Name: in vivo infection with leishmania amazonensis to evaluate parasite virulence in mice
Uploaded: 2020-02-20T13:00:00
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Agradecemos ao Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Câmara, do Centro Animal do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, pelo apoio e pela Profª Dra. Este trabalho contou com o apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa de São Paulo (FAPESP - Bolsa 2017/23933-3).

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Biociência da Universidade de São Paulo (CEUA 342/2019), e foram conduzidos de acordo com as recomendações e as políticas de Cuidado e Uso de Animais Laboratoriais do Estado de São Paulo (Lei Estadual 11.977, lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) e do governo brasileiro (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Todas as etapas descritas nas seções 1-5 devem ser realizadas de forma asséptica dentro de armários...

O ensaio de infecção in vivo descrito neste protocolo permite que qualquer pesquisador avalie na leishmaniose cutânea vivo considerando a interação hospedeiro-parasita em um cenário sistêmico. Esses ensaios têm sido utilizados por muitos grupos22,24,27,29,31,32,34,<sup cla...

Os leishmanioses são doenças infecciosas parasitárias predominantes mundialmente representando desafios importantes nos países em desenvolvimento e são reconhecidas como uma das doenças tropicais negligenciadas mais importantes pela Organização Mundial da Saúde1,2. Os leishmanioses são caracterizados por manifestações cutâneas, mucosas e/ou viscerais. Leishmaniose cutânea geralmente é causada por L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica e L. aethiopica3. Esta forma da doença é muitas vezes auto-curativa em humanos devido à indução da resposta imune celular protetora. No entanto, a resposta imune celular pode falhar, e a doença pode progredir para a leishmaniose cutânea disseminada4,5. Não há vacina disponível devido à diversidade entre espécies de Leishmania e hospedam origens genéticas6,7. As opções de tratamento também são limitadas, pois a maioria dos medicamentos disponíveis atualmente são caros, tóxicos e/ou podem exigir tratamento de longo prazo8,9. Além disso, houve relatos de resistência medicamentosa contra os tratamentos disponíveis10,11.
O agente causal da leishmaniose é o parasita protozoário Leishmania. O parasita apresenta duas formas morfológicas distintas em seu ciclo de vida: promastigotes, a forma flagelada encontrada em moscas de areia; e amastigotes, a forma intracelular encontrada nos vacuoles parasitophorosos dos macrófagos hospedeiros de mamíferos12,13. A capacidade dos amastigotes de invadir, sobreviver e replicar apesar dos mecanismos de defesa dos macrófagos do hospedeiro vertebrado estão sujeitas a muitos estudos14,15,16,17. Consequentemente, vários grupos de pesquisa têm descrito ensaios de infecção por macrófagos in vitro para avaliar o impacto de fatores ambientais específicos, bem como genes parasitas e hospedeiros na infectividade do parasita. Este ensaio apresenta várias vantagens, como a capacidade de adaptar estudos a um formato de alto desempenho, período de tempo relativamente menor para obter resultados, e número reduzido de animais de laboratório sacrificados18. No entanto, os achados dos ensaios in vitro são limitados porque nem sempre se replicam nos estudos vivo14,19,20,21. Em ensaios vivos fornecem uma visão geral fisiológica sistêmica da interação host-parasita, que não pode ser totalmente imitada por ensaios in vitro. Por exemplo, estudos imunológicos podem ser realizados através de ensaios imunohistoquímicos de seções de tecido de pisque coletados ou até mesmo de linfonodos popliteis para análise das células imunes recuperadas22.
Os animais são frequentemente usados como modelo para doenças humanas em pesquisas biológicas e biomédicas para entender melhor os mecanismos fisiológicos subjacentes das doenças23. No caso da leishmaniose, a rota, local ou dose de inoculação influenciam o desfecho da doença24,25,26,27. Além disso, a suscetibilidade e a resistência à infecção em humanos e camundongos são altamente reguladas pelos antecedentes genéticos do hospedeiro e parasita4,5,22,28,29,30,31. Os camundongos BALB/c são altamente suscetíveis à infecção cutânea de L. amazonensis, mostrando uma rápida progressão da doença com a disseminação dos parasitas para os linfonodos, baço e fígado32. Como a doença pode progredir para metástases cutâneas, a infecção pode ser fatal. Em contraste, os camundongos C57BL/6 geralmente desenvolvem lesões crônicas com cargas de parasitas persistentes em ensaios de infecção por L. amazonensis 33. Assim, a infecção por L. amazonensis com essa espécie de camundongos em particular tem sido considerada um excelente modelo para estudar formas crônicas de leishmaniose cutânea em humanos, pois imita melhor a progressão da doença do que o modelo de infecção por camundongos BALB/C5,34.
Por isso, propomos que a murina na infecção vivo seja um método útil para estudos fisiológicos de virilidade leishmania aplicáveis à doença humana, permitindo uma visão sistêmica da interação hospedeiro-parasita. Revisitando ensaios bem estabelecidos22,apresentamos aqui um protocolo compilado passo a passo da infecção in vivo de camundongos C57BL/6 com L. amazonensis que compreende a diferenciação parasita em amastigotes axenic, ambulatora cutânea cutânea cutânea, desenvolvimento de lesões e determinação de carga parasite. Este protocolo pode ser adaptado a outras cepas de camundongos e espécies de Leishmania que causam leishmanioses cutâneas. Em conclusão, o método aqui apresentado é crucial para identificar novas metas e vacinasanti-Leishmania, bem como em estudos fisiológicos das respostas imunes e metabólicas do hospedeiro à infecção por Leishmania.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner bio-ne</td>
			<td>655180</td>
			<td>A flat-bottom plate for limiting dilution assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8626</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caliper</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>700-118-20</td>
			<td>A caliper to measure the thickness of footpad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353014</td>
			<td>A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>An equipament used for separating samples based on its density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator 34 &#176;C</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td>An incubator for amastigotes differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K50237083820</td>
			<td>A disinfectant for general items</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass tissue grinder tube</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3431 E04</td>
			<td>A tube to collect and disrupt infected footpad tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Synth</td>
			<td>G1008.01.AH</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>A software used to plot the data and calculate statistical significance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-2250</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5303</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator 25 &#176;C</td>
			<td>Fanem</td>
			<td>347CD</td>
			<td>An incubator for promastigotes cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TMS</td>
			<td>An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>An inhalant anesthetics for mice (3-5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laminar flow cabinet</td>
			<td>Veco</td>
			<td>VLFS-09</td>
			<td>A biosafety cabinet used for aseptical work area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 cell culture media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31100-035</td>
			<td>A cell culture media for Leishmania cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td>A microtube used for sample collection, processing and storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichanel pipette</td>
			<td>Labsystems</td>
			<td>F61978</td>
			<td>A multichannel pipette used for limiting dilution assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6329</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>HBG</td>
			<td>2266</td>
			<td>A hemocytometer to count the parasite suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200</td>
			<td>An optical equipament used to count parasite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>349</td>
			<td>A flexible and resistant plastic to seal the plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>A sterile dish to dissect the footpad tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipetman kit</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167360</td>
			<td>A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Quimis</td>
			<td>BG2000</td>
			<td>An equipament used to weigh collected footpad lesions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>Solidor</td>
			<td>10237580026</td>
			<td>A scalpel to cut and collect footpad tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological pipette 10 mL</td>
			<td>Nest</td>
			<td>327001</td>
			<td>A sterile pipette used for transfering mililiter volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td></td>
			<td>A pipette tip used for transfering microliter volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>A dye used to count viable parasites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypticase peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305945</td>
			<td>A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo infection with leishmania amazonensis to evaluate parasite virulence in mice

Leishmania spp. são parasitas protozoários que causam leishmanioses, doenças que apresentam um amplo espectro de manifestações clínicas, desde lesões cutâneas até viscerais. Atualmente, estima-se que 12 milhões de pessoas estejam infectadas pela Leishmania em todo o mundo e mais de 1 bilhão de pessoas vivem em risco de infecção. A leishmania amazonensis é endêmica na América Central e do Sul e geralmente leva à forma cutânea da doença, que pode ser diretamente visualizada em um modelo animal. Portanto, as cepas de L. amazonensis são bons modelos para estudos de leishmaniose cutânea, pois também são facilmente cultivados in vitro. Camundongos C57BL/6 imitam a progressão da doença orientada por L. amazonensisobservada em humanos e são consideradas um dos melhores modelode cepas de camundongos para leishmaniose cutânea. No hospedeiro vertebrado, esses parasitas habitam macrófagos apesar dos mecanismos de defesa dessas células. Diversos estudos utilizam ensaios de infecção por macrófagos in vitro para avaliar a infectividade do parasita em diferentes condições. No entanto, a abordagem in vitro limita-se a um sistema celular isolado que desconsidera a resposta do organismo. Aqui, compilamos um método de infecção por murina in vivo que fornece uma visão geral fisiológica sistêmica da interação hospedeiro-parasita. O protocolo detalhado para a infecção in vivo de camundongos C57BL/6 com L. amazonensis compreende diferenciação parasite em amastigotes infecciosos, inoculação cutânea do pé de camundongos, desenvolvimento de lesões e determinação de carga parasite. Propomos esse método bem estabelecido como o método mais adequado para estudos fisiológicos das respostas imunes e metabólicas do hospedeiro à leishmaniose cutânea.

Parasitas protozoários de leishmania existem em duas formas de desenvolvimento durante seu ciclo de vida em hospedeiros invertebrados e vertebrados: promastigotes, as formas proliferativas encontradas no lúmen da sandfly fêmea; e amastigotes, as formas proliferativas encontradas nos vacúrios parasitophorosos das células hospedeiras dos mamíferos. Os promastigotes têm um corpo alongado de aproximadamente 1,5 μm de largura e 20 μm de comprimento, com um flagellum tipicamen...

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In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Aqui, apresentamos um protocolo compilado para avaliar a infecção cutânea de camundongos com Leishmania amazonensis. Este é um método confiável para estudar a virulência parasite, permitindo uma visão sistêmica da resposta do hospedeiro vertebrado à infecção.

In Vivo Infecção com Leishmania amazonensis avaliará virulence parasita em camundongos

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...

Este protocolo é adequado para estudar a virulência de Leishmania, pois fornece uma visão sistêmica do hospedeiro vertebrado para a infecção cutânea. A principal vantagem de adotar esse protocolo é que ele permite que os pesquisadores avaliem a resposta inflamatória hospedeira e a replicação de parasitas simultaneamente. Este método pode ser usado para caracterizar vários alvos e tratamentos relacionados à virulência, o que poderia trazer novos insights sobre o controle da leishmaniose cutânea.Também pode ser aplicado a outras cepas de camundongos e espécies de Leishmania que causam leishmaniose cutânea. Este ensaio tem algumas etapas críticas, como exigir pessoal treinado que se sinta confortável trabalhando com camundongos e tenha experiência na realização de injeções subplantar para evitar exposição acidental a material infeccioso. Demonstrando o procedimento estará o Dr. Ricardo Zampieri, técnico do meu laboratório.Comece cultivando promastigotes de L.amazonensis em um frasco de cultura celular quadrada de 25 centímetros, contendo 10 mililitros de pró-médio, por três dias a 25 graus Celsius. Após a incubação, pipetas cinco mililitros de cultura de promastigote fase de crescimento logarítmico em um novo frasco. Adicione cinco mililitros de ama-médio ao frasco, e incuba-o a 34 graus Celsius por três a quatro dias.Divida a cultura diluindo-a em uma proporção de um a três com ama-médio fresco em um novo frasco. Em seguida, incuba-lo por mais três a cinco dias. Transfira uma alíquota da suspensão de amastigotes axenic diluída em PBS para uma câmara de Neubauer e conte os parasitas não sinalizados.Em seguida, diluir a suspensão em PBS de acordo com a dose inóculo desejada e o número de inóculos pretendidos. Carregue uma seringa tuberculina com uma agulha calibre 27 com a suspensão do parasita preparada. Certifique-se de que o mouse está totalmente anestesiado com uma pitada do dedo do pé e inocula 50 microliters da suspensão no tecido subplantar no fundo traseiro esquerdo.Regissão da lesão uma vez por semana, medindo a espessura dos footpads infectados e não infectados usando uma pinça, e calcule a diferença de espessura entre os dois footpads para avaliar a progressão da lesão. Adicione um mililitro de pró-médio em um tubo de moedor de tecido de vidro por lesão e pese o tubo. Pulverizar 70% de etanol no footpad para desinfecção e extirver o pé do animal em seu calcanhar para extrair o footpad infectado.Certifique-se de que a tesoura e fórceps sejam esterilizados mantendo-os encharcados em 70% de etanol. Coloque o bloco de pés em uma placa de Petri estéril e disseque-o com os fórceps e bisturi. Recolhe todo o tecido mole e descarta os ossos.Transfira os tecidos coletados para o tubo moedor de tecido de vidro e pese novamente o tubo para determinar o peso da lesão. Homogeneize o tecido 10 vezes com o moedor para interrupção completa do tecido, e permita que a mistura se aposente. Colete 20 microlitadores do supernascer e carregue-o na primeira coluna e primeira faixa da placa do poço 96, preparada de acordo com as instruções do manuscrito.Repita esta etapa para que as próximas três pistas tenham resultados quadruplicas para cada animal. Homogeneize cada poço 10 vezes usando uma pipeta multicanal, e transfira 20 microliters da amostra diluída da primeira para a segunda coluna. Continue a diluição seriada até que a última coluna seja atingida, e descarte os 20 microlitadores finais da amostra diluída.Sele a placa com filme, e incuba-a a 25 graus Celsius por sete dias em uma câmara úmida. Após a incubação, analise a placa sob um microscópio invertido para determinar o último poço contendo parasitas para cada pista. Parasitas protozoários leishmania existem em duas formas de desenvolvimento durante seu ciclo de vida em hospedeiros invertebrados e vertebrados:promastigotes e amastigotes.As condições axenicas podem simular diferentes ambientes hospedeiros in vitro, mantendo a morfologia e viabilidade do parasita. Condições axenicas para amastigotes imitam o ambiente ácido e aumento da temperatura dos hospedeiros vertebrados. Promastigotes se diferenciarão em amastigotes nessas condições.Quando transferidos para pH neutro e incubados a 25 graus Celsius, amastigotes axenic transformam-se de volta em promastigotes. A diferença de virulência do tipo selvagem e as cepas de nocaute do Regulador de Ferro Leishmania 1 foram observadas em footpads de rato infectados. O LIR1 regula os níveis intracelulares de ferro na Leishmania, mediando a exportação de ferro e impedindo seu acúmulo intracelular a níveis tóxicos.O ensaio de infecção que inclui a diferença no inchaço e na progressão da lesão revelou que o LIR1 é essencial para l.amazonensis in vivo virulence. A carga do parasita foi determinada pela realização de um ensaio de diluição limitante das lesões infectadas. As lesões dos camundongos infectados pelo nocaute LIR1 contêm de 10 a seis parasitas a menos do que os camundongos infectados por Leishmania, revelando que a ausência de LIR1 impede a replicação intracelular dos amastigotes.Uma das coisas mais importantes a se lembrar quando você está realizando este procedimento é usar culturas leishmania que foram passagem in vitro menos de dez vezes para evitar a perda de virulência de parasitas. Além deste procedimento, você pode usar ensaios de infecção in vitro. No entanto, este é um método limitado, pois não fornece uma visão geral fisiológica sistêmica da interação hospedeiro-parasita.Este método in vivo é a melhor abordagem para avaliar respostas sistêmicas para leishmaniose cutânea, como quantificar biomarcadores de soro em tecidos hospedeiros recuperados para estudos imunológicos posteriores.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

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Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

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Um parasita Ensaio de Resgate e Transformação de Triagem leishmanicida contra intracelular<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotas em THP1 linha celular humana aguda Monocytic Leucemia

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The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...