Name: in vivo infection with leishmania amazonensis to evaluate parasite virulence in mice
Uploaded: 2020-02-20T13:00:00
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Nos gustaría dar las gracias a la Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Cámara del Centro Animal del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Sao Paulo por el apoyo y a la Dra. Silvia Reni Uliana por proporcionar la trituradora de tejido de vidrio. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Investigación Sao Paulo (FAPESP - Beca MFLS' 2017/23933-3).

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Biociencia de la Universidad de Sao Paulo (CEUA 342/2019), y se llevaron a cabo de conformidad con las recomendaciones y políticas para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Estado de Sao Paulo (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) y el gobierno brasileño (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Todos los pasos descritos en las secciones 1-5 deben llevarse a cabo asépticamente dentro de armarios d...

El ensayo de infección in vivo descrito en este protocolo permite a cualquier investigador evaluar la leishmaniasis cutánea in vivo teniendo en cuenta la interacción huésped-parásito en un escenario sistémico. Estos ensayos han sido utilizados por muchos grupos22,24,27,29,31,32,34,<sup...

Las leishmaniases son enfermedades infecciosas parasitarias prevalentes en todo el mundo que representan importantes desafíos en los países en desarrollo y son reconocidas como una de las enfermedades tropicales desatendidas más importantes por la Organización Mundial de la Salud1,2. Las leishmaniasas se caracterizan por manifestaciones cutáneas, mucosas y/o viscerales. La leishmaniasis cutánea suele ser causada por L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica y L. aethiopica3. Esta forma de la enfermedad es a menudo la autorreparación en los seres humanos debido a la inducción de la respuesta inmune celular protectora. Sin embargo, la respuesta inmune celular puede fallar, y la enfermedad puede progresar a leishmaniasis cutánea diseminada4,5. No hay vacuna disponible debido a la diversidad entre las especies de Leishmania y a los antecedentes genéticos del huésped6,7. Las opciones de tratamiento también son limitadas, ya que la mayoría de los medicamentos disponibles actualmente son caros, tóxicos y/o pueden requerir tratamiento a largo plazo8,9. Además, ha habido informes de resistencia a los medicamentos contra los tratamientos disponibles10,11.
El agente causal de las leishmaniases es el parásito protozoario Leishmania. El parásito presenta dos formas morfológicas distintas en su ciclo de vida: los promastigotes, la forma flagelada que se encuentra en las moscas de arena; y amastigotes, la forma intracelular que se encuentra en las vacuolas parasitopóforas de los macrófagos huésped de mamíferos12,13. La capacidad de Amastigotes para invadir, sobrevivir y replicarse a pesar de los mecanismos de defensa de los macrófagos del huésped vertebrado están sujetos a muchos estudios14,15,16,17. En consecuencia, varios grupos de investigación han estado describiendo ensayos de infección por macrófagos in vitro para evaluar el impacto de factores ambientales específicos, así como genes parásitos y de acogida en la infectividad del parásito. Este ensayo presenta varias ventajas, como la capacidad de adaptar los estudios a un formato de alto rendimiento, un período de tiempo relativamente más corto para obtener resultados y un número reducido de animales de laboratorio sacrificados18. Sin embargo, los resultados de los ensayos in vitro son limitados porque no siempre replican los estudios in vivo14,19,20,21. Los ensayos in vivo proporcionan una visión fisiológica sistémica de la interacción huésped-parásito, que no puede ser completamente imitada por ensayos in vitro. Por ejemplo, los estudios inmunológicos se pueden realizar a través de ensayos inmunohistoquímicos de secciones de tejido de la almohadilla de pie recogidas o incluso de ganglios linfáticos popliteales para el análisis de las células inmunitarias recuperadas22.
Los animales se utilizan a menudo como modelo para las enfermedades humanas en la investigación biológica y biomédica para comprender mejor los mecanismos fisiológicos subyacentes de las enfermedades23. En el caso de la leishmaniasis, la ruta, el sitio o la dosis de inoculación influyen en el resultado de la enfermedad24,25,26,27. Además, la susceptibilidad y resistencia a la infección en humanos y ratones están altamente reguladas por los antecedentes genéticos del huésped y parásito4,5,22,28,29,30,31. Los ratones BALB/c son altamente susceptibles a la infección cutánea de L. amazonensis, mostrando una rápida progresión de la enfermedad con la diseminación de los parásitos a los ganglios linfáticos, el bazo y el hígado32. Como la enfermedad puede progresar a metástasis cutáneas, la infección puede ser mortal. Por el contrario, los ratones C57BL/6 a menudo desarrollan lesiones crónicas con cargas persistentes de parásitos en los ensayos de infección de L. amazonensis 33. Por lo tanto, la infección por L. amazonensis con esta especie de ratón en particular se ha considerado un excelente modelo para estudiar formas crónicas de leishmaniasis cutánea en humanos, ya que imita mejor la progresión de la enfermedad que la infección de ratones BALB/c modelo5,34.
Por lo tanto, proponemos que la infección murine in vivo es un método útil para los estudios fisiológicos de virulencia de Leishmania aplicables a la enfermedad humana, permitiendo una visión sistémica de la interacción huésped-parásito. Revisitando los ensayos bien establecidos22, presentamos aquí un protocolo paso a paso compilado de la infección in vivo de ratones C57BL/6 con L. amazonensis que comprende la diferenciación del parásito en amastigotes axensicos, inoculación cutánea de la almohadilla de ratones, desarrollo de lesiones y determinación de la carga del parásito. Este protocolo se puede adaptar a otras cepas de ratones y especies de Leishmania que causan leishmaniasis cutáneas. En conclusión, el método presentado aquí es crucial para identificar nuevas dianas y vacunasanti-Leishmania, así como en estudios fisiológicos de las respuestas inmunitarias y metabólicas del huésped a la infección por Leishmania.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner bio-ne</td>
			<td>655180</td>
			<td>A flat-bottom plate for limiting dilution assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8626</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caliper</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>700-118-20</td>
			<td>A caliper to measure the thickness of footpad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353014</td>
			<td>A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>An equipament used for separating samples based on its density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator 34 &#176;C</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td>An incubator for amastigotes differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K50237083820</td>
			<td>A disinfectant for general items</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass tissue grinder tube</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3431 E04</td>
			<td>A tube to collect and disrupt infected footpad tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Synth</td>
			<td>G1008.01.AH</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>A software used to plot the data and calculate statistical significance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-2250</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5303</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator 25 &#176;C</td>
			<td>Fanem</td>
			<td>347CD</td>
			<td>An incubator for promastigotes cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TMS</td>
			<td>An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>An inhalant anesthetics for mice (3-5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laminar flow cabinet</td>
			<td>Veco</td>
			<td>VLFS-09</td>
			<td>A biosafety cabinet used for aseptical work area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 cell culture media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31100-035</td>
			<td>A cell culture media for Leishmania cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td>A microtube used for sample collection, processing and storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichanel pipette</td>
			<td>Labsystems</td>
			<td>F61978</td>
			<td>A multichannel pipette used for limiting dilution assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6329</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>HBG</td>
			<td>2266</td>
			<td>A hemocytometer to count the parasite suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200</td>
			<td>An optical equipament used to count parasite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>349</td>
			<td>A flexible and resistant plastic to seal the plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>A sterile dish to dissect the footpad tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipetman kit</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167360</td>
			<td>A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Quimis</td>
			<td>BG2000</td>
			<td>An equipament used to weigh collected footpad lesions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>Solidor</td>
			<td>10237580026</td>
			<td>A scalpel to cut and collect footpad tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological pipette 10 mL</td>
			<td>Nest</td>
			<td>327001</td>
			<td>A sterile pipette used for transfering mililiter volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td></td>
			<td>A pipette tip used for transfering microliter volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>A dye used to count viable parasites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypticase peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Supplement added to M199 cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305945</td>
			<td>A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo infection with leishmania amazonensis to evaluate parasite virulence in mice

Leishmania spp. son parásitos protozoarios que causan leishmaniasas, enfermedades que presentan un amplio espectro de manifestaciones clínicas desde lesiones cutáneas hasta lesiones viscerales. Actualmente, se estima que 12 millones de personas están infectadas con Leishmania en todo el mundo y más de 1.000 millones de personas viven a riesgo de infección. La leishmania amazonensis es endémica en América Central y del Sur y generalmente conduce a la forma cutánea de la enfermedad, que se puede visualizar directamente en un modelo animal. Por lo tanto, las cepas de L. amazonensis son buenos modelos para estudios de leishmaniasis cutánea porque también se cultivan fácilmente in vitro. Los ratones C57BL/6 imitan la progresión de la enfermedad impulsada por L. amazonensisobservada en humanos y son considerados uno de los mejores modelos de cepas de ratones para la leishmaniasis cutánea. En el huésped vertebrado, estos parásitos habitan macrófagos a pesar de los mecanismos de defensa de estas células. Varios estudios utilizan ensayos de infección por macrófagos in vitro para evaluar la infectividad del parásito en diferentes condiciones. Sin embargo, el enfoque in vitro se limita a un sistema celular aislado que no tiene en cuenta la respuesta del organismo. Aquí, compilamos un método de infección murino in vivo que proporciona una visión fisiológica sistémica de la interacción huésped-parásito. El protocolo detallado para la infección in vivo de ratones C57BL/6 con L. amazonensis comprende la diferenciación de parásitos en amastígolos infecciosos, la inoculación cutánea de la almohadilla de ratones, el desarrollo de lesiones y la determinación de la carga del parásito. Proponemos este método bien establecido como el método más adecuado para los estudios fisiológicos de las respuestas inmunitarias y metabólicas del huésped a la leishmaniasis cutánea.

Los parásitos protozoos de leishmania existen en dos formas de desarrollo durante su ciclo de vida en huéspedes de invertebrados y vertebrados: promastigotes, las formas proliferativas que se encuentran en el lumen de la mosca de la arena femenina; y amastigotes, las formas proliferativas que se encuentran en las vacuolas parasitopóforas de las células huésped de los mamíferos. Los promastigotes tienen un cuerpo alargado de aproximadamente 1,5 m de ancho y 20 m de largo, co...

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In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Aquí, presentamos un protocolo compilado para evaluar la infección cutánea de ratones con Leishmania amazonensis. Este es un método confiable para estudiar la virulencia del parásito, permitiendo una visión sistémica de la respuesta del huésped vertebrado a la infección.

In Vivo infección con Leishmania amazonensis para evaluar la virulencia del parásito en ratones

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...

Este protocolo es adecuado para el estudio de la virulencia de Leishmania, ya que proporciona una visión sistémica del huésped de los vertebrados a la infección cutánea. La principal ventaja de adoptar este protocolo es que permite a los investigadores evaluar simultáneamente la respuesta inflamatoria del huésped y la replicación del parásito. Este método se puede utilizar para caracterizar varios objetivos y tratamientos relacionados con la virulencia, lo que podría aportar nuevos conocimientos sobre el control de la leishmaniasis cutánea.También se puede aplicar a otras cepas de ratones y especies de Leishmania que causan leishmaniasis cutánea. Este ensayo tiene algunos pasos críticos, como requerir personal capacitado que se sienta cómodo trabajando con ratones y tenga experiencia en la realización de inyecciones subplantares para evitar la exposición accidental a material infeccioso. Demostrando el procedimiento estará el Dr. Ricardo Zampieri, un técnico de mi laboratorio.Comience por el cultivo de promastigotes L.amazonensis en un matraz de cultivo celular cuadrado de 25 centímetros, que contiene 10 mililitros de pro-medio, durante tres días a 25 grados celsius. Después de la incubación, pipetear cinco mililitros de cultivo promastigoto de fase de crecimiento logarítmico en un nuevo matraz. Añadir cinco mililitros de ama-medio al matraz, e incubarlo a 34 grados centígrados durante tres a cuatro días.Dividir el cultivo diluyéndolo en una proporción de uno a tres con ama-medio fresco en un nuevo matraz. Luego incubar durante otros tres a cinco días. Transfiera una alícuota de la suspensión de amastigonos especrénicos diluidos en PBS a una cámara Neubauer y cuente los parásitos no flagelados.A continuación, diluir la suspensión en PBS de acuerdo con la dosis de inóculo deseada y el número de inóculos previstos. Cargue una jeringa de tuberculina con una aguja de calibre 27 con la suspensión del parásito preparada. Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado con un pellizco del dedo del pie e inocular 50 microlitros de la suspensión en el tejido subplantar en el reposapiés trasero izquierdo.Registre la progresión de la lesión una vez a la semana, midiendo el grosor de las almohadillas infectadas y no infectadas utilizando una pinza, y calcule la diferencia de espesor entre las dos almohadillas para evaluar la progresión de la lesión. Añadir un mililitro de pro-medio en un tubo de molienda de tejido de vidrio por lesión y pesar el tubo. Rocíe 70% de etanol en la almohadilla para la desinfección e excite el pie del animal en su talón para extraer la almohadilla de pie infectada.Asegúrese de que las tijeras y fórceps estén esterilizados manteniéndolos empapados en 70% de etanol. Coloque el reposapiés en un plato estéril de Petri y disectándolo con los fórceps y el bisturí. Recoger todo el tejido blando y desechar los huesos.Transfiera los tejidos recogidos al tubo de molienda de tejido de vidrio y cargue el tubo de nuevo para determinar el peso de la lesión. Homogeneizar el tejido 10 veces con la amoladora para una interrupción completa del tejido, y permitir que la mezcla se atase. Recoger 20 microlitros del sobrenadante y cargarlo en la primera columna y primer carril de la placa de 96 pozos, preparado de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.Repita este paso para que los siguientes tres carriles tengan resultados cuadrúplicados para cada animal. Homogeneizar cada pozo 10 veces con una pipeta multicanal, y transferir 20 microlitros de la muestra diluida de la primera a la segunda columna. Continúe la dilución en serie hasta que se alcance la última columna y deseche los 20 microlitros finales de la muestra diluida.Selle la placa con película e i incuba a 25 grados centígrados durante siete días en una cámara húmeda. Después de la incubación, analice la placa bajo un microscopio invertido para determinar el último pozo que contiene parásitos para cada carril. Los parásitos protozoarios de leishmania existen en dos formas de desarrollo durante su ciclo de vida en huéspedes invertebrados y vertebrados: promastigotes y amastigotes.Las condiciones esxenicas pueden simular diferentes ambientes de host in vitro, manteniendo la morfología y viabilidad del parásito. Las condiciones esxenicas para los amastigoados imitan el ambiente ácido y el aumento de la temperatura de los huéspedes vertebrados. Los promastigotes se diferenciarán en amastigotes en estas condiciones.Cuando se transfieren a pH neutro y se incuban a 25 grados centígrados, los amastigotes esxenicos se transforman de nuevo en promastigotes. La diferencia de virulencia de tipo salvaje y leishmania Iron Regulator 1 knockout cepas se observó en las almohadillas de ratón infectados. LIR1 regula los niveles de hierro intracelular en Leishmania, mediando la exportación de hierro y evitando su acumulación intracelular a niveles tóxicos.El ensayo de infección que incluye la diferencia en la hinchazón y la progresión de la lesión reveló que LIR1 es esencial para la virulencia in vivo de L.amazonensis. La carga del parásito se determinó mediante la realización de un ensayo de dilución limitante a partir de las lesiones infectadas. Las lesiones de los ratones infectados por nocaut LIR1 contienen de 10 a seis parásitos menos que las de los ratones infectados de tipo salvaje Leishmania, revelando que la ausencia de LIR1 previene la replicación intracelular de los amastigotes.Una de las cosas más importantes a recordar cuando usted está realizando este procedimiento es utilizar culturas de Leishmania que fueron alabadas in vitro menos de diez veces para evitar la pérdida de virulencia del parásito. Además de este procedimiento, podría utilizar ensayos de infección in vitro. Sin embargo, este es un método limitado, porque no proporciona una visión fisiológica sistémica de la interacción huésped-parásito.Este método in vivo es el mejor enfoque para evaluar las respuestas sistémicas para la leishmaniasis cutánea, como la cuantificación de biomarcadores séricos en los tejidos huésped recuperados para estudios inmunológicos adicionales.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

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Investigación

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