮形成につながる。したがって、L.アマゾネンシス株は、インビトロでも容易に栽培されるため、皮状リーシュマニア症研究に適したモデルです。C57BL/6マウスは、ヒトで観察されるL.アマゾネンシス主導の疾患進行を模倣し、皮状リーシュマニア症のモデルに最適なマウス株の1つと考えられている。脊椎動物宿では、これらの寄生虫は、これらの細胞の防御機構にもかかわらずマクロファージに生息する。いくつかの研究は、異なる条件下で寄生虫の感染性を評価するために、インビトロマクロファージ感染アッセイを使用しています。しかし、インビトロアプローチは、生物の応答を無視する単離された細胞系に限定される。ここでは、宿主寄生虫相互作用の全身生理学的概要を提供するインビボマウス感染法をまとめます。L.アマゾネンシスを有するC57BL/6マウスのインビボ感染に関する詳細なプロトコルは、感染性アマスティゴテ、マウスフットパッドの皮状接種、病変発生、および寄生虫負荷測定への寄生虫分化を含む。この確立された方法は、皮状リーシュマニア症に対する宿主免疫および代謝反応の生理学的研究のための最も適切な方法として提案する。

リーシュマニア原虫寄生虫は、無脊椎動物および脊椎動物の宿主におけるライフサイクルの間に2つの発達形態に存在する:プロマチゴテ、雌のサンドフライの内腔に見られる増殖形態;そして、哺乳動物宿主細胞の寄生性空胞に見られる増殖性形態を有する。プロマスチゴは幅約1.5μm、長さ20μmの細長い体を有し、典型的には前肢から出てくるフラグエルムを有?...

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In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

ここでは、レーシュマニア・アマゾネンシスを用いたマウスの皮状感染を評価するためのコンパイル済みプロトコルを提示する。これは、寄生虫の病原性を研究するための信頼性の高い方法であり、感染に対する脊椎動物宿主応答の全身的な見解を可能にする。

マウスの寄生虫毒性を評価するリーシュマニアアマゾネンシスによるVivo感染

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...

このプロトコルは、皮状感染症に脊椎動物宿主の全身的な見解を提供するので、リーシュマニア病原性を研究するのに適している。このプロトコルを採用する主な利点は、研究者が同時に宿主の炎症反応と寄生虫複製を評価することができるということです。この方法は、毒性に関連するいくつかの標的および治療を特徴付けるために使用することができ、それは皮リーシュマニア症の制御に新しい洞察をもたらす可能性がある。また、他のマウス株や皮リーシュマニア症を引き起こすリーシュマニア種にも適用できます。このアッセイには、マウスの作業に慣れ、感染性物質への偶発的な暴露を避けるために板下注射を行った経験がある訓練を受けた人員を必要とするなど、いくつかの重要なステップがあります。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の技術者であるリカルド・ザンピエリ博士です。25センチメートル平方細胞培養フラスコでL.アマゾネンシスのプロマスティゴトを成長させることから始め、10ミリリットルのプロミディアムを含み、摂氏25度で3日間栽培します。インキュベーション後、ピペット5ミリリットルの対数成長相プロマスティゴテ培養を新しいフラスコに培養する。フラスコにアマ培地を5ミリリットル加え、3~4日間摂氏34度でインキュベートします。新しいフラスコに新鮮なアマ培地で1〜3の比率で希釈することによって培養を分割します。その後、さらに3〜5日間インキュベートします。PBSで希釈したアキセン酸アマスチゴス懸濁液のアリコートをノイバウアーチャンバーに移し、非フラグを立て寄生虫を数える。次いで、所望の接種量および意図される接種数に応じてPBS中の懸濁液を希釈する。準備された寄生虫の懸濁液と27ゲージ針で結核注射器をロードします。マウスがつま先ピンチで完全に麻酔され、サスペンションの50マイクロリットルを左後ろ足パッドの板前組織に接種することを確認します。週に1回の病変の進行を記録し、キャリパーを用いて感染したフットパッドと非感染フットパッドの厚さを測定し、2つのフットパッド間の厚さの差を計算して病変進行を評価する。1回の病変にガラス組織グラインダーチューブにプロミドを1ミリリットル加え、チューブの重量を量る。感染したフットパッドを抽出するために、フットパッドに70%エタノールをスプレーし、そのかかとで動物の足を切除します。はさみと鉗子を70%エタノールに浸して、殺菌することを確認して下さいます。無菌ペトリ皿にフットパッドを置き、鉗子とメスでそれを解剖します。すべての軟部組織を収集し、骨を捨てます。採取した組織をガラス組織グラインダーチューブに移し、チューブを再び秤量して病変重量を決定します。完全な組織破壊のためにグラインダーで組織を10回均質化し、混合物を解決させます。上清の20マイクロリットルを収集し、原稿の指示に従って調製された96ウェルプレートの第1列および第1レーンにロードする。次の 3 つのレーンでこの手順を繰り返して、各動物の結果を 4 倍にします。マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルを10回均質化し、希釈したサンプルの20マイクロリットルを第1カラムから第2列に移す。最後のカラムに到達するまでシリアル希釈を続け、希釈したサンプルの最後の20マイクロリットルを捨てます。プレートをフィルムで密封し、湿気の多いチャンバーで7日間摂氏25度でインキュベートします。インキュベーション後、反転顕微鏡でプレートを分析し、各レーンの最後の寄生虫含有ウェルを決定します。リーシュマニア原虫寄生虫は、無脊椎動物および脊椎動物の宿主におけるライフサイクル中の2つの発達形態に存在する:プロマスチゴテおよびアマスチゴテ。無菌状態は、異なる宿主環境をインビトロでシミュレートし、寄生虫の形態と生存率を維持することができる。アマスチゴの無分離条件は、脊椎動物の宿主の酸性環境および温度上昇を模倣する。プロマスティゴトは、これらの条件下でアマスティゴトに分化します。中性pHに移し、摂氏25度でインキュベートすると、無化症性のアマスチゴはプロマスティゴテに戻る。野生型とリーシュマニア鉄レギュレータ1ノックアウト株の病原性差は、感染したマウスのフットパッドで観察された。LIR1はリーシュマニアの細胞内鉄レベルを調節し、鉄の輸出を媒介し、細胞内蓄積を有毒レベルに予防します。腫脹および病変進行の違いを含む感染アッセイは、LIR1が生体内のL.アマゾネンシスに不可欠であることを明らかにした。寄生虫負荷は、感染病変からの限定希釈アッセイを行うことにより決定した。LIR1ノックアウト感染マウスの病変は、野生型リーシュマニア感染マウスの寄生虫よりも10〜6倍少ない寄生虫を含み、LIR1の不在がアマスチゴトの細胞内複製を妨すことを明らかにした。この手順を実行するときに覚えておくべき最も重要なことの1つは、寄生虫毒性の喪失を避けるために10回未満の体液で継代されたリーシュマニア文化を使用することです。この手順に加えて、インビトロ感染アッセイを使用することができます。しかし、これは限られた方法であり、宿主寄生虫相互作用の全身的な生理学的概観を提供しないためである。このin vivo法は、さらなる免疫学的研究のために回収された宿主組織における血清バイオマーカーの定量化など、皮リーシュマニア症に対する全身応答を評価するための最良のアプローチである。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

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