Name: in vivo infection with leishmania amazonensis to evaluate parasite virulence in mice
Uploaded: 2020-02-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить профессора д-ра Нильса Олсена Сарайву Камара из Центра животных Института биомедицинских наук Университета Сан-Паулу за поддержку и профессора д-ра Сильвию Рени Ульяну за предоставление мясорубки из стеклянной ткани. Эта работа была поддержана Сан-Паулу научно-исследовательский фонд (FAPESP - MFLS ' грант 2017/23933-3).

Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию в Институте бионауки Университета Сан-Паулу (CEUA 342/2019), и были проведены в соответствии с рекомендациями и политикой по уходу и использованию лабораторных животных штата Сан-Паулу (Lei Estadual 11.977,...

Анализ инфекции in vivo, описанный в этом протоколе, позволяет любому исследователю оценить in vivo кожный лейшманиоз, рассматривая взаимодействие хозяина-паразита в системном сценарии. Эти анализы были использованы многими группами22,24,27,<su...

Лейшманиозы являются во всем мире распространенными паразитарными инфекционными заболеваниями, представляющими важные проблемы в развивающихся странах и признаны одним из наиболее важных забытых тропических заболеваний Всемирной организацией здравоохранения1,2. Лейшманиазы характеризуются кожными, слизистыми и/или висцеральными проявлениями. Кожный лейшманиоз, как правило, вызвано L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica и L. aethiopica3. Эта форма заболевания часто самовосстановления у людей из-за индукции защитного клеточного иммунного ответа. Тем не менее, клеточный иммунный ответ может потерпеть неудачу, и болезнь может прогрессировать до распространения кожного лейшманиоза4,5. Существует нет доступной вакцины из-за разнообразия среди видов Лейшмании и принимающей генетического происхождения6,7. Варианты лечения также ограничены, поскольку большинство имеющихся в настоящее время лекарств являются либо дорогими, токсичными, и / или может потребовать длительного лечения8,9. Кроме того, были сообщения о лекарственной устойчивости против доступных методов лечения10,11.
Возбудитель лейшманиозов является простейший паразит Лейшмания. Паразит представляет две различные морфологические формы в своем жизненном цикле: промастиготы, флагеллированная форма, встречающаяся в мухах; и amastigotes, внутриклеточная форма, найденная в паразитофорных вакуолах млекопитающих хозяина макрофагов12,13. Способность Amastigotes вторгаться, выживать и размножаться, несмотря на защитные механизмы макрофагов позвоночных хозяина подлежат многим исследованиям14,15,16,17. Следовательно, несколько исследовательских групп были описания в пробирке макрофагов инфекции анализы для оценки воздействия конкретных факторов окружающей среды, а также паразитов и генов-хозяев на инфекционность паразитов. Этот ассс и сойд представляет собой ряд преимуществ, таких как способность адаптировать исследования к формату высокой пропускной способности, относительно более короткий период времени для получения результатов, и сокращение числа лабораторных животных, принесено в жертву18. Тем не менее, результаты in vitro анализы ограничены, потому что они не всегда реплицируются в vivo исследования14,19,20,21. In vivo анализы обеспечивают системный физиологический обзор взаимодействия хозяина-паразита, который не может быть полностью имитирован in vitro анализы. Например, иммунологические исследования могут быть выполнены с помощью иммуногистохимических анализов из собранных участков ткани разделов или даже из popliteal лимфатических узлов для анализа восстановленных иммунных клеток22.
Звери часто используются в качестве модели для заболеваний человека в биологических и биомедицинских исследований, чтобы лучше понять основные физиологические механизмы заболеваний23. В случае лейшманиоза, маршрут, участок, или доза прививки влияют на исход заболевания24,25,26,27. Кроме того, восприимчивость и устойчивость к инфекции у людей и мышей строго регулируются генетическим фоном хозяина и паразита4,5,22,28,29,30,31. BALB/c мышей очень восприимчивы к L. amazonensis кожной инфекции, показывая быстрое прогрессирование заболевания с распространением паразитов в лимфатических узлов, селезенки и печени32. Как болезнь может прогрессировать до кожных метастазов, инфекция может быть фатальным. В отличие от этого, C57BL/6 мышей часто развиваются хронические поражения с стойкими паразитами нагрузки в L. amazonensis инфекциианализы 33. Таким образом, L. amazonensis инфекции с этой конкретной мыши видов считается отличной моделью для изучения хронических форм кожного лейшманиоза у людей, потому что он имитирует прогрессирование болезни лучше, чем BALB / c мышей модель5,34.
Таким образом, мы предлагаем, что мурин in vivo инфекции является полезным методом для Лейшмании вирулентности физиологических исследований, применимых к болезни человека, что позволяет системное представление о принимающей паразит взаимодействия. Пересмотр устоявшихся анализов22, мы представляем здесь составленный пошагонный протокол in vivo инфекции C57BL/6 мышей с L. amazonensis, которая включает в себя дифференциацию паразитов в топорные amastigotes, мышей подножки кожной прививки, развитие поражения, и определение нагрузки паразитов. Этот протокол может быть адаптирован к другим штаммам мышей и видам лейшмании, которые вызывают кожные лейшманиазы. В заключение, метод, представленный здесь имеет решающее значение в выявлении новых целей противлейшмании наркотиков и вакцин, а также в физиологических исследованиях принимающей иммунной и метаболических реакций на инфекции Лейшмании.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner bio-ne</td>
			<td>655180</td>
			<td>A flat-bottom plate for limiting dilution assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8626</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caliper</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>700-118-20</td>
			<td>A caliper to measure the thickness of footpad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353014</td>
			<td>A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>An equipament used for separating samples based on its density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator 34 &#176;C</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td>An incubator for amastigotes differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K50237083820</td>
			<td>A disinfectant for general items</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass tissue grinder tube</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3431 E04</td>
			<td>A tube to collect and disrupt infected footpad tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Synth</td>
			<td>G1008.01.AH</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>A software used to plot the data and calculate statistical significance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-2250</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5303</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator 25 &#176;C</td>
			<td>Fanem</td>
			<td>347CD</td>
			<td>An incubator for promastigotes cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TMS</td>
			<td>An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>An inhalant anesthetics for mice (3-5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laminar flow cabinet</td>
			<td>Veco</td>
			<td>VLFS-09</td>
			<td>A biosafety cabinet used for aseptical work area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 cell culture media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31100-035</td>
			<td>A cell culture media for Leishmania cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td>A microtube used for sample collection, processing and storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichanel pipette</td>
			<td>Labsystems</td>
			<td>F61978</td>
			<td>A multichannel pipette used for limiting dilution assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6329</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>HBG</td>
			<td>2266</td>
			<td>A hemocytometer to count the parasite suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200</td>
			<td>An optical equipament used to count parasite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>349</td>
			<td>A flexible and resistant plastic to seal the plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>A sterile dish to dissect the footpad tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipetman kit</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167360</td>
			<td>A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Quimis</td>
			<td>BG2000</td>
			<td>An equipament used to weigh collected footpad lesions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>Solidor</td>
			<td>10237580026</td>
			<td>A scalpel to cut and collect footpad tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological pipette 10 mL</td>
			<td>Nest</td>
			<td>327001</td>
			<td>A sterile pipette used for transfering mililiter volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td></td>
			<td>A pipette tip used for transfering microliter volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>A dye used to count viable parasites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypticase peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305945</td>
			<td>A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo infection with leishmania amazonensis to evaluate parasite virulence in mice

Лейшмания spp. являются простейшие паразиты, которые вызывают лейшманиозы, заболевания, которые представляют широкий спектр клинических проявлений от кожных до висцеральных поражений. В настоящее время 12 миллионов человек, по оценкам, инфицированы лейшманией во всем мире и более 1 миллиарда человек живут в опасности заражения. Leishmania amazonensis является эндемическим заболеванием в Центральной и южной Америке и обычно приводит к кожной форме заболевания, которая может быть непосредственно визуализирована в животной модели. Таким образом, штаммы L. amazonensis являются хорошими моделями для кожных исследований лейшманиоза, потому что они также легко культивируются в пробирке. C57BL/6 мышей имитировать L. amazonensis-управляемыйпрогрессирования болезни наблюдается у людей и считаются одним из лучших мышей штаммов модель кожного лейшманиоза. В позвоночных хозяина, эти паразиты населяют макрофаги, несмотря на защитные механизмы этих клеток. Несколько исследований используют in vitro макрофаговые анализы инфекции для оценки инфекционной паразита в различных условиях. Однако подход in vitro ограничивается изолированной клеточной системой, которая игнорирует реакцию организма. Здесь мы компилировать in vivo murine инфекции метод, который обеспечивает системный физиологический обзор взаимодействия хозяина-паразита. Подробный протокол для инфекции in vivo мышей C57BL/6 с L. amazonensis включает дифференциацию паразитов в инфекционные амастиготы, мышей подножки кожной прививки, развитие поражения, и определение нагрузки паразита. Мы предлагаем этот устоявшийся метод как наиболее адекватный метод физиологических исследований иммунной и метаболической реакции хозяина на кожный лейшманиоз.

Лейшмания простейшие паразиты существуют в двух формах развития во время их жизненного цикла в беспозвоночных и позвоночных хостов: promastigotes, размножающихся форм, найденных в прозме женского sandfly; и amastigotes, пролиферативные формы, найденные в паразитофорных вакуол ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice at JoVE.com

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Здесь мы представляем составленный протокол для оценки кожной инфекции мышей с Leishmania amazonensis. Это надежный метод изучения паразитной вирулентности, позволяющий системно смотреть на реакцию позвоночных хозяев на инфекцию.

В Vivo инфекции с Лейшмания amazonensis для оценки паразитов virulence у мышей

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...

Этот протокол подходит для изучения вирулентности Лейшмании, так как обеспечивает системное представление о позвоночном хозяине к кижной инфекции. Основным преимуществом принятия этого протокола является то, что он позволяет исследователям оценить воспалительной реакции хозяина и репликации паразитов одновременно. Этот метод может быть использован для характеристики нескольких целей и методов лечения, связанных с вирулентностью, которые могли бы принести новые идеи в кокенозный контроль лейшманиоза.Он также может быть применен к другим штаммам мышей и лейшмании видов, которые вызывают кокеноз лейшманиоз. Этот анализ имеет некоторые важные шаги, такие как требование квалифицированного персонала, которые комфортно работать с мышами и имеют опыт в выполнении субплантарных инъекций, чтобы избежать случайного воздействия инфекционного материала. Демонстрацией процедуры будет доктор Рикардо Зампьери, техник из моей лаборатории.Начните с выращивания L.amazonensis promastigotes в 25-сантиметровой квадратной клеточной культуре колбы, содержащей 10 миллилитров про-среды, в течение трех дней при 25 градусах по Цельсию. После инкубации пипетка пять миллилитров логаритмической фазы роста промастигот культуры в новую колбу. Добавьте пять миллилитров ама-среды в колбу и инкубировать при 34 градусах по Цельсию в течение трех-четырех дней.Разделите культуру, разбавляя ее в соотношении один к трем со свежей ама-средой в новой колбе. Затем инкубировать его еще три-пять дней. Перенесите алицит подвески топорных амистиготов, разбавленных в PBS, в камеру Нойбауэра и подсчитайте паразитов, не являющееся флагманами.Затем разбавьте суспензию в PBS в соответствии с желаемой дозой инокулума и количеством инокульмов, предназначенных. Загрузите туберкулин шприц с 27 калибровочных игл с подготовленной подвеской паразита. Убедитесь, что мышь полностью анестезируется с щепоткой ног и привить 50 микролитров подвески в субплантарной ткани на левой задней ноге.Запись прогрессирования поражения один раз в неделю, путем измерения толщины инфицированных и неинфицированных подножки с помощью калипера, и рассчитать разницу в толщине между двумя footpads для оценки прогрессирования поражения. Добавить один миллилитр про-средних в стеклянной ткани шлифовальной трубки на поражение и взвесить трубку. Спрей 70% этанола на подножку для дезинфекции и акциз ноги животного на пятку, чтобы извлечь инфицированные подножки.Убедитесь, что ножницы и типсы стерилизованы, сохраняя их пропитанной 70% этанола. Поместите подножье в стерильную чашку Петри и рассекаете ее типсами и скальпелем. Соберите все мягкие ткани и отбросьте кости.Перенесите собранные ткани в стеклянную трубку шлифовальной машины и взвесите трубку снова, чтобы определить вес поражения. Гомогенизировать ткани 10 раз с мясорубки для полного разрушения тканей, и позволить смеси урегулирования. Соберите 20 микролитров супернатанта и загрузите его в первую колонну и первую полосу 96-й плиты, подготовленной в соответствии с рукописными указаниями.Повторите этот шаг для следующих трех полос, чтобы иметь четырехкратные результаты для каждого животного. Гомогенизировать каждую колодец 10 раз с помощью многоканальной пипетки и перенести 20 микролитров разбавленного образца из первой во вторую колонну. Продолжайте серийное разбавление до тех пор, пока не будет достигнута последняя колонка, и отбросьте последние 20 микролитров разбавленного образца.Печать пластины с пленкой, и инкубировать его при 25 градусов по Цельсию в течение семи дней во влажной камере. После инкубации проанализируйте пластину под перевернутым микроскопом, чтобы определить последний паразитсодержащих хорошо для каждой полосы. Простейшие паразиты Лейшмании существуют в двух формах развития в течение их жизненного цикла у беспозвоночных и позвоночных хозяев: промастиготов и амастиготов.Axenic условия могут имитировать различные среды хозяина в пробирке, поддержание морфологии паразита и жизнеспособности. Топорные условия для амастиготов имитируют кислую среду и повышенную температуру позвоночных хозяев. Promastigotes будет дифференцироваться в амастиготы в этих условиях.При переводе в нейтральный рН и инкубации при 25 градусах по Цельсию топорные амистиготы превращаются обратно в промастиготы. Вирулентность разница дикого типа и Лейшмания железа Регулятор 1 нокаут штаммов наблюдалось на инфицированных мышей подножки. LIR1 регулирует внутриклеточный уровень железа в Лейшмании, о посредничестве экспорта железа и предотвращении его внутриклеточного накопления до токсичных уровней.Инфекция анализ, который включает в себя разницу в отек и прогрессирование поражения показали, что LIR1 имеет важное значение для L.amazonensis in vivo вирулентности. Паразитная нагрузка была определена путем выполнения ограничивающих анализ разбавления от инфицированных поражений. Поражения LIR1 нокаут инфицированных мышей содержат от 10 до шести раз меньше паразитов, чем у диких типа Leishmania инфицированных мышей, показывая, что отсутствие LIR1 предотвращает внутриклеточную репликацию аматтиготов.Одна из самых важных вещей, чтобы помнить, когда вы выполняете эту процедуру заключается в использовании лейшмании культур, которые были проходные в пробирке менее десяти раз, чтобы избежать потери паразита вирулентности. В дополнение к этой процедуре, вы можете использовать в пробирке инфекции анализы. Однако, это ограниченный метод, потому что он не обеспечивает системный физиологический обзор взаимодействия хозяина-паразита.Этот метод in vivo является наилучшим подходом для оценки системных реакций на кокеноз лейшманиоз, таких как количественная оценка биомаркеров сыворотки в восстановленных тканях хозяина для дальнейших иммунологических исследований.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

В естественных изображений трансгенных Паразиты Leishmania в реальный хост

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³HV68 Infection in Mice

Измерение γHV68 инфекции у мышей

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Использование искусственного среднего мокроты для тестирования антибиотиков эффективность против<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; В условиях более актуальными для кистозного фиброза легких

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Анализ паразитов спасению и преобразованию Antileishmanial для скрининга против внутриклеточных<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes в THP1 человека Острые линии моноцитов клеточной лейкемии

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

Использование ротоглотки интратрахеального PAMP администрации и бронхоальвеолярного лаважа для оценки иммунного ответа хозяина у мышей

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Применяя INDUCIBLE системы экспрессии для изучения помех бактериальных факторов вирулентности с внутриклеточной сигнализации

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Количественная оценка внутриклеточных роста внутри макрофагов является быстрый и надежный метод оценки вирулентности лейшмании паразитов

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Оценки вирулентности и патогенез Aeromonas инфекции в Caenorhabditis elegans модели

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

Точное картирование мозга для выполнения повторяющихся In Vivo Изображения нейро-иммунной динамики у мышей

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...